王永奇，白 康，任戰(zhàn)軍＊，劉文華，李斐然，黎 勇，朱承嗣，唐 婕，唐青山，王方榮

（1.陜西省動(dòng)物研究所，陜西 西 安7100321；2.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng) 物科技學(xué)院，陜西 楊 凌712100；3.陜西鎮(zhèn)坪逢春林麝養(yǎng)殖有限公司，陜西 鎮(zhèn) 坪725600）

我國(guó)是麝資源分布最廣泛的國(guó)家之一，其中，四川與陜西的林麝資源較為豐富。中國(guó)境內(nèi)能分泌麝香的麝現(xiàn)有6種，林麝、馬麝、原麝、黑麝、喜馬拉雅麝、安徽麝。林麝（Moschus berezovskii）是分布范圍最廣的品種，體型最小，有4個(gè)亞種，分別為指名亞種、越北亞種、云貴亞種、滇北亞種。其中分布于秦嶺的林麝屬于指名亞種。雄性林麝的鼠蹊部有麝香腺，能分泌麝香。麝香是配制高級(jí)香水、高級(jí)香料的重要原料，具有極高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值、藥用價(jià)值和學(xué)術(shù)研究?jī)r(jià)值。近代科學(xué)研究及臨床醫(yī)學(xué)證明麝香對(duì)于治療東亞國(guó)家尤其是中國(guó)的很多疾病具有一定的藥理作用，其藥用功效在中國(guó)幾千年的中醫(yī)學(xué)中被廣泛應(yīng)用。由于人類(lèi)對(duì)森林過(guò)度砍伐，林麝棲息地急劇縮小，這無(wú)疑對(duì)林麝的生存造成巨大威脅，加之人們對(duì)麝香的需求不斷加大，林麝瀕臨滅絕或在一些地方已經(jīng)滅絕。據(jù)估計(jì)，20世紀(jì)60年代末，全國(guó)總量超過(guò)1百萬(wàn)只。1978-1980年，林麝資源量卻不足60萬(wàn)只。1980年以后，由于麝香價(jià)格不斷攀升，而且人類(lèi)過(guò)度捕獲，導(dǎo)致其數(shù)量急劇下降，至20世紀(jì)90年代末估計(jì)已減少至20～30萬(wàn)只，據(jù)估計(jì)90年代初全國(guó)只有10～20萬(wàn)只。由于天然麝香供應(yīng)量不足，以致我國(guó)的中醫(yī)藥和化妝品行業(yè)遭受到巨大的打擊。因此我國(guó)已于2002年將麝從國(guó)家二級(jí)重點(diǎn)保護(hù)動(dòng)物上調(diào)為國(guó)家一級(jí)重點(diǎn)保護(hù)動(dòng)物。人工養(yǎng)殖是珍稀動(dòng)物保護(hù)重要方式之一，我國(guó)20世紀(jì)50年代開(kāi)始人工養(yǎng)麝研究?，F(xiàn)已在人工飼養(yǎng)、繁育、取香和疾病防治等方面取得了顯著成績(jī)。但是，人工養(yǎng)殖要取得更大成功，必須在基礎(chǔ)研究方面有所加強(qiáng)［1-2］。

香囊為公麝獨(dú)有的器官，其腹側(cè)面有前后兩個(gè)開(kāi)口，前面的開(kāi)口稱(chēng)之為香囊口，可排出香囊內(nèi)腺體的分泌物［3］。香囊位于腹下部陰囊與臍部之間，呈橢圓形的囊狀物，其分泌物的氣味能夠吸引異性。泌香是雄性林麝的第二性征，與其生殖器官以及雄激素的分泌有著密切的關(guān)系［4］。試驗(yàn)證明在切除睪丸以及副睪后，林麝將不再產(chǎn)生生殖反應(yīng)的，也就不再有泌香反應(yīng)，不能形成成熟的麝香。當(dāng)給其注射適量的外源性雄激素（丙酸睪丸酮，腦垂體促黃體素和下丘腦促黃體素釋放素等）后，林麝又會(huì)出現(xiàn)泌香反應(yīng)并能生成成熟的麝香，而且利用外源性雄激素誘導(dǎo)生香的技術(shù)并不影響雄麝泌香量［5-9］。激素調(diào)節(jié)林麝泌香的途徑如下：丘腦下部→LRH→垂體前葉→LH、FSH→睪丸間質(zhì)細(xì)胞→雄性激素→麝香腺→分泌香液→麝香內(nèi)轉(zhuǎn)化→麝香［10］。綜上所述，雄性激素能誘導(dǎo)林麝泌香。雄性激素受體外顯子序列的變化可能會(huì)影響其與配體結(jié)合，從而可能影響到麝香的質(zhì)量。

