孫偉莉，申 勇，李衛(wèi)鵬，袁 媛，張林杰

Graves′病患者CD4＋CD25＋調節(jié)性T細胞功能初探

孫偉莉1，2，申 勇2，李衛(wèi)鵬2，袁 媛2，張林杰1

目的探討調節(jié)性T細胞（Treg）在Graves’?。℅D）發(fā)生中所起的作用。方法流式細胞術檢測20例GD患者（GD組）和10例健康對照者（健康對照組）外周血Treg數(shù)量。3H摻入試驗測定Treg與效應T細胞（Teff）共培養(yǎng)環(huán)境中的Treg對其增殖抑制作用，ELISA法測定白細胞介素-10（IL-10）、白細胞介素-2（IL-2）等細胞因子的濃度。結果Treg所占CD4＋細胞的比例在GD組與健康對照組中差異無統(tǒng)計學意義。GD組的Treg抑制功能與健康對照組相比顯著降低。兩組之間的細胞因子濃度有一定的差異，GD組IL-10水平顯著低于健康對照組，IL-2和白細胞介素-17（IL-17）水平顯著高于健康對照組。結論 GD患者的Treg有功能缺陷，與甲狀腺自身免疫性疾病的發(fā)病有一定的關系。Treg在GD中的診斷價值以及病理生理機制值得進一步探討。

Graves’病；調節(jié)性T細胞；效應T細胞

Graves’?。℅raves’disease，GD）是一種常見的甲狀腺疾病，主要表現(xiàn)為機體對甲狀腺抗原的免疫耐受消失、淋巴細胞浸潤甲狀腺組織。GD作為一種自身免疫性甲狀腺疾?。╝utoimmune thyroid disease，AITD）是由于免疫調節(jié)失衡所致。調節(jié)性T細胞（regulatory T cells，Tregs）是具有免疫調節(jié)功能的細胞亞群，該細胞亞群具有維持免疫耐受作用：抑制免疫反應，防止自身免疫疾病的發(fā)生。Tregs通過細胞與細胞的直接接觸［1］，或通過產(chǎn)生具有免疫抑制的細胞因子如轉化生長因子-β（transforming growth factor β，TGF-β）和白細胞介素-10（interleukin-10，IL-10），抑制抗原特異性T細胞，發(fā)揮免疫抑制作用［2－3］。該研究旨在通過檢測分析GD患者外周血Tregs的數(shù)量以及功能狀況，探討該細胞亞群在GD發(fā)生發(fā)展中所起的作用，為該疾病的臨床診治提供參考。

1 材料與方法

1.1 病例資料GD患者20例作為GD組，其中男5例，女15例，年齡20～57（41.1±10.1）歲。診斷標準為甲狀腺激素的血清學指標，即依據(jù)游離三碘甲狀腺原氨酸（free iodine thyoid three original acid，F(xiàn)reeT3）、游離甲狀腺素（free thyroxine，F(xiàn)reeT4）、促甲狀腺激素（thyroid-stimulating hormone，TSH）以及促甲狀腺激素受體抗體（thyrotropin receptor antibody，TRAB）檢測結果?；颊吲懦?、肝、脾、肺、腎等臟器病變。健康體檢者10例作為健康對照組，其中男3例，女7例，年齡18～59（37.7±12.7）歲，無家族病史，排除重要臟器病變；甲狀腺球蛋白抗體和甲狀腺過氧化物酶抗體均為陰性。兩組之間年齡、性別相匹配，差異無統(tǒng)計學意義。

1.2 試劑和儀器異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標記的鼠抗人CD4抗體、藻紅蛋白（P-phycoerythrin，PE）標記的鼠抗人CD25抗體及其相匹配的同型對照、FACS Aria型流式細胞儀均購自美國BD公司；RPMI 1640培養(yǎng)液及胎牛血清購自美國Hyclone公司；3H胸腺嘧啶核苷（3H-thymidine，3H-TdR）購自中國科學院上海核技術開發(fā)公司；TGF-β、IL-10等細胞因子ELISA試劑盒購自美國R＆D公司。

1.3 細胞分離與流式分析采集實驗對象外周靜脈血，肝素鈉抗凝。加入Ficoll分離液，密度梯度離心（2 000 r／min、20 min）獲得單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）。其中一部分PBMCs接受30 Gy的137Cs照射，作為后續(xù)免疫學試驗的抗原遞呈細胞（antigen-presenting cells，APC）；另一部分采用FITC標記anti-CD4，PE標記anti-CD25，流式細胞儀分選，CD4＋CD25＋細胞作為試驗中的Tregs，CD4＋CD25－細胞作為試驗中的效應T細胞（T effector，Teff），純度均＞95%。

