張 濤，王 芳，朱素敏，毛 偉，黃 霞

(重慶市血液中心輸血研究所 400015)

論著·臨床研究

STR-PCR在異基因造血干細(xì)胞移植中植入效果監(jiān)測(cè)的應(yīng)用

張 濤，王 芳，朱素敏，毛 偉，黃 霞△

(重慶市血液中心輸血研究所 400015)

目的 建立適用于重慶地區(qū)造血干細(xì)胞移植后監(jiān)測(cè)的PCR擴(kuò)增熒光標(biāo)記短串聯(lián)重復(fù)序列(STR-PCR)檢測(cè)方法，為造血干細(xì)胞移植療效評(píng)價(jià)提供可靠依據(jù)。方法收集術(shù)前供者、受者EDTA抗凝靜脈血及受者術(shù)后不同時(shí)間EDTA抗凝靜脈血，采用STR-PCR技術(shù)對(duì)65例allo-HSCT患者的15個(gè)STR位點(diǎn)和1個(gè)性別位點(diǎn)進(jìn)行分析。結(jié)果65例異基因造血干細(xì)胞移植術(shù)的病例，術(shù)后檢測(cè)患者STR位點(diǎn)呈現(xiàn)受者源、供者源和供受者嵌合3種狀態(tài)，有54例的移植后監(jiān)測(cè)呈現(xiàn)供者源狀態(tài)，8例移植后監(jiān)測(cè)到嵌合體狀態(tài)，3例移植后監(jiān)測(cè)呈現(xiàn)受者源狀態(tài)，且發(fā)現(xiàn)3種狀態(tài)之間可相互轉(zhuǎn)化，每種狀態(tài)的最早檢出時(shí)間和持續(xù)時(shí)間及轉(zhuǎn)化時(shí)間存在差異,其中出現(xiàn)供者源狀態(tài)的最早時(shí)間是術(shù)后第17天，持續(xù)最長(zhǎng)時(shí)間為7多個(gè)月。而出現(xiàn)嵌合狀態(tài)的最早時(shí)間為術(shù)后第16天，最晚在移植后5個(gè)月才監(jiān)測(cè)到嵌合。在嵌合持續(xù)時(shí)間上，持續(xù)時(shí)間最短為2個(gè)月，持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)者達(dá)7個(gè)月。結(jié)論allo-HSCT患者術(shù)后STR位點(diǎn)轉(zhuǎn)化情況存在差異，要建立起適用于該地區(qū)的STR-PCR方法需要正確留取供受者標(biāo)本，同時(shí)應(yīng)掌握好恰當(dāng)?shù)臋z測(cè)時(shí)機(jī)和適宜的STR位點(diǎn)。

造血干細(xì)胞移植；PCR擴(kuò)增熒光標(biāo)記；短串聯(lián)重復(fù)序列；效果監(jiān)測(cè)

造血干細(xì)胞移植術(shù)后植入狀況的監(jiān)測(cè)對(duì)于判斷移植成功與否及疾病轉(zhuǎn)歸具有重要影響[1]，一直以來(lái)也是臨床醫(yī)生較為關(guān)注的一個(gè)問(wèn)題。近年來(lái)通過(guò)PCR擴(kuò)增熒光標(biāo)記的短串聯(lián)重復(fù)序列(shore tandem repeat,STR)并結(jié)合毛細(xì)管電泳技術(shù)，可以敏感顯示出造血干細(xì)胞移植物的植入狀態(tài)，目前已有諸多文獻(xiàn)報(bào)道了其在造血干細(xì)胞移植后監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值[2-5]。但限于技術(shù)支持、標(biāo)準(zhǔn)缺乏等方面的原因，臨床對(duì)這一技術(shù)的應(yīng)用仍少見(jiàn)和不規(guī)范，實(shí)驗(yàn)人員對(duì)監(jiān)測(cè)時(shí)機(jī)、位點(diǎn)選擇等缺乏統(tǒng)一意見(jiàn)。因此，筆者擬采用STR-PCR方法，對(duì)重慶地區(qū)65例接受異基因造血干細(xì)胞移植術(shù)患者移植前、后及供者的基因型進(jìn)行檢測(cè)和追蹤監(jiān)測(cè)，探討STR-PCR方法在異基因造血干細(xì)胞移植植入監(jiān)測(cè)中有關(guān)監(jiān)測(cè)時(shí)機(jī)、位點(diǎn)選擇、指導(dǎo)意義等方面的具體應(yīng)用，以及建立適用于本地區(qū)人群特點(diǎn)的異基因造血干細(xì)胞移植植入后的STR-PCR監(jiān)測(cè)方法。

