曹涵文，吳瓏韜，甘乾福，鮑若虹，梁學武

（福建農(nóng)林大學 動 物科學學院，福建 福 州350002）

纖維素是自然界中廣泛存在的一類結(jié)構(gòu)性碳水化合物，每年通過陸生及海洋藻類的光合作用，可產(chǎn)生0.85×1011t纖維素，相當于世界總能值消耗的四倍［1］，是地球上蘊藏最為豐富的可再生資源之一。纖維素是植物細胞壁的主要成分，由D-葡萄糖以β-1，4糖苷鍵組成的鏈狀高分子化合物。在纖維素中不僅存在著分子內(nèi)氫鍵還存在著分子間氫鍵，在秸稈中纖維被半纖維素和木質(zhì)素包裹并且通過結(jié)晶結(jié)構(gòu)與之相連，從而導(dǎo)致纖維素的水解與糖化受到顯著的抑制作用。影響纖維素水解的因素還包括原材料的多孔性、纖維的結(jié)晶度、木質(zhì)素以及半纖維素含量［2］。植物纖維水解為可溶性糖依賴于復(fù)雜纖維素酶的協(xié)同作用［3］。當今，隨著全球能源與糧食資源的大量消耗，人們迫切的希望找到一種將纖維素加以利用的新方法。

大熊貓雖為肉食動物，但其食物多以竹筍和竹葉為主，平均每只成年大熊貓每日進食竹子量可達12.5 kg。大熊貓除消化竹子中90%以上的蛋白質(zhì)和脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)外，還能利用8%的纖維素和27%的半纖維素［4］。黃河等［5］報道，大熊貓以竹子葉為食時，對粗蛋白、粗脂肪和半纖維素的消化率分別為61.5%、50.3%和23.3%；而當以竹筍為食時，消化率分別達71.9%、61.5%和29.6%，大熊貓對竹筍中營養(yǎng)物質(zhì)的利用率高于竹葉。大熊貓雖然有著草食性哺乳動物進食特點，卻擁有典型的肉食性哺乳動物的消化系統(tǒng)。2010年大熊貓的基因組序列公布［6］，從其基因組序列中可以找到編碼與肉食性動物消化系統(tǒng)相關(guān)酶的基因，但編碼纖維素酶的相關(guān)基因卻并沒有被發(fā)現(xiàn)，因此大熊貓對纖維素的消化必然要依賴腸道菌群的作用。孫飛龍等［7］研究了不同時期大熊貓腸道的菌群種類及分布，證明了熊貓腸道內(nèi)纖維素的利用依靠菌群的協(xié)作。本試驗對大熊貓糞便中的纖維降解菌進行分離鑒定，和對產(chǎn)酶特性進行研究，探索熊貓腸道內(nèi)能夠高效利用纖維素的菌株，為實現(xiàn)高纖維類資源飼料化提供支撐［8］。

1 材料與方法

1.1 樣品的采集

大熊貓糞便采集于福州動物園，采集時去除表面雜質(zhì)，裝入自封袋中并編號，取樣是在滅菌的超凈工作臺中進行，將糞樣用滅菌的刀片剖開，于中心位置取樣，剩余糞樣-20℃保存。

1.2 纖維素降解菌的培養(yǎng)及篩選

纖維素降解菌的培養(yǎng)利用了察克貝氏培養(yǎng)基［9］，羧甲基纖維素（CMC）作為唯一碳源。其主要成分包括羧甲基纖維素10 g；MgSO4·7 H2O 0.2 g；K2HPO41 g；NH4NO31 g；FeCl3·6 H2O 0.05 g；CaCl20.02 g。將糞樣加入到液體培養(yǎng)基中恒溫震蕩培養(yǎng)3 d，將菌液稀釋到10-6、10-7、10-8并涂布到平板上，25℃倒置培養(yǎng)3 d。取純化后的菌液20μL滴加到培養(yǎng)基中，待菌落長出后，用剛果紅染色1 h，然后用1 mol／L的無菌生理鹽水浸泡1 h，根據(jù)菌落產(chǎn)生透明水解圈直徑大小，評定菌株的產(chǎn)酶能力。

