王永強(qiáng)，于 源，安 丹，姜會(huì)玲，林友成，吳 松，蔡志明

尿液POU4F2基因甲基化對(duì)膀胱尿路上皮癌早期診斷的意義

王永強(qiáng)1，2，于 源3，安 丹3，姜會(huì)玲1，林友成4，吳 松2，蔡志明1，2

目的尋找在中國人群中具有高敏感性、高特異性的膀胱癌甲基化標(biāo)志物，以應(yīng)用于膀胱癌的尿液診斷。方法先用T24細(xì)胞系篩選8種文獻(xiàn)報(bào)道的膀胱癌甲基化標(biāo)志物，再利用甲基化特異性熒光定量PCR（qMSP）技術(shù)分別在28例膀胱癌患者、10例尿路結(jié)石伴感染患者和30例健康志愿者尿液樣品中檢測(cè)篩選成功的4種甲基化標(biāo)志物，計(jì)算出不同組合的敏感性和特異性。結(jié)果PCDH17、POU4F2、TCF21、ZNF154的敏感性分別為46.43%、92.86%、39.29%、46.43%，特異性分別為95.00%、97.50%、97.50%、100.00%，最優(yōu)的診斷標(biāo)志物為POU4F2（敏感性92.86%、特異性97.50%）。結(jié)論 應(yīng)用qMSP技術(shù)，以POU4F2為甲基化標(biāo)志物在尿液中檢測(cè)膀胱癌可能會(huì)成為一種臨床可用的診斷方式。

膀胱癌；qMSP；甲基化；診斷

膀胱癌發(fā)病率在全身腫瘤發(fā)病率中居第九位，嚴(yán)重危害人類的健康［1］。由于早期膀胱癌常不顯示癥狀，不易發(fā)現(xiàn)，因而早診斷、早治療對(duì)膀胱癌患者的預(yù)后具有極大的幫助。開發(fā)高靈敏、高特異性的膀胱癌無創(chuàng)檢查是膀胱癌檢測(cè)和監(jiān)控手段的發(fā)展方向。膀胱癌的發(fā)生與基因組水平的改變相關(guān)，同時(shí)亦發(fā)生表觀遺傳學(xué)上的改變?nèi)鏒NA甲基化和組蛋白修飾等［2－4］。DNA甲基化異?？赏ㄟ^影響染色質(zhì)結(jié)構(gòu)及癌基因和抑癌基因的表達(dá)而參與膀胱癌的形成。因此，特定基因的DNA甲基化可作為生物標(biāo)志物診斷和監(jiān)測(cè)膀胱癌。甲基化特異性PCR（methylation-specific polymerase chain reaction，MSP）是目前檢測(cè)DNA甲基化最敏感的技術(shù)，能發(fā)現(xiàn)0.1%的甲基化DNA（＞50 pg）。近些年產(chǎn)生的甲基化特異性熒光定量PCR（quantitative methylationspecific polymerase chain reaction，qMSP）技術(shù)是實(shí)時(shí)定量基因擴(kuò)增熒光檢測(cè)系統(tǒng)與MSP技術(shù)的結(jié)合，利用qMSP技術(shù)檢測(cè)膀胱癌的方法有諸多報(bào)道［5－8］，但研究主要局限于歐美人種，且不同種族間的基因甲基化情況差異較大。該研究利用qMSP技術(shù)在中國人尿液中檢測(cè)多種腫瘤標(biāo)志物，以期達(dá)到早期無創(chuàng)診斷膀胱癌的目的。

1 材料與方法

1.1 病例資料選擇2013年2月～2014年4月在安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科、中山大學(xué)腫瘤醫(yī)院泌尿外科、南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院泌尿外科膀胱癌患者尿液樣品28份作為膀胱癌組，尿路結(jié)石伴感染患者尿液樣品10份作為尿感染組，健康志愿者尿液樣品30份作為正常組，臨床資料見表1。尿液樣品均為中段晨尿，采集后立即用低溫離心機(jī)4℃，2 000 r／min離心15 min后，去上清液，留沉淀進(jìn)行DNA提取?；颊呒捌浼覍僮栽负炇鹬橥鈺?。

