段筱娟 李志義△ 楊玉濤 鐘美 饒家秋 何常

（1.貴陽市第一人民醫(yī)院病理科，貴州 貴陽550002；2.貴陽中醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院，貴州 貴陽550002；3.貴陽醫(yī)學院附屬醫(yī)院病理科，貴州 貴陽550001）

乳腺癌的診治取得了重大的進步，但轉移復發(fā)是造成乳腺癌患者死亡的主要原因。在浸潤轉移過程中，微脈管系統(tǒng)的作用不容忽視，經(jīng)血道轉移和淋巴道轉移是惡性腫瘤細胞轉移的重要途徑。血管內皮生長因子D（VEGF－D）是VEGFs成員之一，它可與位于血管內皮細胞上的VEGFR－2結合調節(jié)血管生成，與位于淋巴管內皮細胞上的VEGFR－3結合調節(jié)淋巴管生成，從而促進腫瘤的轉移。本實驗通過免疫組化法檢測VEGF－D和 MVD（由CD105標記）、MLD（由D2－40標記），探討乳腺癌組織中VEGF－D的表達及其與MVD、MLD、臨床病理參數(shù)之間的關系。

1 材料與方法

1.1 病例收集 收集2009年1月至2013年12月貴陽市第一人民醫(yī)院和貴陽中醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院病理科存檔病例，乳腺癌50例，收集同期乳腺增生癥10例作對照。

1.2 免疫組織化學法染色 采用EnVision二步法分別行VEGF－D和CD105、D2－40染色。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水；3%H2O2去離子水室溫孵育10min；蒸餾水漂洗，置于PBS中震蕩10min；高壓鍋熱修復；PBS沖洗，滴加一抗，37℃水浴孵育1h；PBS沖洗，滴加二抗，濕盒37℃水浴孵育30min；PBS沖洗，應用DAB溶液顯色，顯微鏡下觀察，適時終止；復染、脫水、透明、封片。用PBS緩沖液替代一抗作空白對照，用已知陽性片作陽性對照。VEGF－D抗體購自武漢博士德生物技術有限公司，CD105和D2－40抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司，通用型二抗購自廣州深達公司。

1.3 結果判斷 以乳腺腺上皮細胞或癌細胞胞漿內出現(xiàn)黃色顆粒為VEGF－D陽性（圖1），采用半定量積分法［1］判斷結果，每張染色切片隨機選取5個染色均勻的高倍視野，每個視野計數(shù)100個細胞，計算陽性細胞百分率，＜5%賦值為0，5%～25%為1，26%～75%為2，≥76%為3。染色程度標準據(jù)每張切片的大多數(shù)細胞染色特征決定，沒有染色賦值為0，淺黃色為1，棕黃色為2，棕褐色為3。最終結果由陽性細胞百分率與染色強度的乘積決定：0～2分為（－），3～4分為（＋），5～7分為（＋＋），8～9分為（＋＋＋）。CD105陽性表達于血管（圖2），D2－40陽性表達于淋巴管（圖3），MVD、MLD計數(shù)：首先在低倍鏡（×100）下找出脈管比較密集的區(qū)域，即“熱點”區(qū)，然后在高倍鏡（×400）計數(shù)每個區(qū)域的脈管數(shù)量，取平均值作為MVD、MLD。每張切片選取5個“熱點”。

圖2 CD105陽性表達于乳腺癌 血管（EnVision法高倍放大）

圖3 D2－40陽性表達于乳腺癌淋巴管 （EnVision法低倍放大）

1.4 統(tǒng)計學處理 運用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件數(shù)據(jù)包進行數(shù)據(jù)處理，計量資料比較用t檢驗，計數(shù)資料比較用χ2檢驗，相關性采用Pearman相關分析，MVD、MLD用ˉx±s表示，按檢驗水準P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 臨床資料 50例乳腺癌病例的臨床病理特征為：年齡34～84歲，中位年齡49歲，＜50歲25例，≥50歲25例；腫瘤≤2cm 18例，＞2cm 32例；組織學類型均為浸潤性導管癌，按照WHO乳腺癌病理分級分：Ⅰ級4例，Ⅱ級31例，Ⅲ級15例；淋巴結轉移20例，無淋巴結轉移30例。