1 資料與方法

1.1 一般資料 研究者來(lái)自第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院、重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院、重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院、第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院等幾所三甲醫(yī)院血液科，于2009～2012年行異基因造血干細(xì)胞移植的血液病患者共計(jì)65例。其中外周血干細(xì)胞移植60例，臍帶血移植5例。其中男30例，女35例；患者移植年齡0.9～58.0歲，中位年齡29歲；診斷為白血病患者51例，地中海貧血1例，再生障礙性貧血6例，骨髓增生障礙綜合征4例，淋巴瘤3例，免疫缺陷型高免疫球蛋白M(IgM)連鎖血癥1例。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 采集前與臨床醫(yī)生溝通，交流STR-PCR技術(shù)要點(diǎn)、實(shí)驗(yàn)原則、臨床意義等。按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)要求，移植前收集供、受者術(shù)前新鮮EDTA抗凝靜脈血5 mL即時(shí)送檢，移植后每7～15天收集1次受者外周血樣，至受者達(dá)到可評(píng)價(jià)的終點(diǎn)(即臨床治愈或死亡)時(shí)為止。

表1 65例造血干細(xì)胞移植病例植入存活狀況檢測(cè)結(jié)果(n)

表2 存在嵌合現(xiàn)象的移植病例嵌合監(jiān)測(cè)情況

1.2.2 基因組DNA提取 分別取新鮮EDTA抗凝全血300 μL，按Gentra鹽析法DNA提取試劑盒說(shuō)明的步驟進(jìn)行DNA提取。用紫外分光光度儀測(cè)定DNA水平后4 ℃保存。

1.2.3 DNA擴(kuò)增程序 對(duì)16個(gè)STR位點(diǎn)(D8S1179、D21S11、D7S820、CSF1PO、D3S1358、TH01、D13S317、D16S539D、2S1338、D19S433、VWA、TPOX、D18S51、D5S818、FGA和Amelogenin性別判斷標(biāo)記)進(jìn)行PCR復(fù)合擴(kuò)增：PCR反應(yīng)總體積25 μL，其中含Re-mix液10 μL，Primer set液5 μL，Gold Taq酶0.5 μL，模板DNA 10 μL。按下述條件進(jìn)行PCR反應(yīng)(2700型擴(kuò)增儀)：95 ℃11 min→(94 ℃ 1 min→59 ℃ 1 min→72 ℃ 1 min)×28 個(gè)循環(huán)→60 ℃ 60 min→4～25 ℃保溫。

1.2.4 電泳樣品制備 取1.5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物,加入Hi-Di甲酰胺10.0 μL和GeneScan-500Liz分子量標(biāo)記0.7 μL對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行變性，按1.5∶10.0∶0.7比例混勻后于95 ℃變性3 min,隨即冰浴3 min。