1.2 主要試劑天根組織／血液DNA提取試劑盒、天根微量樣品基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；dsDNA HS分析試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)、96孔PCR儀、核酸蛋白定量儀2.0（美國Life Technologies公司）；DNA甲基化試劑盒（美國ZYMO Research公司）；TaKaRa RT-PCR試劑盒、TaKaRa premix taq ver 2.0 plus dye（大連寶生物工程有限公司）；低溫高速離心機(jī)（BECKMAN 64R）（美國Beckman Coulter公司）。T24膀胱癌細(xì)胞系由深圳北大醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)予。引物序列參考文獻(xiàn)［5－8］，見表2。

1.3 方法

1.3.1實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組 實(shí)驗(yàn)組為膀胱癌患者，記為BC；對(duì)照組為尿路結(jié)石伴感染患者及健康志愿者，分別記為U和N。

1.3.2DNA提取 采用天根微量樣品基因組DNA提取試劑盒對(duì)尿沉渣進(jìn)行DNA提取，提取流程參照試劑盒說明書。采用天根組織／血液DNA提取試劑盒對(duì)T24細(xì)胞進(jìn)行DNA提取，提取流程參照試劑盒說明書。

1.3.3樣品檢測(cè)

1.3.3.1濃度檢測(cè) 檢測(cè)方法按照Quant-it dsDNA HS Assay Kit的說明書中步驟進(jìn)行。注意每日首次使用Qubit時(shí)，均需要制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，且要用2 μl standard2＃作為陽性對(duì)照，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線的準(zhǔn)確性，只有當(dāng)standard2＃檢測(cè)的濃度在下面范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線才能使用。Qubit HS陽性對(duì)照（standard2＃）檢測(cè)濃度范圍9.5～10.5 ng／μl。

1.3.3.2樣品完整性檢測(cè)方法 根據(jù)Qubit定量的濃度，取約50 ng DNA，與3 μl溴酚藍(lán)混合，補(bǔ)水至10 μl后，全部加入到1%瓊脂糖檢測(cè)膠的膠孔中，樣品應(yīng)同時(shí)包括2條分子量標(biāo)準(zhǔn)：λ-Hind Ш digest（上樣量2 μl）及D2000（上樣量6 μl）。電泳條件：電壓150 V電泳40 min。將電泳完成的膠塊置于凝膠成像儀中拍照保存。拍照時(shí)注意膠圖背景較暗，膠孔要清晰。選擇DNA總量＞500 ng，片段大?。?0 000 bp的樣本進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.4Bisulfite處理 Bisulfite處理的樣本起始量為200 ng，具體實(shí)驗(yàn)方法和注意事項(xiàng)根據(jù)ZYMO RESEARCH的EZ DNA Methylation-GoldTMKit的說明書進(jìn)行操作，純化時(shí)用20 μl的M-Elution Buffer洗脫DNA。Bisulfite反應(yīng)體系：CT Conversion Reagent 130 μl，DNA模板200 ng，滅菌雙蒸水補(bǔ)足150 μl。所用儀器：96-Well GeneAmp PCR System 9700。反應(yīng)條件：98℃、10 min，65℃、2.5 h，4℃維持。

1.3.5甲基化引物篩選 以經(jīng)Bisulfite處理的T24細(xì)胞系DNA為模版，選取各個(gè)引物分別進(jìn)行PCR。反應(yīng)體系：模版30 ng、TaKaRa?premix taq 25 μl、上下游引物各1 μl、滅菌雙蒸水補(bǔ)足至50 μl。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃30 s，57℃30 s，72℃30s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖電泳分析。沒有條帶的視為引物篩選失敗，選取ALU-C4作為內(nèi)參，PCDH17、POU4F2、TCF21、ZNF154作為甲基化標(biāo)志物進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見圖1。