1.4 細胞增殖試驗新鮮分離的Teff（CD4＋CD25－）和Tregs（CD4＋CD25＋）按照不同比例（20 000∶0，20 000∶5 000以及20 000∶10 000）在含有完全RPMI 1640培養(yǎng)液（含有10%的胎牛血清）的96孔圓底培養(yǎng)板中共培養(yǎng)。培養(yǎng)板采用抗CD3（每孔0.2 μg）包板，每孔含有可溶性anti-CD28為0.05 μg，同時每孔加入輻照的PBMCs 50 000個，作為實驗的APC。置于37℃、5%CO2的濕潤環(huán)境中培養(yǎng)。于培養(yǎng)第4天，收集培養(yǎng)液上清液用于細胞因子檢測。同時，每孔加入3H-TdR 18 500 Bq，繼續(xù)培養(yǎng)16～18 h。收集細胞，β液體閃爍儀檢測，通過每分鐘計數(shù)值（counts per minutes，cpm）判定細胞增殖程度。增殖百分率（%）＝（共培養(yǎng)孔的cpm值／單獨Teff的cpm值）×100%。

1.5 細胞因子檢測收集各個培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)液上清，檢測TGF-β、IL-10、IL-4、IL-17、IL-5、IL-2以及干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ）。試驗設置復孔。嚴格按照說明書進行操作。

1.6 統(tǒng)計學處理應用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析，數(shù)據(jù)以±s表示。兩組之間的比較采用Mann-Whitney檢驗，多組之間比較采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 基本臨床資料比較GD組與健康對照組相比，GD組FreeT3、FreeT4、TRAB水平明顯高于健康對照組（P＜0.01），TSH水平明顯低于健康對照組（P＜0.01）。兩組年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計學意義。見表1。

表1 基本臨床資料比較（±s）

表1 基本臨床資料比較（±s）

2.2 兩組外周血CD4＋CD25＋占CD4＋百分比比較GD組和健康對照組外周血CD4＋細胞比例及CD4＋CD25＋細胞數(shù)占CD4＋細胞比例比較，兩組之間差異無統(tǒng)計學意義。見表2、圖1。

表2 兩組外周血CD4＋細胞及CD4＋CD25＋／CD4＋百分率的比較（%，±s）

表2 兩組外周血CD4＋細胞及CD4＋CD25＋／CD4＋百分率的比較（%，±s）

2.3 CD4＋CD25＋Tregs對Teff的抑制功能Tregs的抑制功能體現(xiàn)在對Teff增殖的抑制上。實驗結果顯示，GD組和健康對照組的Teff在單獨培養(yǎng)的情況下，經(jīng)過anti-CD3、anti-CD28及自身APC的共同作用，兩組的cpm值分別為（34 152± 5 836）、（33 286±6 820），差異無統(tǒng)計學意義（P＝0.783）。當比例為20 000∶10 000時，GD組的Teff增殖率為（75.53±6.49）%，而健康對照組Teff增殖率為（33.50±6.82）%，GD組增殖率明顯增高（P＝0.001）。當比例為20 000∶5 000時，GD組的Teff增殖率為（79.61±8.12）%，而健康對照組Teff增殖率為（38.54±6.78）%，GD組增殖率明顯增高（P＝0.001）。提示GD組患者的Tregs的抑制功能低于健康對照組。見圖2。

2.4 細胞因子濃度檢測通過檢測培養(yǎng)液中的細胞因子的濃度，健康對照組的IL-10水平顯著高于GD組（P＜0.05），健康對照組的IL-2、IL-17水平顯著低于GD組（P＜0.05）；兩組間其他細胞因子差異無統(tǒng)計學意義。見表3。提示IL-10、IL-2和IL-17有可能與Tregs發(fā)揮抑制作用有一定關系。

3 討論

Tregs在維持免疫耐受、抑制過度免疫應答中起到至關重要的作用［4－5］。研究［6－7］報道Tregs在1型糖尿病、多發(fā)性硬化病、風濕性關節(jié)炎等自身免疫性疾病中存在缺陷，而對于AITD中的Tregs的研究較少，且觀點不一。

表3 培養(yǎng)液中的細胞因子濃度（pg／ml）

本研究GD組外周血Tregs占CD4＋細胞的百分比與健康對照組相比差異無統(tǒng)計學意義，提示GD的發(fā)病并非是由于Tregs的數(shù)量改變所導致。本研究以Tregs對Teff增殖的影響分析了GD患者外周血中的Tregs功能，結果顯示GD組與健康對照組的Teff在單獨培養(yǎng)時其增殖程度是相當?shù)?；然而當將Teff與Tregs混合培養(yǎng)時，GD組Teff的增殖率明顯高于健康對照組，提示GD患者的Tregs對淋巴細胞增值的控制抑制作用顯著降低，淋巴細胞的增值活化能力活躍，對自身抗原的耐受降低，這可能是GD發(fā)病的重要因素之一。

