宮小明， 楊麗君， 王洪濤， 馬榮檜， 丁葵英， 郭禮強， 孫 軍

(1.濰坊出入境檢驗檢疫局，山東濰坊 261041;2.威海出入境檢驗檢疫局，山東威海 264200)

液相色譜-高分辨質譜測定動物源性食品中均三嗪類藥物殘留

宮小明1， 楊麗君2， 王洪濤1， 馬榮檜1， 丁葵英1， 郭禮強1， 孫 軍1

(1.濰坊出入境檢驗檢疫局，山東濰坊 261041;2.威海出入境檢驗檢疫局，山東威海 264200)

[目的]建立動物源性食品中均三嗪類藥物及其代謝物殘留的液相色譜-高分辨質譜分析方法。[方法] 采用QuEChERS技術進行樣品前處理，利用Exactive液相色譜-高分辨質譜聯用系統(tǒng)進行檢測，建立了動物源性食品中地克珠利、妥曲珠利、妥曲珠利砜、妥曲珠利亞砜等4種均三嗪類藥物及其代謝物殘留的分析方法。[結果] 地克珠利、妥曲珠利、妥曲珠利砜、妥曲珠利亞砜4種均三嗪類藥物在2.0～50.0 μg/L范圍內線性關系良好(r2>0.99)。牛粉基質中4種化合物在5、10和20 μg/kg加標水平的回收率為74.5%～90.1%，相對標準偏差(RSD)為 15.4%～17.5%。[結論] 該方法穩(wěn)定、可靠，可用于動物源性食品中均三嗪藥類物殘留的檢測。

動物源性食品；均三嗪類藥物；QuEChERS；液相色譜-高分辨質譜

20世紀80年代出現的均三嗪類抗球蟲藥因其高效、廣譜、毒性低，在畜牧業(yè)生產中受到了廣泛重視。目前，生產中使用的均三嗪類藥物主要有地克珠利和妥曲珠利，地克珠利和妥曲珠利可以有效殺滅包括球蟲在內的多種原蟲，屬于高效抗球蟲藥物，妥曲珠利在動物體內主要代謝產物為妥曲珠利砜和妥曲珠利亞砜。

均三嗪類藥物的檢測主要有氣相色譜-電子捕獲法、液相色譜-紫外檢測法[1-3]。近年來，均三嗪類藥物殘留的高效液相色譜-串聯質譜分析方法國內外有較多的研究報道[4-7]，由于分子結構的原因，妥曲珠利和妥曲珠利砜無論在何種碰撞能量下都無法得到合適的子離子，因此只能選擇其母離子，利用SIM方式對其進行檢測，根據歐盟2003/181/EC 法規(guī)，低分辨質譜母離子只能算1分，遠低于確證4分的要求[8-9]，因此低分辨質譜只用于進行篩查，在遇到陽性結果時，必須進行進一步確證。軌道阱高分辨質譜儀具有較高的分辨率、掃描速度和靈敏度，可以有效去除基質干擾，實現高通量的目標物或非目標物篩選和高可靠性的確證定量分析[10-12]。筆者采用QuEChERS[13-15]技術進行樣品前處理，利用Exactive液相色譜-高分辨質譜聯用系統(tǒng)進行檢測，建立了動物源性食品中地克珠利、妥曲珠利、妥曲珠利砜、妥曲珠利亞砜等4種均三嗪類藥物及其代謝物殘留的分析方法。通過與低分辨質譜檢測結果的比較，有效避免了假陽性結果的出現。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

1.1.1儀器。靜電場軌道阱高分辨質譜儀(Thermofisher Exactive)；萬分之一天平(Mettler AE163)；均質器(IKA T25)；振蕩器(IKA MS1)；離心機(Eppendorf 5810)；氮吹儀(N-EVAP-111)。

1.1.2試劑與材料。地克珠利、妥曲珠利、妥曲珠利砜、妥曲珠利亞砜標準品，其化合結構式見圖1，均購自于Sigma-Aldrich公司；乙睛、甲醇、甲酸(色譜純)，水為Milli-Q超純水，使用前過0.45 μm濾膜；氯化鈉、中性氧化鋁(分析純)；N-丙基乙二胺粉(PSA)、二甲基十八碳硅烷粉(ODS)，均購自于Agela Technologies公司。