1.3.6qMSP檢測(cè) 對(duì)經(jīng)Bisulfite處理的DNA樣本進(jìn)行qMSP，每個(gè)樣本檢測(cè)ALU-C4、PCDH17、POU4F2、TCF21、ZNF154 5對(duì)引物。反應(yīng)體系：SYBR?Premix Ex TaqTM II（2×）10 μl、引物（10 μM）2 μl、ROX Reference Dye（50×）0.4 μl、DNA模板2 μl、Naclease-Free Water 5.6 μl，共20 μl體系。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃30 s、60℃30 s、72℃30 s擴(kuò)增45個(gè)循環(huán)。每個(gè)反應(yīng)重復(fù)3次，取3次結(jié)果的平均CT值作為最終結(jié)果。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 甲基化拷貝數(shù)計(jì)算用5個(gè)基因ALU-C4、PCDH17、POU4F2、TCF21、ZNF154的每對(duì)引物純化后的RT-PCR產(chǎn)物制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，做出每對(duì)引物的標(biāo)準(zhǔn)曲線［9］，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線定出每個(gè)基因的實(shí)際甲基化的拷貝數(shù)。見圖2。

表2 qMSP內(nèi)參及甲基化標(biāo)志物

2.2 相對(duì)甲基化水平計(jì)算將實(shí)際甲基化的拷貝數(shù)代入以下公式，計(jì)算出相對(duì)甲基化水平值。相對(duì)甲基化水平值＝［（gene／ALU）sample／（gene／ALU）Standard］×1 000。

2.3 3 組間相對(duì)甲基化水平差異比較PCDH17基因：正常組（46.88±72.17）、膀胱癌組（382.67± 440.00）、尿路感染組（286.93±489.52），3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝7.267，P＜0.01）。POU4F2基因：正常組（0.35±0.50）、膀胱癌組（104.55± 94.74）、尿路感染組（9.63±28.87），3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝22.321，P＜0.01）。TCF21基因：正常組（24.82±36.95）、膀胱癌組（169.85± 169.52）、尿路感染組（78.71±41.79），3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝11.997，P＜0.01）。ZNF154基因：正常組（43.68±89.86）、膀胱癌組（480.96± 425.70）、尿路感染組（110.52±89.65），3組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝18.420，P＜0.01）。

2.4 檢出限判定根據(jù)30個(gè)正常樣本中各基因的最大相對(duì)甲基化水平值確定各基因的檢出限，PCDH17、POU4F2、TCF21、ZNF154的檢出限分別為300.17、1.95、154.56、427.99。見圖3。

2.5 結(jié)果判定相對(duì)甲基化水平值高于檢出限判定為陽性，等于或低于檢出限判定為陰性。見表1。多種標(biāo)志物聯(lián)用時(shí)，其中任一標(biāo)志物陽性即判定為陽性結(jié)果。敏感性＝檢測(cè)結(jié)果為陽性的膀胱癌樣本數(shù)／總的膀胱癌樣本數(shù)，特異性＝檢測(cè)結(jié)果為陽性的非膀胱癌樣本數(shù)／總的非膀胱癌樣本數(shù)。見表3。

表3 甲基化標(biāo)志物的敏感性和特異性

3 討論

膀胱癌分為尿路上皮癌、鱗狀細(xì)胞癌、腺細(xì)胞癌、小細(xì)胞癌、混合型癌、癌肉瘤以及轉(zhuǎn)移性癌等，其中以尿路上皮癌最常見，占90%以上。膀胱獨(dú)特的生理環(huán)境使得膀胱癌無創(chuàng)診斷成為可能，膀胱上皮細(xì)胞脫落至尿液中，可隨尿液排出體外，便于診斷。目前經(jīng)美國食品和藥物管理局批準(zhǔn)用于臨床的膀胱癌相關(guān)的無創(chuàng)診斷方法有尿細(xì)胞學(xué)、膀胱腫瘤抗原、核基質(zhì)蛋白22、ImmunoCyt、熒光原位雜交，但其均存在一定的缺點(diǎn)，并不適合大規(guī)模高危人群篩查。

DNA甲基化狀態(tài)易于DNA序列發(fā)生改變，其對(duì)環(huán)境變化的敏感性更高，在細(xì)胞發(fā)生癌變的早期即可發(fā)現(xiàn)甲基化狀態(tài)的變化。因此，利用甲基化標(biāo)志物診斷膀胱癌更適合高危人群篩查，且有利于發(fā)現(xiàn)癌前病變［5］。國外已有文獻(xiàn)［5－8，10］報(bào)道了膀胱癌特異的甲基化標(biāo)志物，并利用MSP及qMSP技術(shù)在尿液中鑒別膀胱癌患者與正常個(gè)體，取得了較好的效果。但是這些研究主要集中在歐美國家，不同人種間的DNA甲基化狀態(tài)差異較大，這些甲基化標(biāo)志物是否適用于中國人尚不清楚。

