張興群，原月夢，孔德枝，郁崇文，3，金關榮，傅佳佳，丁若垚，3*

(1.東華大學紡織面料技術教育部重點實驗室，上海201620; 2.東華大學生態(tài)紡織教育部重點實驗室，上海201620; 3.東華大學紡織學院，上海201620; 4.浙江省農(nóng)業(yè)科學院蕭山棉麻研究所，杭州311202; 5.江南大學生態(tài)紡織教育部重點實驗室，江蘇無錫214122)

亞麻與黃麻漚麻池的細菌生物多樣性分析

張興群1，2，原月夢1，2，孔德枝1，2，郁崇文1，2，3，金關榮4，傅佳佳5，丁若垚1，2，3*

(1.東華大學紡織面料技術教育部重點實驗室，上海201620; 2.東華大學生態(tài)紡織教育部重點實驗室，上海201620; 3.東華大學紡織學院，上海201620; 4.浙江省農(nóng)業(yè)科學院蕭山棉麻研究所，杭州311202; 5.江南大學生態(tài)紡織教育部重點實驗室，江蘇無錫214122)

本研究以亞麻與黃麻兩用漚麻池中的漚麻液為研究對象，取樣后富集培養(yǎng)分離得到9株脫膠細菌，通過傳統(tǒng)微生物學研究手段與分子生物學系統(tǒng)發(fā)育分析相結(jié)合的方法進行生物多樣性研究。研究結(jié)果表明:9種細菌分別聚類為產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenessp.)4株，芽孢桿菌屬(Bacillussp.)4株，寡氧單胞菌屬(Stenotrophomonassp.)1株。系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)9種細菌從親緣關系上較為接近單胞菌屬Stenotrophomonassp.，假單胞菌屬Pseudomonassp.和芽孢桿菌屬Bacillussp.。這三類菌屬也是目前已知細菌中較為常見的脫膠菌屬。說明該9種細菌與脫膠菌屬關系較近，具有進一步研究的可能。

亞麻;黃麻;漚麻;細菌;生物多樣性

麻類制品以其良好的吸濕透氣性能及抗菌能力，長期以來一直受到廣大消費者的喜愛。亞麻纖維天然古樸、色彩柔和，具有獨特的涼爽舒適性，是化學纖維所不具備的，被譽為“植物纖維中的皇后”［1］。黃麻是我國重要的經(jīng)濟作物，是價格便宜、富有韌性、極易吸濕散濕、抗菌的天然纖維素纖維，能很好的與棉花、羊毛、粘膠及其它纖維混紡［2］。

亞麻與黃麻在紡織生產(chǎn)前需要通過一種漚麻過程來預先處理部分膠質(zhì)［3］。漚麻過程實際上應用到了傳統(tǒng)的微生物技術，它是一個通過微生物分泌的復合酶系協(xié)同降解附著在纖維表面非纖維素膠質(zhì)的過程。原麻收獲之后，被放置于空曠處或水中大約2至3周。在這段時間內(nèi)，細菌慢慢地降解果膠物質(zhì)并從植物組織中剝離出纖維，同時使纖維軟化，漚麻過程對麻纖維質(zhì)量有很大影響［4］。

國內(nèi)外對漚麻脫膠菌種進行了廣泛的研究，并取得了一系列的研究成果。人們早在上世紀50年代就發(fā)現(xiàn)某些細菌(如芽孢桿菌屬Bacillussp.等)有脫膠釋放纖維的能力［5］。Jauneau A.等將水解果膠的微生物群落中發(fā)現(xiàn)的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)產(chǎn)生的果膠裂解酶應用于亞麻的浸漬脫膠(漚麻)［6］。幾十年來人們經(jīng)過大量的試驗篩選出了一系列的高效韌皮纖維脫膠菌株，如:Aspergillus versicolo，Erwiniasp.，Amycolatasp.，Clostridium felsineum和Bacillussp.等等，應用范圍幾乎包括所有麻類:亞麻、黃麻、苧麻、紅麻、大麻等［7］。