1.2 標準溶液的配制準確稱取10 mg地克珠利、妥曲珠利、妥曲珠利砜、妥曲珠利亞砜，用乙腈溶解，準確定容至100 ml，得到濃度為100 μg/ml的標準儲備液，避光于4 ℃下保存。使用時用基質空白提取液稀釋成適當濃度的標準工作液。為避免分析物分解，應當用棕色器皿保存，現用現配。

1.3 樣品處理準確稱取5.0 g樣品，置于100 ml塑料離心管中，加入5.0 g無水硫酸鎂，加入乙腈15 ml，在均質機上高速均質2 min左右，10 000 r/min高速離心10 min，取上清9 ml氮吹濃縮，乙腈定容到1.5 ml，加入150 mg ODS吸附劑玻璃試管中，1 400 r/min渦混2 min，離心后取1 ml上清液，氮吹，1 ml初始流動相定容，上機檢測。

1.4 液相色譜串聯質譜

1.4.1液相色譜條件。色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱(3.0 mm ×100 mm，1.8 μm)；柱溫為35 ℃；流速為0.3 ml/min，進樣量為10 μl；流動相：A為0.1%甲酸水，B為甲醇；梯度洗脫程序：0～2.0 min(10% B)，2.5～6.0 min(10%B～90%B)，6.0～9.0 min(90%B)，10.0～12.0 min(10%B)平衡3 min。

注：A.地克珠利；B.妥曲珠利；C.妥曲珠利亞砜；D.妥曲珠利砜。圖1 4種化合物的分子結構

表1 4種化合物的質譜參數

1.4.2質譜條件。全掃描正/負離子模式，掃描質量范圍m/z200～1 000；分辨率為25 000；掃描速度為4 Hz；自動增益控制(AGC)目標值為10 e6；噴霧電壓為3 500 V；離子傳輸管溫度為320 ℃；鞘氣氣壓為35 Au；輔助氣壓為10 Au；離子源溫度為300 ℃。4種化合物的質譜參數如表1所示。

2 結果與分析

2.1 提取條件的選擇均三嗪類藥物屬于弱極性物質，易溶于甲苯、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、乙腈等有機溶劑，微溶于正己烷和石油醚，在水中的溶解度極低。筆者分別考察了甲醇、乙酸乙酯、乙腈作為提取溶劑，均可以得到良好的提取效果，乙腈能更有效地沉淀蛋白，減少雜質干擾，同時乙腈也有利于下一步使用QuEChERS技術進行凈化，因此選擇乙腈作為提取溶劑。

2.2 各種吸附劑粉對回收率的影響QuEChERS技術是2003年由美國化學家Steven J.Lehotay和德國的Michelangelo Anastassiadas[13-14]提出的一種快速、簡單、低成本的樣品處理方法。該方法采用分散固相萃取(Dispersive-SPE)凈化法，即提取液直接加入吸附劑粉進行凈化，經離心后上清液上機檢測。

為了選擇合適的吸附劑，首先考察各種吸附劑粉對回收率的影響，取2 ml乙腈溶解的濃度為0.05 μg/ml的4種藥物的混標溶液，分別加入150 mg不同的吸附劑，經振蕩、離心后，取上清液1 ml，上機，試驗重復6次，計算平均回收率。從表2可以看出，ODS對目標物的吸附較少，同時又可以很好地吸附脂肪酸、維生素、色素、甾醇等雜質，因此選擇ODS作為最終的吸附劑。

表2 不同吸附劑對目標化合物回收率的影響

2.3 牛粉樣品高分辨質譜與低分辨質譜檢測結果的比較由于分子結構的原因，妥曲珠利和妥曲珠利砜無論在何種碰撞能量下都無法得到合適的子離子，因此只能利用選擇離子掃描(SIM)模式對母離子進行檢測，QuEChERS技術的優(yōu)點是簡單、快速，缺點是凈化效果差，此前利用低分辨三重四級桿質譜在(SIM)模式對樣品進行檢測，可以滿足篩查的要求，但是在遇到復雜基質干擾的情況下，就必須進行進一步確證。軌道阱高分辨質譜儀具有較高的分辨率和靈敏度，可以有效去除基質干擾。從圖2可以看出，在妥曲珠利4.3 min左右的出峰時間，牛粉樣品有一個明顯的峰；從圖3可以看出，在5.79 min左右妥曲珠利的出峰時間，牛粉樣品既提取不到妥曲珠利的精確質量數也得不到對應的色譜峰，因此可以判斷牛粉為陰性樣品，低分辨質譜下樣品的峰應該為雜質干擾，為假陽性結果。