1.2.5 電泳 取電泳樣品2 μL于96孔板內(nèi),ABI 3100利用POP-4(Performance Optimized Polymer4)膠、36 cm毛細(xì)管進(jìn)行全自動(dòng)電泳。電壓3 000 V收集1.5 h。利用Data Collection收集數(shù)據(jù)。用Gene-MapperTMSoftware version 3．5根據(jù)DNA片斷長(zhǎng)度及等位基因梯分析各位點(diǎn)基因型。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，分類(lèi)變量資料采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 65例造血干細(xì)胞移植病例植入存活狀況檢測(cè)結(jié)果 65例造血干細(xì)胞移植病例中，有2例僅監(jiān)測(cè)到受者源狀態(tài)，沒(méi)有出現(xiàn)供者基因型，顯示移植失敗。54例監(jiān)測(cè)完全表現(xiàn)為供者源型，其中監(jiān)測(cè)到出現(xiàn)供者源狀態(tài)的最早時(shí)間是術(shù)后第17天，最長(zhǎng)時(shí)間為7個(gè)多月后患者仍為供者源狀態(tài)。其余8例監(jiān)測(cè)到有供受者嵌合狀態(tài)，其中2例先為供者源狀態(tài)后轉(zhuǎn)化為嵌合狀態(tài)，2例先由嵌合狀態(tài)最終轉(zhuǎn)化為供者源狀態(tài)，此4例轉(zhuǎn)化時(shí)間均存在差異。其余4例監(jiān)測(cè)一直為嵌合狀態(tài)。監(jiān)測(cè)出現(xiàn)嵌合狀態(tài)的最早時(shí)間為術(shù)后第16天，最晚在移植后5個(gè)月。在嵌合持續(xù)時(shí)間上，持續(xù)時(shí)間最短為2個(gè)月，持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)者達(dá)7個(gè)月。同時(shí)根據(jù)監(jiān)測(cè)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)HLA-ABDR不全相合移植和全相合移植之間移植效果存在差異，3/6～5/6相合移植中監(jiān)測(cè)到轉(zhuǎn)化為供者源狀態(tài)的比例是58%，而6/6相合移植中轉(zhuǎn)化為供者源狀態(tài)的比例是92.45%，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.90，P<0.01)，HLA全相合移植效果優(yōu)于3/6～5/6相合移植，見(jiàn)表1。

2.2 8例監(jiān)測(cè)到嵌合狀態(tài)患者的具體結(jié)果 不同患者嵌合狀態(tài)的出現(xiàn)時(shí)間并不一致，即使是同一患者，其嵌合狀態(tài)也存在變化。受嵌合比例的變化和檢測(cè)能力的影響，在具體檢出嵌合體的位點(diǎn)上也存在變化。即使已全轉(zhuǎn)為供者源狀態(tài)后患者仍有可能轉(zhuǎn)變?yōu)榍逗象w狀態(tài)，通過(guò)臨床信息追蹤，發(fā)現(xiàn)嵌合狀態(tài)的出現(xiàn)常伴隨患者疾病復(fù)發(fā)或加重甚至死亡等情況，且65例病例中在整個(gè)監(jiān)測(cè)過(guò)程中監(jiān)測(cè)到有嵌合現(xiàn)象的患者疾病預(yù)后均較差，見(jiàn)表2。

表3 16例HSCT患者中15個(gè)STR基因位點(diǎn)的區(qū)分度

2.3 排除性別位點(diǎn)后的15個(gè)STR基因位點(diǎn)的區(qū)分度 由于醫(yī)院采集標(biāo)本的困難及患者依從性的原因，65例病例患者在移植前和移植后均留有標(biāo)本進(jìn)行STR檢測(cè)，并能與供者的STR結(jié)果進(jìn)行比較的例數(shù)為16例。計(jì)算這16例患者移植前后15個(gè)STR位點(diǎn)的各自的區(qū)分度發(fā)現(xiàn)，區(qū)分度最低者TPOX位點(diǎn)為50.00%，最高者D8S1179位點(diǎn)為93.78%，其余多數(shù)位點(diǎn)區(qū)分度波動(dòng)在75.00%～87.50%，平均區(qū)分度為78.75%,見(jiàn)表3。

3 討 論

STR由于具有高度的多態(tài)性和遺傳穩(wěn)定性，作為遺傳學(xué)DNA分子標(biāo)記，目前已廣泛應(yīng)用于遺傳制圖、連鎖性分析、親子鑒定、疾病基因定位和物種多態(tài)性研究等諸多領(lǐng)域[6]。但在各個(gè)地區(qū)，具體應(yīng)用STR-PCR技術(shù)時(shí)均面臨諸多的實(shí)際問(wèn)題,比如標(biāo)本的留取，檢測(cè)時(shí)機(jī)及檢測(cè)位點(diǎn)的選取等。如何建立適用于本地區(qū)的異基因造血干細(xì)胞移植植入后的STR-PCR監(jiān)測(cè)方法，無(wú)疑值得探討。