1.3 酶活性檢測

以葡萄糖的濃度為縱坐標，對應(yīng)的吸光度為橫坐標，繪制葡萄糖標準曲線用于后續(xù)酶活性的測定。將發(fā)酵液于8 000 r·min-1、4℃條件下離心20 min所得到的上清液即為粗酶液。測定羧甲基纖維素酶（CMCase）活性、濾紙酶（FPase）活性，分別利用羧甲基纖維素和中性濾紙作為底物進行培養(yǎng)，采用3，5-二硝基水楊酸顯色法［10］測定。酶促反應(yīng)在25℃，p H為7.0的條件下進行。酶活性單位（U）定義為：在p H為7.0溫度為25℃的條件下，每分鐘產(chǎn)生相當于1μmol葡萄糖的還原糖所需的酶量為1個酶活性單位。將初篩得到的27株菌株接種至20 m L的試管中制成菌懸液，然后接種到液體培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，25℃，150 r／min培養(yǎng)3 d后測定發(fā)酵液的酶活。

1.4 菌落及細胞形態(tài)學觀察

形態(tài)學觀察包括細胞形態(tài)鑒定和菌落形態(tài)鑒定兩類，菌落形態(tài)鑒定主要是了解菌落大小、形態(tài)、顏色、光澤度、透明度、質(zhì)地、隆起形狀、邊緣特等。細胞的形態(tài)鑒定主要是通過革蘭氏染色［11］，借助顯微鏡對細胞的 大小、結(jié)構(gòu)、排列方式以及芽孢、鞭毛、細胞膜等進行觀察［12］。

1.5 菌株的生理生化試驗

細菌生理生化測定參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》［13］的有關(guān)方法進行測定。主要包括糖醇的發(fā)酵實驗、淀粉的水解實驗、V～P試驗、甲基紅試驗、明膠（Gelatin）液化試驗、氧化酶試驗、過氧化氫酶試驗（接觸酶試驗）、硝酸鹽還原反應(yīng)、p H生長測定等［14］。

1.6 16S r DNA序列分析

采用試劑盒法提取菌液中菌株的DNA，利用微生 物 16S r DNA 通 用 引 物 27F（5＇-AGAGTT TGATCATGGCTC AG-3＇）、1492R（5＇-TAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3＇）［15］對 其 16S r DNA序列進行擴增，PCR產(chǎn)物回收純化后與p MD19-T相連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Ecoli JM 109感受態(tài)細胞。挑取轉(zhuǎn)化子并提取質(zhì)粒后PCR驗證［16］，經(jīng)驗證確定轉(zhuǎn)入外源細菌16S r DNA片段的單菌落，最后將轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒送至上海英駿生物技術(shù)有限公司測序，將測序結(jié)果與GeneBank中已有序列進行比對。用NCBI建立系統(tǒng)發(fā)育樹，確定所選菌株的種屬［17］。

1.7 菌株的產(chǎn)酶條件研究

取適量的菌液及液體培養(yǎng)基置于250 m L錐形瓶中進行液體發(fā)酵，在培養(yǎng)溫度、初始p H、接種量以及裝液量不變的條件下，設(shè)置不同的培養(yǎng)時間作為梯度，通過測得菌液的CMCase活性大小，得出最佳的培養(yǎng)時間。同樣的方法可以得出，在單因素中達到最大酶活性時所需的培養(yǎng)溫度、p H、接種量以及裝液量［18］。

利用CCD中心組合，判斷產(chǎn)酶條件的單因素之間有無交互作用，如表1所示。實驗設(shè)計基于二階數(shù)學模型：

Y為響應(yīng)值，β0為常數(shù)項βI、βIJ、βII為回歸系數(shù)xI、xJ為編碼后的變量（培養(yǎng)時間、裝液量、接種量、p H、溫度）。

Y（酶活性）＝20.89＋5.050×10-3＊A＋0.010＊B-0.017＊ C＋1.248×10-3＊ D＋0.039＊ E＋9.426×10-5＊ A ＊B-1.596×10-3＊ A ＊ C-0.010＊ A ＊ D-5.531×10-3＊ A ＊ E-0.013＊B＊ C-0.014＊ B＊ D-8.721×10-3＊ B＊ E-0.019＊ C＊ D＋0.018＊ C＊ E-4.998×10-3＊ D＊E-1.790×10-3＊ A2＋0.045＊B2＋0.064＊ C2-0.48＊ D2-0.30＊ E2

A為培養(yǎng)時間，B為裝液量，C為接種量，D為p H，E為溫度。

表1 CCD實驗設(shè)計中變量的編碼和水平表Table 1 Encoding and level of variance in CCD experiment