漚麻過程的菌種選擇是漚麻的關鍵。但是人們對漚麻環(huán)境中的細菌群落構(gòu)成尚沒有一個全面的認識，因此，對漚麻池中的細菌生物多樣性進行研究，對篩選脫膠優(yōu)勢菌種具有重要的指導意義。傳統(tǒng)的微生物分離鑒定方法存在一定的局限性，這阻礙了人們對于微生物多樣性的研究。特別是不能對那些特殊環(huán)境下生長的微生物，進行有效的分類，影響了鑒定結(jié)果的可靠性?，F(xiàn)代分子生物學的快速發(fā)展，為物種鑒定提供了更加真實可靠的檢測方法。本文以亞麻與黃麻兩用漚麻池中的漚麻液為研究對象，采用形態(tài)及生理生化特征與分子生物學結(jié)合的方法對其中存在的具有生物脫膠能力的細菌進行分類鑒定，以期對漚麻過程中的細菌群落有進一步的認識和了解，為進一步構(gòu)建漚麻生物脫膠菌株體系提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

細菌樣品來源:浙江省農(nóng)業(yè)科學院蕭山棉麻研究所的亞麻與黃麻兩用漚麻池。采樣時間為2013年11-12月之間(漚麻后期)。取土壤樣品于漚麻池底部土壤中央位置。采集表層下深度為10-15 cm的3個供試土壤樣品，混勻后置無菌密封袋中備用。-20℃保存。

亞麻與黃麻材料來源:亞麻由黑龍江省農(nóng)科院經(jīng)濟作物研究所提供，黃麻由浙江省農(nóng)業(yè)科學院蕭山棉麻研究所提供，均收獲于2013年秋天。

主要實驗設備如下:COVER-015顯微鏡(OLYMPUS)，PCR擴增儀(美國應用生物公司)，DYCP-33A型電泳槽(北京六一儀器廠)，DYY-6B型電泳儀(北京六一儀器廠)，紫外凝膠成像儀Tamon 3500(上海天能科技有限公司)，隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱GHP-9080(上海齊欣醫(yī)療器械有限公司)，DK-8D電熱恒溫水槽(上海森信實驗儀器有限公司)，生物潔凈工作臺(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療儀器廠)，高速臺式離心機(上海安亭科學儀器廠)，HITACHI CR21GⅡ高速離心機(Hitanhi Koki)，大容量全溫振蕩培養(yǎng)箱DQHZ-2001B型(太倉市華美生化儀器廠)，YXQ-LS-50SI立式壓力蒸汽滅菌鍋(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)，電熱恒溫鼓風干燥箱(黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司)。

主要生物試劑配置如下。富集培養(yǎng)基:牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，水1000mL，pH7.4～7.6。分離培養(yǎng)基:K2HPO41g，MgSO40.5g，亞麻粉2.5g，黃麻粉2.5g，(NH4)2SO45g，KCl 0.5g，F(xiàn)eSO40.05g，瓊脂20g，水1000mL，pH 7.0-7.2。保藏培養(yǎng)基:蛋白胨5g，牛肉膏30g，NaCl 5g，瓊脂20g(固體培養(yǎng)基才添加)，蒸餾水定容至1000mL，調(diào)節(jié)pH至7.0-7.2，121℃滅菌20min。淀粉培養(yǎng)基:蛋白胨10g，NaCl 5g，牛肉膏5g，可溶性淀粉2g，蒸餾水1000mL，瓊脂15-20g，121℃滅菌20min。明膠培養(yǎng)基:牛肉膏蛋白胨液100mL，明膠12-18g，pH 7.2-7.4，溶化后調(diào)pH 7.2-7.4，121℃滅菌20min。油脂培養(yǎng)基:蛋白胨10g，牛肉膏5g，NaCl 5g，香油10g，1.6%中性紅水溶液1mL，瓊脂15-20g，蒸餾水1000mL，pH 7.0，121℃滅菌20min。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的富集與分離純化

將樣品按質(zhì)量比1:20分別置于盛有500 mL富集培養(yǎng)基的1000 mL錐形瓶中，室溫靜置富集一周，將富集液梯度稀釋107倍，取200 μL分別涂布于分離培養(yǎng)基固體平板上，30℃培養(yǎng)，待菌落長出后，挑取形態(tài)上有差別的單一菌落，堿性美蘭染色鑒別后挑取單菌落，反復劃線純化得到純培養(yǎng)［8］。