雄激素受體基因是類(lèi)固醇激素受體家族成員之一。研究發(fā)現(xiàn)，人類(lèi)的雄激素受體基因是在X染色體上（Xq11.2-12），是由8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子組成［11］，一般由4個(gè)結(jié)構(gòu)域組成：（1）NH2端-轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)AF-1（Exon1），可與激活物或阻遏物結(jié)合從而對(duì)AR進(jìn)行調(diào)控；（2）DNA結(jié)合區(qū) DBD（Exon2、Exon3），受體的DBD區(qū)可識(shí)別并結(jié)合靶基因上激素反應(yīng)元件，從而誘發(fā)靶基因的有效轉(zhuǎn)錄；（3）鉸鏈區(qū)（HR）；（4）配體結(jié)合區(qū)（LBD）、AF-2，主要決定受體結(jié)合配體的特異性。受體N末端氨基酸組成和長(zhǎng)度差異較大，然而DNA結(jié)合區(qū)和配體結(jié)合區(qū)的序列相對(duì)保守。AR基因編碼的雄性激素受體（androgen receptor，AR）一種配體依賴(lài)型的反式轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白，屬于核受體超家族成員，與特異的DNA的序列結(jié)合，通過(guò)介導(dǎo)雄激素的作用可調(diào)控多種基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)［11-15］。而配體結(jié)合區(qū)是雄激素特異結(jié)合的區(qū)域，可以介導(dǎo)雄性激素在靶細(xì)胞中發(fā)揮作用，大量研究結(jié)果表明，只有雄激素和雄激素受體結(jié)合才能發(fā)揮重要的、廣泛的生理功能。大量試驗(yàn)證實(shí)：AR基因外顯子多態(tài)性可能在AR活性強(qiáng)弱的平衡中發(fā)揮“微調(diào)”作用，與人類(lèi)多種疾病的發(fā)生有關(guān)聯(lián)，如男性不育、前列腺癌、子宮肌瘤、乳腺癌等［16-17］；與動(dòng)物生產(chǎn)性能存在相關(guān)性，例如豬雄性激素受體多態(tài)性對(duì)產(chǎn)仔數(shù)有影響［18］。除此之外，麝的泌香與雄性生殖器官及其雄激素分泌的相關(guān)研究鮮有報(bào)道。

本研究擬采用PCR、單鏈構(gòu)象多態(tài)性技術(shù)，研究雄性激素受體基因外顯子1、4、8的遺傳變異情況，并分析其與泌香量的相關(guān)性，探尋其與林麝泌香性能密切相關(guān)的遺傳標(biāo)記位點(diǎn)，為選育高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)麝香的林麝提供理論依據(jù)和實(shí)踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

50頭雄性林麝毛發(fā)樣品（帶毛根）均采自陜西鳳縣的3個(gè)養(yǎng)麝場(chǎng)。毛發(fā)來(lái)源與文獻(xiàn)［13］相同。置于滅菌包裝袋中，每個(gè)個(gè)體記錄不同的編號(hào)，冷凍保存于-80℃超低溫冰箱中。

主要試劑包括2×ES Taq Master Mix（含染料，康為世紀(jì)生物科技有限公司）、瓊脂糖、快速瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（康為世紀(jì)生物公司出品）、PGE-T試劑盒、10×TBE 、TEM ED、甲叉、丙烯酰胺、APS、二甲苯青FF、溴酚藍(lán)、Na2EDTA·2 H2O、共離子甲酰胺等。

1.2 方 法

1.2.1 基因組DNA的提取 參照文獻(xiàn)［19-20］的方法。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 本試驗(yàn)引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)［20］所用的擴(kuò)增引物，均由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 引物序列及相關(guān)信息Table 1 Primer sequences and related information of AR

表2 PCR擴(kuò)增體系及其擴(kuò)增程序Table 2 The PCR amplification systeem and it＇s procedures

1.2.3 PCR擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增體系和程序按照表2進(jìn)行，每個(gè)樣本取4μL PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)擴(kuò)增效果。

1.2.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳 配置30%的丙烯酰胺溶液制膠，待膠完全凝固后，選取瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)帶型單一的PCR產(chǎn)物進(jìn)行SSCP分型。具體操作如下：每個(gè)樣本取5μL的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，與5 μL變性劑（95%甲酰胺、10 mmol／L EDTA、0.05%溴酚藍(lán)、0.05%二甲苯青）混合，瞬時(shí)離心后，PCR儀中98℃變性10 min，放置冰中驟冷以防DNA雙鏈復(fù)性，放置20 min后，點(diǎn)樣。首先250 V預(yù)電泳15 min，而后110 V電泳過(guò)夜。電泳結(jié)束后，將凝膠取出置于超純水中，漂洗兩次后，于1%硝酸銀溶液中染色20 min，要求避光輕搖，染色時(shí)間可自行調(diào)整。然后用2%氫氧化鈉和0.1%甲醛配置顯色液，要求現(xiàn)用現(xiàn)配，凝膠在顯色液中顯色，直至呈現(xiàn)出清晰的電泳條帶，要避免顯色時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，最后拍照和分析條帶。