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素降解菌的篩選結(jié)果

從初篩的菌落中選取大而明顯37株菌落，純化后接種于平板上，通過剛果紅染色及1 mol／L的NaCl浸泡，發(fā)現(xiàn)有27株具有明顯的透明圈。

2.2 CMCase和FPAase酶活性測定結(jié)果

2.2.1 葡萄糖標準曲線的繪制

圖1 染色的水解圈Fig.1 Hydrolysis circle of dyeing

2.2.2 酶活性的測定 羧甲基纖維素酶（CMCase）活性、濾紙酶（FPase）活性結(jié)果如表2所示。

結(jié)果表明，初篩所得到的菌株，能夠在以羧甲基纖維素為碳源的平板上產(chǎn)生透明圈，但一部分菌株不能很好的利用纖維素這種天然物質(zhì)。根據(jù)CMCase和FPAase活力，選出生長旺盛，產(chǎn)酶能力較強的3號菌株并對其進行傳代培養(yǎng)。菌株經(jīng)過多次的傳代培養(yǎng)，其產(chǎn)酶能力依然穩(wěn)定，沒有呈現(xiàn)出退化跡象，如表3所示。

圖2 葡萄糖標準曲線Fig.2 Standard curve of glucose

2.3 菌株的形態(tài)學觀察

在羧甲基纖維素鈉平板25℃培養(yǎng)72 h，該菌株菌落圓形，直徑0.25μm～0.4μm，乳白色，邊緣齊整，呈液滴狀、表面光滑，中凸，無光澤。革蘭氏染色結(jié)果為陰性，直的桿菌。如圖3所示。

表2 菌株的復(fù)篩Table 2 Re-screening of bacterial strains

表3 菌株的傳代培養(yǎng)Table 3 Subculture of the strain

2.4 菌株的生理生化試驗

NC020209菌株革蘭氏染色鑒定為陰性，好氧，有機化能異養(yǎng)。生長溫度范圍5～40℃，最適生長溫度為25～30℃。在p H為4.0～8.0的范圍內(nèi)均能生長，最適p H為6.0。在培養(yǎng)基上長勢良好，根據(jù)該菌株對不同碳源和氮源的利用情況，對菌株進行鑒定。由表4可知菌株利用葡萄糖不產(chǎn)氣，可以利用麥芽糖、尿素、甘露糖、蔗糖、蕈糖、果糖，不能同化阿拉伯糖、甘油、棉籽糖、山梨糖、木糖、D-核糖、鼠李糖、木糖、乳糖、枸櫞酸鹽。靛基質(zhì)試驗、硫化氫、VP、葡萄糖酸鹽試驗均為陰性，能夠?qū)⒚髂z液化單不能將淀粉水解，甲基紅試驗、氧化酶、接觸酶試驗均為陽性，初步鑒定該菌株為假單胞菌。

圖3 菌株的形態(tài)學觀察Fig.3 Morphological observation of the strain

表4 菌株NC020209的生理生化特性Table 4 Physiological-biochemical characteristic of the NC020209

2.5 16S r DNA測序與分析

該菌株通過PCR擴增16S r DNA片段的長度約為1 500 bp，選取親緣關(guān)系最近的24個菌株序列進行比較。由圖4可知，該菌株與Pseudomonas poae RE＊1-1-14的同源性為99%，利用臨近序列分析法構(gòu)建了菌株遺傳進化樹。由此判斷該菌屬于革蘭氏陰性好氧假單胞菌。

2.6.1 培養(yǎng)時間對產(chǎn)酶的影響 NC020209菌株在培養(yǎng)18 h進入對數(shù)生長期，培養(yǎng)至36 h達到最大值，這個階段中菌株產(chǎn)生了大量的纖維素酶和濾紙酶等胞外酶，由圖5可知，最佳培養(yǎng)時間為36 h。

2.6.2 培養(yǎng)溫度對產(chǎn)酶的影響 溫度對NC020209菌株的產(chǎn)酶能力有較大的影響。從圖6可知該菌株的產(chǎn)酶溫度范圍很廣，從10℃至25℃期間，其酶活性不斷的增加，25℃達到最大值，該菌株的最佳培養(yǎng)溫度為25℃。