注：A.牛粉樣品；B.各類藥物標準品；C.牛粉加標樣品。圖2 牛粉樣品、各類藥物標準品和牛粉加標樣品的低分辨色譜圖

注：A.牛粉樣品；B.各類藥物標準品；C.牛粉加標樣品。圖3 牛粉樣品、各類藥物標準品和牛粉加標樣品高分辨色譜圖和在5.79 min的高分辨質譜圖

2.4 線性范圍、定量限、回收率和精密度用基質提取液配制一系列不同濃度的4種藥物混合標準溶液，依次進樣，以峰面積為縱軸，以濃度為橫軸，繪制校準曲線，由工作站可直接計算回歸方程及相關系數。由表3可知，4種分析物在2.0～50.0 μg/L范圍內線性關系良好。以20 μg/kg空白牛粉添加色譜圖，根據10倍信噪比計算定量限，4種化合物的定量限均為2 μg/kg，能滿足日本、歐盟等國家規(guī)定的最大殘留限量。

用空白樣品加標方法進行回收率和精密度試驗。分別對牛粉進行3個不同水平的加標，每個水平平行測定7次，計算回收率和相對標準偏差。由表3可知，4種化合物在2、10、20 μg/kg加標水平的回收率為74.5%～90.1%，相對標準偏差(RSD)為15.4%～17.5%。

表3 4種藥物的回歸方程、相關系數、回收率與相對標準偏差

3 小結

筆者將最先應用于農藥多殘留分析的QuEChERS技術引入地克珠利、妥曲珠利、妥曲珠利砜、妥曲珠利亞砜等4種均三嗪類藥及其代謝物殘留分析的樣品前處理過程，針對妥曲珠利、妥曲珠利砜無法得到碎片離子，只能采用SIM模式檢測母離子的特點，借助靜電場軌道阱高分辨質譜儀分辨率、出色的質量精度、高靈敏度和寬動態(tài)范圍的特點對樣品進行檢測，與高效液相色譜法-串聯四極桿質譜法相比可以更好地去除基質干擾，靈敏度大大提高。該方法具有適用性強、簡單快速、經濟等特點，各項技術指標均能滿足日常檢測分析的要求，應用于實際樣品檢測，取得了滿意的效果。

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Determination of Diclazuril, Toltrazuril and Metabolite Residues in Animal-derived Food by Liquid Chromatography—High Resolution Mass Spectrometry

GONG Xiao-ming1， YANG Li-jun2, WANG Hong-tao1et al

(1.Weifang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Weifang, Shandong 261041;2.Weihai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Weihai,Shandong 264200)

[Objective] The research aimed to establish the detecting method of liquid chromatography—high-resolution mass spectrometry for detecting the residues of diclazuril，toltrazuril and its metabolites in animal-derived food. [Method] The samples were pre-treated by using QuEChERS technology and detect by using Exactive liquid chromatography—high resolution mass spectrometry. The detecting method of liquid chromatography—high-resolution mass spectrometry for detecting the residues of diclazuril，toltrazuril and its metabolites in animal-derived food was established. [Result] Diclazuril，toltrazuril and its metabolites showed a good linear correlation in the range of 2.0-50.0 μg/L(r2>0.99). The average recoveries of these four compounds in beef power at the spiked levels of 2，10，20 μg/kg was 74.5%-90.1%, and the relative standard deviations(RSD)was 15.4%-17.5%. [Conclusion] This method was stable and reliable, and so it could be used for detecting diclazuril, toltrazuril and its metabolites.

Animal-derived food; 1,3,5-triazine; QuEChERS; Liquid chromatography—high-resolution mass spectrometry

國家質檢總局科研項目(201310143)。

宮小明(1976- )，男，山東萊西人，高級工程師，碩士，從事獸藥殘留、真菌毒素及添加劑研究。

2015-08-13

S 851.347

A

0517-6611(2015)28-114-04