首先面臨的一個(gè)問(wèn)題便是監(jiān)測(cè)標(biāo)本的選擇問(wèn)題。在已有的研究中，有選取患者移植前后血液標(biāo)本進(jìn)行比對(duì)的，有選取患者移植后血液標(biāo)本和口腔黏膜標(biāo)本進(jìn)行比對(duì)的，在這些研究中，往往忽略了對(duì)供者標(biāo)本的留取并對(duì)其STR位點(diǎn)進(jìn)行分析和比對(duì)。單純留取患者移植前后血液標(biāo)本進(jìn)行自身比對(duì)或者移植后與口腔黏膜標(biāo)本進(jìn)行自身比對(duì)，均不能直觀、可靠地作為參考，并且有研究報(bào)道隨著移植時(shí)間的延長(zhǎng)，患者口腔黏膜也有轉(zhuǎn)化為供者型的可能。本實(shí)驗(yàn)中留取移植前供、受者血液標(biāo)本進(jìn)行STR位點(diǎn)分析，移植后再留取患者標(biāo)本進(jìn)行STR位點(diǎn)分析，并與移植前標(biāo)本及供者血液標(biāo)本進(jìn)行比對(duì)，直觀可靠、清晰明了地觀察到患者移植后的嵌合狀態(tài)，有效排除了許多因素的影響。強(qiáng)調(diào)留取供者標(biāo)本及移植前患者標(biāo)本，雖然有可能增加患者檢測(cè)費(fèi)用，但隨著此項(xiàng)技術(shù)的普及和檢測(cè)標(biāo)本量的增加，相關(guān)的檢測(cè)費(fèi)用會(huì)進(jìn)一步下降。

其次，應(yīng)用STR-PCR技術(shù)時(shí)監(jiān)測(cè)時(shí)機(jī)的選擇也是一個(gè)值得重視的問(wèn)題。嵌合體的形成是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。完全的供者源狀態(tài)和混合嵌合體可以出現(xiàn)在移植后的不同時(shí)期,并可隨病情的演化和時(shí)間的推移而相互轉(zhuǎn)化,因此對(duì)嵌合體進(jìn)行持續(xù)監(jiān)測(cè)比間斷性監(jiān)測(cè)更具有臨床指導(dǎo)意義。只有選擇了適當(dāng)?shù)臋z測(cè)時(shí)間,才能更好地監(jiān)測(cè)到嵌合體的變化狀況及獲得有意義的信息,以便及時(shí)做出相應(yīng)的治療措施。在本實(shí)驗(yàn)中，觀察到了65例病例中轉(zhuǎn)變?yōu)楣┱咝偷淖钤鐣r(shí)間和最遲時(shí)間，同時(shí)也觀察到嵌合體出現(xiàn)的最早時(shí)間和最遲時(shí)間，并了解了嵌合體可以長(zhǎng)期持續(xù)存在一段時(shí)間等情況。綜合已有的研究報(bào)道，筆者認(rèn)為移植后最遲不超過(guò)7 d即應(yīng)留取移植檢測(cè)標(biāo)本，在最初的前3個(gè)月內(nèi)，應(yīng)每7～15天留取標(biāo)本，加強(qiáng)早期的移植后患者嵌合率的監(jiān)測(cè)。隨著病情發(fā)生變化，更應(yīng)及時(shí)留取標(biāo)本，以便發(fā)現(xiàn)移植后的轉(zhuǎn)變和發(fā)展。