圖1 林麝基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳M.DL2000 Marker；1～20.從毛發(fā)中提取基因組DNA結(jié)果Fig.1 1%Agarose gel electrophoresis of forest musk deer genomic DNA M.DL2000 Marker；1～20.genomic DNA of hair tissue with PCR method

1.2.5 測(cè)序 首先利用凝膠回收試劑盒對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，將提純的DNA片段與pGEM-T Easy載體相連接（16℃放置8 h）。42℃水浴鍋中熱擊90 s使重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，37℃搖菌使菌體復(fù)蘇，涂板，37℃培養(yǎng)過(guò)夜培養(yǎng)后挑取單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，最后提取菌液中的質(zhì)粒送往華大基因測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA的濃度與純度檢測(cè)

用Nanodrop檢測(cè)DNA濃度和質(zhì)量。結(jié)果顯示樣本260／280值在1.8～2.0之間，說(shuō)明提取的DNA質(zhì)量均良好，可用于后續(xù)試驗(yàn)。提取的基因組DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，成像后，結(jié)果如圖1所示。由圖可見(jiàn)條帶單一、無(wú)拖尾現(xiàn)象，表明從血液中提取的DNA的完整度良好。

2.2 林麝AR基因外顯子（1、4、8）瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)

由圖2、3、4可知，條帶單一，無(wú)非特異擴(kuò)增，表明各樣本均獲得了理想的PCR產(chǎn)物，可以用于聚丙烯酰胺凝膠電泳。

圖2 林麝雄性激素受體基因外顯子1 PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR products of AR Exon 1 of forest musk deer

圖3 林麝雄性激素受體基因外顯子4 PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 PCR products of AR Exon 4 of forest musk deer

圖4 林麝雄性激素受體基因外顯子8 PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 PCR products of AR Exon 8 of forest musk deer

2.3 SSCP分析結(jié)果

聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果如下圖，結(jié)果顯示雄麝AR基因三個(gè)外顯子都僅有一種帶型，表明三個(gè)外顯子均無(wú)多態(tài)性。

2.4 測(cè) 序

圖5 林麝雄性激素受體基因外顯子1擴(kuò)增片段SSCP分析Fig.5 SSCP analysis of PCR amplification products of AR Exon1 of forest musk deer

圖7 林麝雄性激素受體基因外顯子8擴(kuò)增片段SSCP分析Fig.7 SSCP analysis of PCR amplification products of AR Exon8 of forest musk deer

對(duì)所有樣本的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序得到外顯子1、4、8的序列，進(jìn)行多序列比對(duì)，結(jié)果顯示，AR基因三個(gè)外顯子均為單態(tài)。

3 討 論

比較人、牛、羊、大鼠、雞等AR基因，發(fā)現(xiàn)AR基因的外顯子序列通常具有共同的結(jié)構(gòu)功能，具有同源性，有較高的保守性，突變概率為1／1000。試驗(yàn)結(jié)果似乎說(shuō)明了AR基因外顯子1、4、8在秦嶺雄性林麝群中具有一定的保守性。

林麝秦嶺種群從外形特征、毛色等性狀上一致性較高，變異很小，性狀變異視乎很小。但是，種群在繁殖性能、泌香性能上是有明顯變異，故在AR基因外顯子上沒(méi)有找到多態(tài)性，歸因于秦嶺林麝種群在AR基因突變可能性較小的，似乎可以說(shuō)得過(guò)去。但是仔細(xì)研究過(guò)于牽強(qiáng)，也許還有其他原因，比如采樣問(wèn)題、引物設(shè)計(jì)問(wèn)題等等。

由于林麝野性強(qiáng)，應(yīng)激性大，樣本采集困難。雖然采集了來(lái)自于3個(gè)場(chǎng)50個(gè)樣本，場(chǎng)際距離又很近，但是樣本量不足夠大，代表性不強(qiáng)，也可能是造成AR基因不具備多態(tài)性的重要原因之一。

目前尚未報(bào)道麝科動(dòng)物或者更近源的物種如鹿科的相關(guān)基因序列或者引物，引物設(shè)計(jì)主要參考牛、人、大鼠而得，這可能是造成AR基因不具備多態(tài)性的另一重要原因。還需要進(jìn)一步探索新引物、新基因位點(diǎn)作為研究對(duì)象。

圖6 林麝雄性激素受體基因外顯子4擴(kuò)增片段SSCP分析Fig.6 SSCP analysis of PCR amplification products of AR Exon4 of forest musk deer

因此，在后續(xù)探究林麝有關(guān)高泌香量的候選基因研究中，一方面仍需對(duì)林麝雄激素受體基因的序列全長(zhǎng)進(jìn)行深入分析，另一方面也可以另辟蹊徑尋找其他相關(guān)候選基因。

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