本研究選取了PCDH17、TCF21、VIM、POU4F2、ZNF154、TMEFF2、TWIST1、NID2共8個(gè)基因進(jìn)行篩選，經(jīng)過PCR產(chǎn)物電泳鑒定后選取PCDH17、POU4F2、TCF21、ZNF154作為甲基化標(biāo)志物進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。PCDH17是原鈣黏蛋白家族的成員之一。PCDH17基因位于13q21.1，主要編碼鈣黏蛋白相關(guān)的神經(jīng)受體，在特異的細(xì)胞與細(xì)胞之間的連接與功能中起作用［11］。有研究［12］報(bào)道PCDH17主要通過增加細(xì)胞間的黏附、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及生長控制而起到一定的抑癌作用。POU4F2是POU家族蛋白的一員，POU家族蛋白是包含有POU結(jié)構(gòu)域的一類轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。POU4F2維持視神經(jīng)元功能，研究［13］顯示POU4F2在乳腺癌中表達(dá)升高，起到促進(jìn)腫瘤生長的功能。TCF21基因位于人類6號(hào)染色體6q23-24區(qū)域，研究［14］報(bào)道TCF21基因能夠促使間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化為上皮細(xì)胞，這個(gè)過程的逆轉(zhuǎn)就是上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），TCF21基因的低表達(dá)會(huì)導(dǎo)致EMT，與多種腫瘤的侵犯和轉(zhuǎn)移有關(guān)。ZNF154與細(xì)胞的生長分化功能有關(guān)。ZNF154基因的高甲基化與非浸潤性膀胱癌的復(fù)發(fā)有關(guān)［10］。

通過在28例膀胱尿路上皮癌患者、10例尿路結(jié)石伴感染患者、30例健康志愿者尿液樣品中進(jìn)行qMSP檢測(cè)，確定了4個(gè)標(biāo)志物的檢出限分別為PCDH17 300.17、POU4F2 1.95、TCF21 154.56、ZNF154 427.99。最終發(fā)現(xiàn)以POU4F2單一甲基化標(biāo)志物可達(dá)到最好的效果，敏感性92.86%，特異性97.50%。

利用qMSP技術(shù)診斷膀胱癌具有極高的敏感性，對(duì)早期膀胱癌檢出率高。本研究在實(shí)驗(yàn)過程中共收集膀胱癌患者尿液75例，但提取出DNA符合qMSP實(shí)驗(yàn)要求的只有28例，與Reinert et al［10］尿液DNA的提取成功率（約30%）相當(dāng)。這可能是膀胱癌尿液甲基化診斷方式已誕生多年，但仍未推廣應(yīng)用于臨床的技術(shù)難題之一。尿液采集前受檢者的飲水、活動(dòng)狀態(tài)、尿液離體后的處理方式及時(shí)間、保存方式及提取方式等都有可能對(duì)提取成功率產(chǎn)生影響。要將尿液甲基化診斷膀胱癌推廣于臨床應(yīng)用，必須要改變現(xiàn)有的尿液DNA保存及提取方式，達(dá)到提取成功率90%以上，而后進(jìn)行大樣本、多中心研究及實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

［1］ Siegel R，Ma J，Zou Z，et al.Cancer statistics，2014［J］.CA Cancer J Clin，2014，64（1）：9－29.

［2］ Esteller M.Epigenetic gene silencing in cancer：the DNA hypermethylome［J］.Hum Mol Genet，2007，16（R1）：R50－9.

［3］ Laird P W.The power and the promise of DNA methylation markers［J］.Nat Rev Cancer，2003，3（4）：253－66.

［4］ Esteller M.Cancer epigenomics：DNA methylomes and histonemodification maps［J］.Nat Rev Genet，2007，8（4）：286－98.

［5］ Chung W，Bondaruk J，Jelinek J，et al.Detection of bladder cancer using novel DNA methylation biomarkers in urine sediments［J］.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2011，20（7）：1483－91.