最后，STR位點(diǎn)選擇是PCR-STR技術(shù)在干細(xì)胞移植中能否應(yīng)用成功的關(guān)鍵。STR位點(diǎn)等位基因數(shù)目眾多，分布情況存在人群、地區(qū)差異性[7],如何選擇位點(diǎn)錯(cuò)配少,個(gè)體識(shí)別能力高、易于分型而且等位基因頻率在人群中分布較好的STR位點(diǎn)，真正建立適用于本地區(qū)的異基因干細(xì)胞移植植入后的PCR-STR監(jiān)測(cè)方法，是本研究主要探討的問(wèn)題。本實(shí)驗(yàn)中筆者與重慶市司法鑒定所合作，根據(jù)其既往的STR群體遺傳資料研究表明，15個(gè)STR基因座(CSF1PO、D13S317、D16S539、D18S51、D19S433、D21S11、D2S1338、D3S1358、D5S818、D7S820、D8S1179、FGA、TH01、TPOX、vWA)在重慶地區(qū)漢族人群中有很高的遺傳多態(tài)性，累積DP>0.999 999 999，累積PE值為0.999 999 042，適用于作為重慶地區(qū)漢族人群個(gè)體識(shí)別、親子鑒定的科學(xué)依據(jù)及建立該地區(qū)漢族人群的STR基因數(shù)據(jù)庫(kù)的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)[8]。因此，筆者選擇這15個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行復(fù)合擴(kuò)增用于HSCT移植后分析的位點(diǎn)。結(jié)果顯示，選擇的15個(gè)STR位點(diǎn)具有高度多態(tài)性和區(qū)別能力,其中區(qū)分度最高者達(dá)93.78%,最低的區(qū)分度亦有50.00%。考慮到進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的這16例患者大多數(shù)為直系親屬間移植，STR位點(diǎn)的同源性降低了檢測(cè)的區(qū)分度，倘若是在非親緣關(guān)系移植間的監(jiān)測(cè)中，則15個(gè)STR位點(diǎn)的檢測(cè)區(qū)分度應(yīng)尚能大幅提升，因此15個(gè)STR基因位點(diǎn)對(duì)患者移植前后的移植狀態(tài)能很好地監(jiān)測(cè),可聯(lián)合應(yīng)用于移植后植入狀態(tài)的監(jiān)測(cè)。

綜上所述，在干細(xì)胞移植后正確留取供、受者標(biāo)本，掌握好恰當(dāng)?shù)臋z測(cè)時(shí)機(jī)，采用適宜的STR位點(diǎn)進(jìn)行STR-PCR監(jiān)測(cè)，建立起真正適用于本地區(qū)的STR-PCR方法，可以早期識(shí)別移植物植入、檢測(cè)殘留微小病變、預(yù)測(cè)移植效果等，這樣才能真正發(fā)揮STR-PCR方法的最大優(yōu)勢(shì)。

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Application of STR-PCR in monitoring the effect of allogeneic hematopoietic stem cell transplantation*

ZhangTao,WangFang,ZhuSumin,MaoWei,HuangXia△

(TheTransfusionInstitute,ChongqingBloodCenter,Chongqing400015,China)

Objective To establish multiple short tandem repeat (STR) amplification by fluorescence labeling polymerase chain reaction (PCR) for monitoring the effect of allogeneic hematopoietic stem cell transplantation.Methods Sixty-five patients were analyzed.DNA from peripheral blood of donors and recipients in pre transplantation and post transplantation were extracted,15 STR loci and sexual loci were amplified by PCR.Results After allo-HSCT,54 patients obtained type of donors,but 3 patients did not;eight patients showed mixed chimerism.Two cases of type of donor converted into mixed chimerism and two cases of mixed chimerism converted into type of donors after some time.The time of earliest detection,duration and transformation of each state was different.The earliest detection showed on the 16th day after surgery,and the last one showed five months later.As to the duration,the shortest and longest were two months and seven months,respectively.Conclusion The key factors that significantly influence the application of STR-PCR in monitoring the effect of allogeneic hematopoietic stem cell transplantation were samples,STR loci and proper monitoring time.So to establish the suitable method for this region could truly take maximum advantage of the PCR-STR method.While a appropriate detecting time and STR loci should be chose.

hematopoietic stem cell transplantation;STR-PCR;effect examination

:10.3969/j.issn.1671-8348.2015.19.014

重慶市衛(wèi)生局醫(yī)學(xué)科研項(xiàng)目資助(2008-2-265)。

張濤(1982-)，主治醫(yī)師，在讀碩士，主要從事輸血醫(yī)學(xué)相關(guān)研究。

△通訊作者,Tel：13018355909；E-mail：xiahuangyy@163.com。

R551.3

A

1671-8348(2015)19-2632-03

2014-12-18

2015-02-26)