研究［1－3］報道Tregs通過細胞－細胞接觸以及分泌細胞因子發(fā)揮抑制作用。故而本研究進一步探討了細胞因子TGF-β、IL-10、IL-4、IL-17、IL-5、IL-2和IFN-γ與Tregs功能之間的可能關系。在本實驗中分別檢測了GD組和健康對照組中的Teff單獨培養(yǎng)以及Teff與Tregs混合培養(yǎng)時這些細胞因子的水平，結果顯示IL-10、IL-2以及IL-17在GD組和健康對照組的Teff與Tregs混合培養(yǎng)中差異有統(tǒng)計學意義。GD組的IL-10明顯低于健康對照組，IL-10作為一種負性調節(jié)因子，具有較強的免疫抑制以及免疫調控作用，主要可以抑制Teff的增殖和抑制Teff產(chǎn)生細胞因子如IL-2，提示GD組的Tregs功能降低與IL-10水平下降有一定的關系。IL-2作為重要的細胞生長因子，可以促進細胞增殖。當GD組的Tregs功能降低，分泌的IL-10減少，不能有效抑制Teff的活化，產(chǎn)生IL-2，從而促進Teff的增值，又產(chǎn)生更多的IL-2。本研究中GD組的IL-2明顯高于健康對照組也論證了此機制。IL-17是由最新發(fā)現(xiàn)的一類輔助型T細胞（helper T cell，Th）17分泌的，能誘導炎癥因子以及趨化因子的表達，使得更多的免疫細胞到達炎癥部位加劇機體的炎癥反應，較高水平的IL-17提示Tregs對Th17的抑制作用減弱［8－9］。在本研究中，觀察到GD組IL-17水平高于健康對照組，也證實了GD組的Tregs存在功能缺陷。

在分析Tregs抑制功能的Teff增殖試驗中，本研究采用的刺激物有anti-CD3、anti-CD28，同時采用輻照的PBMCs作為APC，即GD組采用GD患者自身的PBMCs作為APC，而健康對照組采用健康個體自身的PBMCs用做APC，APC在細胞增殖中起至關重要的作用，而且不同個體APC的主要組織相容性復合體不盡相同。有研究［10－11］報道顯示，APC與自身免疫疾病有一定的關系，主要組織相容性復合體分子表型可以影響細胞的增殖以及細胞因子的生成［12－14］。GD組與健康對照組的Teff增殖是否與APC有一定關系，有待于在以后的GD動物模型試驗中進一步探討。

本研究顯示GD患者外周血中的Tregs數(shù)量并未發(fā)生明顯改變，而GD患者的Tregs功能存在缺陷，提示這可能與GD發(fā)生有一定關系。對于GD患者，針對性的采取糾正Tregs的靶向治療，能否使得GD患者好轉乃至痊愈，值得進一步探討。

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Study on the function of CD4＋CD25＋regulatory T cells in patients with Graves’disease

Sun Weili1，2，Shen Yong2，Li Weipeng2，et al
（1Dept of Immunology，Anhui Medical University，Hefei 230032；2Dept of Nuclear Medicine，The First Affiliated Hospital of Bengbu Medical College，Bengbu 233004）

ObjectiveTo investigate the role of regulatory T cells（Tregs）in Graves’disease（GD）.MethodsTreg number was assessed by flow cytometric analysis in samples from 20 GD patients and 10 healthy controls.The inhibitory effect of Treg on T effector cells（Teff）was assayed by3H thymidine proliferation experiment.IL-10，IL-2 and other cytokine levels were determined by ELISA in conditioned media from the co-cultures.ResultsNo differences were found in the frequency of Tregs as a percentage of CD4＋cells between GD and healthy controls.Compared with the healthy controls，inhibitory function of Treg from patients with GD decreased significantly.Cytokine secretion between two groups also had significant difference.IL-10 secretion of healthy control group was significantly higher than patients group，while secretion of IL-2 and IL-17 was significantly lower than patients group.ConclusionTregs from GD patients are partly dysfunctional，possibly explaining their autoimmunity.Future work will elucidate the diagnostic potential and pathophysiology of Tregs in GD.

Graves’disease；regulatory T cells；T effector cells

R 392.6

1000－1492（2015）02－0202－04

2014－10－15接收

安徽省高校省級自然科學基金（編號：KJ2011A167）

1安徽醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院免疫學教研室，合肥 2300322安徽蚌埠醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院核醫(yī)學科，蚌埠 233004

孫偉莉，女，主管技師，碩士研究生；張林杰，男，教授，碩士生導師，責任作者，E-mail：zlj33＠sina.com