吳青青，胡小京，黃 偉*，楊雪蓮，夏景風，魯 周

(1.貴州省園藝研究所，貴州貴陽 550006；2.貴州大學農學院，貴州貴陽 550006)

流式細胞儀測定百合花粉倍性的研究

吳青青1，胡小京2，黃 偉1*，楊雪蓮2，夏景風2，魯 周1

(1.貴州省園藝研究所，貴州貴陽 550006；2.貴州大學農學院，貴州貴陽 550006)

[目的]為利用百合未減數(shù)花粉進行有性多倍化育種。[方法] 利用流式細胞儀測定百合花粉的倍性，以Marlon、Viviana的花粉為材料，以葉片為對照，比較兩種不同細胞核提取液的效果差異。[結果] CyStain UV Precise T提取液明顯優(yōu)于WPB提取液；Marlon、Vivian葉片測定結果顯示其為二倍體，花粉測定的圖像顯示兩個品種都能自發(fā)產生2n花粉。[結論] 流式細胞儀可以快速地測定百合花粉的倍性。

流式細胞儀；百合；花粉；倍性

百合為百合科百合屬多年生球根花卉，性喜高原山地冷涼氣候。野生種在我國云貴高原等海拔2 000 m左右地區(qū)廣泛分布，其切花商業(yè)品種也多種植于海拔2 300 m左右的地區(qū)。

百合商業(yè)品種是全球花卉市場主流切花之一，受到歐美、亞洲消費者的廣泛喜愛，具有廣闊的市場。百合商業(yè)品種有高度雜合性，染色體同源性較差。這些雜交種通常都會自發(fā)地產生未減數(shù)花粉。這些花粉很多能夠正常萌發(fā)，可以作為有性多倍化育種的材料，用于雜交授粉[1-5]。

流式細胞技術(Flow cytometry)是20世紀80年代興起的新技術，有快速、簡單、通量大的特點，被廣泛地用于基礎研究。流式細胞儀常被用于鑒定植物的倍性，通過檢測植株G0/G1峰的核酸含量可以判斷出植物的倍性[6-13]。將流式細胞儀用于百合花粉倍性的檢測，可以快速地知道某一品種是否能產生未減數(shù)花粉，之后則可以通過一些技術手段對花粉進行分離，篩選出未減數(shù)花粉用于雜交授粉。百合花粉一般為橢圓形，長徑在100 μm左右，體積微小，花粉壁較厚，將之破碎后釋放出足夠量的游離細胞核用于流式細胞儀檢測較困難。筆者借鑒了同行經驗，總結出適合的方法，能夠較方便地制備百合花粉細胞核懸浮液，操作簡單，重復性好。

1 材料與方法

1.1 試驗材料供試材料為2個百合商業(yè)品種Marlon、Viviana花粉，以各自葉片為對照。所有材料均種植于貴州省園藝研究所花卉大棚。流式細胞儀為Partec公司生產CyFlow Space，染色液為Partec公司生產的CyStain UV Ploidy DAPI Staining Solution。

1.2 試驗方法

1.2.1樣品采集。采集葉片，放入冰盒中帶回試驗室，清洗干凈后晾干，備用；在百合花朵完全綻放后，用小塑料袋收集已成熟的花粉，做好標記，并帶回試驗室，然后將花粉平鋪在培養(yǎng)皿中，放在30 ℃培養(yǎng)箱內保存，備用。

1.2.2細胞核的提取和染色。使用WPB(Woody Plant Buffer)和CyStanin UV Precise T兩種提取液制備Marlon葉片細胞核懸浮液，比較試驗效果。CyStain UV Precise T購自于Partec公司；WPB含濃度1% PVP-10、0.2 mol/L Tris-HCl、2 mmol/L Na2EDTA、4 mmol/L MgCl2、10 mmol/L Sodium metabisulfite、86 mmol/L NaCl、1%(V/V)Triton X-100，pH 7.5[14]。

1.2.3葉片細胞核懸浮液制備方法。在6 cm玻璃培養(yǎng)皿中加入0.5 cm*0.5 cm大小鮮嫩葉片，滴加400 μl細胞核提取液浸沒樣品，用鋒利刀片切碎葉片至糊狀加入2 ml染色液染色后，30 μm篩網過濾，上機測定。

1.2.4花粉細胞核懸浮液制備方法。在6 cm玻璃培養(yǎng)皿中加入大量花粉，最好為干燥過的花朵，滴加400 μl的CyStanin UV Precise T細胞核提取液浸沒樣品，攪拌均勻后靜置5～20 min，待成糊狀后用鋒利刀片反復砍切20 min，加入2 ml染色液染色后，30 μm篩網過濾，上機測定。同時，可斟量添加染色液以保證細胞核濃度。

1.2.5流式細胞儀倍性測定。DAPI染色的雙鏈核酸在365 nm的激光下激發(fā)放出藍色熒光，設置增益電壓為268，上樣測定。

2 結果與分析

2.1 細胞核提取液對倍性測定的影響利用兩種不同的提取液處理Marlon葉片，得到細胞核懸浮液。加入染色液染色后，用流式細胞儀檢測。由圖1、2可知，在由WPB提取液得到的圖像上能夠看到G0/G1峰，但并不明顯，細胞碎片較多，對G0/G1峰的下部有所掩蓋；在用CyStain UV Precise T提取液得到的圖像上G0/G1峰清晰，細胞碎片相對較少，試驗效果明顯優(yōu)于WPB提取液。