［6］ Costa V L，Henrique R，Danielsen S A，et al.Three epigenetic biomarkers，GDF15，TMEFF2，and VIM，accurately predict bladder cancer from DNA-based analyses of urine samples［J］.Clin Cancer Res，2010，16（23）：5842－51.

［7］ Costa V L，Henrique R，Danielsen S A，et al.TCF21 and PCDH17 methylation：An innovative panel of biomarkers for a simultaneous detection of urological cancers［J］.Epigenetics，2011，6（9）：1120－30.

［8］ Renard I，Joniau S，van Cleynenbreugel B，et al.Identification and validation of the methylated TWIST1 and NID2 genes through real-time methylation-specific polymerase chain reaction assays for the noninvasive detection of primary bladder cancer in urine samples［J］.Eur Urol，2010，58（1）：96－104.

［9］ Lee C，Kim J，Shin S G，et al.Absolute and relative QPCR quantification of plasmid copy number in Escherichia coli［J］.J Biotechnol，2006，123（3）：273－80.

［10］Reinert T，Borre M，Christiansen A，et al.Diagnosis of bladder cancer recurrence based on urinary levels of EOMES，HOXA9，POU4F2，TWIST1，VIM，and ZNF154 hypermethylation［J］.PLoS One，2012，7（10）：e46297.

［11］Yagi T.Clustered protocadherin family［J］.Dev Growth Differ，2008，50 Suppl 1：S131－40.

［12］Haruki S，Imoto I，Kozaki K，et al.Frequent silencing of protocadherin 17，a candidate tumour suppressor for esophageal squamous cell carcinoma［J］.Carcinogenesis，2010，31（6）：1027－36.

［13］Fujita R，Ounzain S，Wang A C，et al.Hsp-27 induction requires POU4F2／Brn-3b TF in doxorubicin-treated breast cancer cells，whereas phosphorylation alters its cellular localisation following drug treatment［J］.Cell Stress Chaperones，2011，16（4）：427－39.

［14］Baum B，Settleman J，Quinlan M P.Transitions between epithelial and mesenchymal states in development and disease［J］.Semin Cell Dev Biol，2008，19（3）：294－308.

Diagnosis of bladder cancer based on urinary levels of POU4F2 hypermethylation

Wang Yongqiang1，2，Yu Yuan3，An Dan3，et al
（1Anhui Medical University，Hefei 230032；2Shenzhen Second People’s Hospital，Shenzhen 518035；3Beijing Genomics Institute at Shenzhen，Shenzhen 518083）

ObjectiveTo identify a panel of novel epigenetic biomarkers with high sensitivity and specificity that can be utilized in detection and diagnosis of bladder cancer using urine sediments.MethodsT24 cell lines that had been treated with bisulfite were used to examine the 8 methylated candidates that were previously reported in bladder cancer patients.Methylation levels of the candidate genes were quantified using the urine sediments from 28 bladder cancer patients，30 healthy volunteers and 10 infected urinary calculi patients by quantitative methylationspecific polymerase chain reaction（qMSP）.The four most efficacious and reliable biomarkers were selected after the sensitivity and specificity of each biomarker were further calculated and inspected.ResultsThe sensitivities of PCDH17，POU4F2，TCF21 and ZNF154 in the detection of bladder cancer were 46.43%，92.86%，39.29%and 46.43%respectively；the specificities of these biomarkers were 95.00%，97.50%，97.50%and 100.00%respectively.POU4F2 appeared as the best biomarkers among the four，showing a sensitivity of 92.86%and a specificity of 97.50%.ConclusionBladder cancer can be detected by a biomarker panel by using qMSP depending on the urine samples from patients.

bladder cancer；qMSP；hypermethylation；diagnosis

R 737.14；R 394.3；R 446.12

1000－1492（2015）02－0144－06

2014－10－13接收

國家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃（973計(jì)劃項(xiàng)目）（編號(hào)：2014CB745200）

1安徽醫(yī)科大學(xué)，合肥 2300322深圳市第二人民醫(yī)院，深圳 5180353深圳華大基因研究院，深圳 5180834南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院，廣州 510280

王永強(qiáng)，男，碩士研究生；吳 松，男，研究員，責(zé)任作者，E-mail：doctor＿wusong＠126.com；蔡志明，男，教授，博士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail：caizhiming2000＠163.com