2.6.3 p H值對產(chǎn)酶的影響 由圖7可知，初始p H為4.0～5.5，NC020209菌株的產(chǎn)酶效果較好，產(chǎn)酶能力逐步提高。p H為6時產(chǎn)酶效果最好，當p H繼續(xù)增大，該菌株的產(chǎn)酶能力逐步下降并趨于平緩。

2.6.4 接種量對產(chǎn)酶的影響 從圖8分析可知，NC020209菌株接種量在0.5%～3.5%期間，產(chǎn)酶效果較好且趨于平穩(wěn)。接種量在4%達到最高，接種量大于4%則產(chǎn)酶效果急劇降低。

2.6.5 裝液量對產(chǎn)酶的影響 裝液量影響氧氣的溶解速率，進而影響菌株的產(chǎn)酶和生長［19］。由圖9可知，裝液量在10%～30%范圍內(nèi)，NC020209菌株酶活性逐步提升，裝液量為30%，酶活性達到最大值。

2.6.6 CCD中心組合實驗設(shè)計優(yōu)化發(fā)酵條件 圖10顯示了接種量和裝液量位于實驗設(shè)計的中心水平時，對NC020209菌株酶活性影響的等高線圖和響應(yīng)面圖。由圖10可知，接種量為3.8%～4.1%，裝液量為37%～42%時，二者添加量過多或過少均會影響該菌株酶活性的大小。由培養(yǎng)時間與裝液量交互影響得出的等高線圖可以看出，這兩個變量沒有交互影響，說明接種量與裝液量變化能單獨引起該菌株酶活性的變化（P＞0.05）。同理，培養(yǎng)時間、裝液量、接種量、p H、溫度等因素之間也不存在交互作用。

3 討 論

圖4 菌株的系統(tǒng)進化樹Fig.4 Phylogenetic tree of strains

圖5 培養(yǎng)時間對NC020209菌株產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of culture time on CMCCase synthesis of NC020209

圖6 培養(yǎng)溫度對NC020209菌株產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effect of temperature on the CMCcase synthesis of NC020209

圖7 p H對NC020209菌株產(chǎn)酶的影響Fig.5 Effect of p H on the CMCCase synthesis of NC020209

圖8 接種量對NC020209菌株產(chǎn)酶的影響Fig.8 Effect of inoculation amount on the CMCCase synthesis of NC020209

圖9 裝液量對NC020209菌株產(chǎn)酶的影響Fig.9 Effect of broth content on the CMCCase synthesis of NC020209

大熊貓為肉食動物，其對纖維素的消化依賴于腸道菌群的協(xié)同作用。朱立峰等從大熊貓糞便樣本中提取的16Sr RNA序列發(fā)現(xiàn)，大熊貓腸道菌群主要由梭菌綱（Clostridia）和厚壁菌門（Firmicutes）的芽胞桿菌綱（Bacilli）細菌組成［20］。通過測定熊貓腸道宏觀基因組，發(fā)現(xiàn)了纖維素酶和半纖維素酶的編碼基因［21］，該實驗在分子水平上證明了熊貓利用腸道內(nèi)微生物對竹子纖維素和半纖維素加以降解。王海娟［22］報道已發(fā)現(xiàn)的大熊貓腸道菌類共22種，分屬于7個菌門，分別是變形菌門、厚壁菌門、放線菌門、子囊菌門、擬桿菌門、酸桿菌門、藍菌門。

圖10 接種量和裝液量交互影響NC020209菌株酶活性水平的等高線圖及響應(yīng)面圖Fig.10 Contour plots and response surface diagram of the effect of inoculum sizeand loaded liquid on NC020209 enzymatic activity

本實驗從熊貓糞便分離到一株革蘭氏陰性好氧假單胞菌（NC020209菌株）。Zhang［23］等報道，假單胞菌所產(chǎn)生的漆酶，在降解植物細胞壁過程中起重要作用，它能瓦解纖維素的晶體結(jié)構(gòu)，解除木質(zhì)素對半纖維素和纖維素的封閉，從而增加其可及度，提高酶的水解效率。由此可見，正是假單胞菌對纖維類物質(zhì)的“破壁”作用，才使得熊貓腸道內(nèi)后續(xù)的纖維降解過程得以順利進行。采用DNS法測定酶活性及對產(chǎn)酶條件進行研究，培養(yǎng)溫度25℃，初始p H為6.0，接種量4%，裝液量為30%，搖床轉(zhuǎn)速為150 rpm的條件下培養(yǎng)36 h，所測得NC020209菌株酶活為24.362 U。

［1］ Rajoka I M，Malik A K.Cellulase production by Cellulomonas biazotea cultured in media containing different cellulosic substrates［J］.Bioresour Technol，1997，59：21-7.