2.2 葉片倍性的測定Marlon、Viviana葉片利用CyStain UV Precise T提取液制備細胞核懸浮液，上機測定，以此作為花粉倍性測定的對照。由圖1、3可知，兩個百合品種都是二倍體，GO/G1峰在橫坐標100左側，Marlon GO/G1峰的橫坐標平均數(shù)為84.65，CV值為9.88%，Viviana為80.51，CV值為11.13%。Marlon為OT遠緣雜交種，Viviana為O雜交種，都是近幾年剛培育出的新品種。

2.3 花粉倍性的測定利用CyStain UV Precise T提取液制備花粉細胞核懸浮液，上機檢測。由圖4、5可知，除了單倍體峰，在兩份花粉中都檢測出二倍體峰。百合為二細胞花粉，包含一個大的單倍體營養(yǎng)細胞和一個小的單倍體生殖細胞，在經過花粉破碎、細胞核提取液的裂解以及30 μm篩網過濾之后基本得到的懸浮液都應該是單一的細胞核和較小的細胞碎片，此時出現(xiàn)的二倍體峰應該為2n花粉細胞核所產生的信號，也就是說，這兩個品種都可以自發(fā)地產生2n配子。據(jù)圖像，發(fā)現(xiàn)Marlon花粉單倍體峰的橫坐標平均數(shù)為49.52，CV值為7.83%，二倍體峰為92.03，CV值為12.29%；Viviana為單倍體峰為38.90，CV值為8.51%，二倍體峰為72.46，CV值為8.17%。CV值表示取樣的異質性，CV值越高則表示取樣同質性差。

Marlon花粉二倍體峰底部向橫坐標右側有延伸。這部分可能是雜質信號，也可能是其他倍性的花粉細胞核信號，影響二倍體峰的分析數(shù)據(jù)，使得平均值大于二倍體葉片的數(shù)值，但從主峰的位置上來看與葉片的GO/G1峰是吻合的。

Viviana的二倍體峰平均值則略小于葉片數(shù)值。這是由二倍體峰和單倍體峰之間的細胞核信號較多造成的。這些信號可能是由非整倍體花粉造成的。單獨取出Viviana的二倍體主峰進行分析，發(fā)現(xiàn)平均值為82.89，CV值為24.02%，其數(shù)值基本與二倍體葉片相當。

圖1 CyStain UV Precise T 處理Marlon葉片

圖2 WPB處理Marlon葉片

圖3 CyStain UV Precise T 處理Viviana葉片

3 討論

百合花粉較難破碎。如何有效地破碎花粉壁是保證試驗結果的關鍵問題。在試驗初期階段，筆者嘗試了液氮、砂紙、離心等手段，但效果都不好，最后還是采用刀片砍切的辦法，操作簡單，但是比較費力，需連續(xù)20 min才能保證較好的破碎量，花粉需求量也較大。

對于葉片雜質問題，在制備葉片細胞核懸浮液的過程中，需要將葉片破碎至糊狀，才能保證懸浮液有合適的細胞核濃度，造成懸浮液中細胞碎片較多。研究表明，在GO/G1峰左側能夠看到大量明顯的雜質信號。這些雜質信號在進行分析時會影響數(shù)據(jù)的準確性，需要對其進行遮擋。

對于流速與密度問題，在試驗中發(fā)現(xiàn)流式細胞儀的檢測能力是有限的，在每秒通過信號數(shù)超過一定值的情況下，檢測到的信號會被削弱。比如，在相同上樣流速的情況下，信號密度為30個/s，峰所在的位置橫坐標值為85，如果信號密度達到350個/s，那么峰所在的位置橫坐標值會降低到55。考慮到這種情況，筆者對樣品濃度和上樣流速都提出要求。如果樣品濃度過高，則很可能影響結果的準確性，同理在高流速下，單位時間經過的樣品數(shù)量過高，就等同于提高檢測樣品的濃度，必然也會影響熒光信號的數(shù)值。這個問題根源還是由于流式細胞儀的檢測能力有限。

圖4 Marlon花粉圖像

圖5 Viviana花粉圖像

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Study on Determination of Lilium Pollen Ploidy by Flow Cytometry

WU Qing-qing1, HU Xiao-jing2, HUANG Wei1*et al

(1.Horticulture Research Institute of Guizhou, Guiyang, Guizhou 550006; 2. College of Horticulture，Guizhou University, Guiyang, Guizhou 550006)

[Objective]For the use of lihium unreduced pollen to sexual polyploidization breeding.[Method] We made use of flow cytometry to determine lilium pollen ploidy by taking the pollen of Marlon and Viviana as materials and leaves for comparison. [Result] By comparing the effect difference of two different cell nuclear extracts, the extract of CyStain UV Precise T was significantly better than that of WPB. Marlon and Viviana leaves measurement results showed that they were diploids and the pollen measurement image showed the two varieties could produce 2npollen on their own. [Conclusion] Flow cytometry can be used to quickly measure lilium pollen ploidy.

Flow cytometry; Lily; Pollen; Ploidy

國家自然科學

(31160176)；貴州省科技廳項目(黔科合J字[2010]2090號；黔科合NY字[2011]3074號；黔科合成轉字[2014]5027號；黔科合NY字[2015]3012-1號)；貴州省農科院院專項(黔農科院院專項[2008]032號)。

吳青青(1982- )，男，山東平度人，助理研究員，碩士，從事百合育種與種球繁育方面的研究。*通訊作者，助理研究員，碩士，從事植物遺傳育種方面的研究。

2015-08-22

S 603

A

0517-6611(2015)28-004-03