2.2 乳腺癌和乳腺增生癥組織中VEGF－D的表達及 MVD、MLD VEGF－D的陽性表達率（64.00%）及 MVD（16.96±8）、MLD（2.37±0.91）在乳腺癌組明顯高于乳腺增生癥組（10.00%，1.46±0.67，0.86±0.67），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

2.3 VEGF－D、MVD、MLD與乳腺癌臨床病理參數(shù)之間的關系 VEGF－D、MVD、MLD與乳腺癌組織學分級有相關性，MVD和MLD與淋巴結轉移密切相關（P＜0.05）。見表1。

表1 VEGF－D、MVD、MLD與乳腺癌臨床病理參數(shù)之間的關系

2.4 乳腺癌組織中 VEGF－D的表達與 MVD、MLD之間的關系 乳腺癌組織中VEGF－D表達為（－）、（＋）、（＋＋）、（＋＋＋）者 MVD分別為（8.83±3.29）、（17.62±4.31）、（20.75±5.24）、（29.00±6.29），MLD分別為（1.79±0.87）、（2.38±0.55）、（3.00±0.86）、（4.21±0.60），相關性分析顯示VEGF－D與 MVD、MLD均呈正相關（P＜0.05）。

3 討 論

乳腺癌淋巴管生成及其轉移成為研究熱點。Stacker［2］等發(fā)現(xiàn)VEGF－D可以加快腫瘤生長和血管生成，而且用抗VEGF－D的抗體可以遏制腫瘤轉移。Gu Y［3］等對61例乳腺癌手術標本的研究發(fā)現(xiàn)，VEGF－D在乳腺癌中的表達明顯高于乳腺良性病變，癌細胞VEGF－D高表達伴有高的淋巴管密度，此類患者的預后也差，提示VEGF－D在乳腺癌的淋巴管形成中發(fā)揮了重要的作用，使癌細胞更具侵襲性，導致不良的預后。本實驗中，VEGF－D的表達及MVD、MLD在乳腺增生癥組中明顯低于乳腺癌組，VEGF－D陽性組的 MVD、MVD高于陰性組的，且VEGF－D的表達水平與 MVD、MLD均呈正相關，進一步證實VEGF－D在脈管的發(fā)育上具有雙重作用，即可以刺激血管內皮增殖，又可以促進淋巴管生成。本實驗結果顯示乳腺癌低分化組的MVD、MLD高于中、高分化組，有淋巴結轉移組的MVD、MLD高于無淋巴結轉移組，差異均有統(tǒng)計學意義，說明乳腺癌組織內的MVD、MLD與腫瘤細胞的分化程度、侵襲能力和淋巴轉移均有一定的關系，腫瘤MVD、MLD較高者，有較強的侵襲能力和轉移能力。但是VEGF－D陽性率在有淋巴結轉移組明顯低于無淋巴結轉移組，分析原因可能是：（1）VEGF－D在不同腫瘤內酶解加工的程度不同；（2）VEGF－D雖然在腫瘤中可刺激淋巴管生成，但在淋巴系統(tǒng)的發(fā)展過程中VEGF－D不起重要作用或者是在發(fā)展過程中同時存在其他淋巴管生長因子的調控機制，補償了 VEGF－D的作用［4］。故 VEGF－D參與了乳腺癌血管和淋巴管生成。MVD和MLD與腫瘤的分化程度、侵襲能力和轉移密切相關，可作為預測預后和轉移的指標。

［1］ 邢傳平，劉斌，董亮.免疫組織化學標記結果的判斷方法［J］.中華病理學雜志，2001，30（4）：318.

［2］ Stacker SA，Caesar C，Baldwin ME，et al.VEGF－D promotes the metastatic spread of tumor cells via the lymphatics［J］.Nat Med，2001，7（2）：186－191.

［3］ Gu Y，Qi X，Guo S，et al.Lymphangiogenesis induced by VEGF－C and VEGF－D promotes metastasis and a poor outcome in breast carcinoma retrospective study of 61cases［J］.Clin Exp Metastasis，2008，25（7）：717－725.

［4］ Baldwin M E，Halford M M，Roufail S，et al.Vascular endothelial growth factor D is dispensable for development of the lymphatic sydtem［J］.Mol Cell Biol，2005，25（6）：2441－49.