［2］ Mc Millan J D.Pretreatment of lignocellulosic biomass.In：Himmel M E，BakerJ O，Overend R P，editors.Enzymatic conversion of biomass for fuels production［J］.Washington，DC：American Chemical Society，1994.292-324.

［3］ Romanowska I，Polak J，Bielecki S.Isolation and properties of Aspergillus niger IBT 90 xylanase for bakery［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2006，69：665-671.

［4］ 樊 程，李雙江，李成磊，等.大熊貓腸道纖維素分解菌的分離鑒定及產(chǎn)酶性質(zhì)［J］.微生物學報.2012，52（9）：1 113-1 121.

［5］ 黃 河，張志和，侯 蓉.糞樣在大熊貓研究上的應(yīng)用［J］.動物學雜志.2012，47（6）：156-163.

［6］ Li R Q，F(xiàn)an W，Tian G，et al.The sequence and de novo assembly of the giant panda genome［J］，Nature，2010，463（7279）：311-317.

［7］ 孫飛龍，劉敬賢，席 丹，等.大熊貓腸道疾病致病菌［J］.經(jīng)濟動物學報.2002，6（2）：20-23.

［8］ Ragauskas A J，Williams C K，Davison B H，et al.The path forward for biofuels and biomaterials［J］.Science，2006，311：484-489.

［9］ 付麗麗.作物秸稈纖維素降解菌的分離與篩選［D］.浙江大學，2012：14-15.

［10］ 胡國全，鄧 宇，徐 恒，等.極端嗜熱厭氧纖維素菌的分離、鑒定、系統(tǒng)發(fā)育分析及其酶學性質(zhì)的研究［J］.應(yīng)用與環(huán)境生物學報，2004，10（2）：197-201.

［11］ 孫紀全，黃 星，何 健，等.異丙隆降解菌Y57的分離鑒定及其降解特性［J］.中國環(huán)境科學.2006，26（3）：315-319.

［12］ 周生飛.高效降解棉酚菌種篩選、降解機理及固體發(fā)酵工藝研究［D］.甘肅農(nóng)業(yè)大學，2011：26-28.

［13］ 布坎南R E.伯杰氏細菌鑒定手冊［M］.北京：科學出版社，1988.

［14］ 解林奇.多菌靈降解菌系篩選、組成分析及其降解效果［D］.北京：中國農(nóng)業(yè)科學院，2012：33-37.

［15］ Baker G C，Smith J J，Cowan D A.Reviewandre-analysis of domain-specific 16S primers［J］.Journal of Microbiological Methods，2003，55（3）：541-555.

［16］ 呂莉華.瘤胃纖維素降解菌Real-Time PCR熒光定量方法的建立及其初步應(yīng)用［D］.呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學，2007：16-18.

［17］ 孫一博.高效纖維素降解菌的篩選鑒定及特性研究［D］.哈爾繽：東北農(nóng)業(yè)大學，2013：24-29.

［18］ 張曉輝，郭春華，江曉霞.飼用木聚糖酶生產(chǎn)菌株的篩選及部分酶學性質(zhì)的研究［J］.獸藥與飼料添加劑，2007，12（2）：4-6.

［19］ 郭 勇.酶工程［M］.北京：中國輕工業(yè)出版社，1994：42-43.

［20］ Teather R M，Wood P J.Use of Congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen［J］.Applied and Environmental Microbiology，1982，43（4）：777.

［21］ 吳 華，詹祥江，張保衛(wèi)，等.大熊貓微衛(wèi)星位點的篩選與鑒定［A］.野生動物生態(tài)與資源保護第三屆全國學術(shù)研討會論文摘要集［C］.2006.

［22］ 王海娟，潘 渠.大熊貓腸道正常菌群降解纖維素的機制［J］.中國微生態(tài)學雜志.2014，26（2）：225-228.

［23］ Zhang X，Xu C，Wang H.Pretreatment of bambooresidues with Coriolus versicolor for enzymatic hydrolysis［J］.J Biosci Bioeng，2007，104（2）：149-151.