1.2.2 細菌的形態(tài)與生理生化鑒定

在保藏培養(yǎng)基上觀察菌落形態(tài)，采用堿性美蘭染色方法在光學顯微鏡下觀察菌種形態(tài)與芽孢結(jié)構(gòu)，具體方法參照文獻［8］，將分離的菌株進行初步分類。參照文獻對細菌菌株進行生理生化實驗，包括淀粉水解、硝酸鹽還原、明膠液化、檸檬酸鹽利用試驗等［9］。

1.2.3 細菌16SrDNA序列的測序與分析

將細菌接種于保藏培養(yǎng)基(液體)中，在37℃，150rpm條件下，搖床培養(yǎng)24小時以上。接著用DNA提取試劑盒(上海生工生物技術公司)提取細菌DNA，再以得到的DNA為模板，進行PCR(聚合酶鏈式反應)體外擴增。

其中PCR體系(單倍):

Taq酶(TaKaRa 5U/μL)0.25μL 10×PCR Buffer(TaKaRa Mg2+Plus)5μL dNTP Mixture(TaKaRa各2.5mM)4μL引物1、2(上海申能博彩)2μL模板DNA2.5ng，約合2μL補加無菌蒸餾水至50μL上樣緩沖液、Marker均出自TaKaRa公司

PCR產(chǎn)物送交上海生工生物技術公司測序。將測得的16SrDNA基因序列在NCBI中的Gen-Bank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對。

1.2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建與分析

用Molecular Evolutionary Genetics Analysis(version 4)對細菌菌種進行系統(tǒng)發(fā)育聚類分析(菌株的16SrDNA全序列)，得到系統(tǒng)發(fā)育進化樹。該菌種系統(tǒng)進化樹包含了本次研究篩選到的細菌菌種與在NCBI中的GenBank數(shù)據(jù)庫中以往文獻中提到的漚麻池中的脫膠細菌菌屬［10］。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離細菌菌株的形態(tài)學與生理生態(tài)分析

利用分離培養(yǎng)基的篩選作用，經(jīng)過富集培養(yǎng)基富集培養(yǎng)、菌種篩選、堿性美蘭染色、鏡檢觀察顯微形態(tài)，最終得到9株細菌菌株，分別記作Y1，Y2，Y3，Y4，Y5，Y7，Y8，Y9和Y11。經(jīng)過篩選分得的9株菌株的菌落形態(tài)和顯微形態(tài)如圖1和圖2，表1和表2所示。

如圖1和圖2所示，從漚麻液中分離的9株細菌菌落形態(tài)多為圓形隆起，且菌落顏色大部分為白色或乳白色。表面多為光滑有光澤，一部分粗糙無光澤，個別在表面有皺褶;顯微形態(tài)表示大多數(shù)菌體細胞均為桿狀，個別為球狀。有1/2革蘭氏染色呈陰性，有1/2細菌細胞帶有芽孢。

細菌的生理生化特征如表3所示，其中Y1、Y2和Y3等三株菌的生理生化特征較為相近，其余種屬都較為不一致，總體觀察為不同細菌種屬。2.2分離菌株16SrDNA系統(tǒng)發(fā)育分析

表1 亞麻與黃麻漚麻池中可培養(yǎng)細菌菌落形態(tài)Tab.1 Colony forms of bacteria from flax and jute retting pond

表2 亞麻與黃麻漚麻池中可培養(yǎng)細菌菌體形態(tài)Tab.2 Micro-characteristics of bacteria from flax and jute retting pond

表3 亞麻與黃麻漚麻池中可培養(yǎng)細菌生理生化特征Tab.3 Physiological and biochemical features of bacteria from flax and jute retting pond

圖1 亞麻與黃麻漚麻池中可培養(yǎng)細菌顯微鏡照片F(xiàn)ig.1Microscope photos of bacteria from flax and jute retting pond

圖2 亞麻與黃麻漚麻池中可培養(yǎng)細菌菌落照片F(xiàn)ig.2Photos of bacteria colony from flax and jute retting pond

2.2.1 細菌測序結(jié)果分析

提取初步分離的細菌總DNA序列，提取后的細菌總DNA送由上海生工生物工程有限公司進行細菌16SrDNA序列的測序。測序結(jié)果提交GenBank獲得登錄號，使用GenBank的Blast程序?qū)?條序列與數(shù)據(jù)庫中的序列進行比對，獲得各條序列的同源性信息，結(jié)果見表4。9種細菌分別聚類為產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenessp.)4株，芽孢桿菌屬(Bacillussp.)4株，寡氧單胞菌屬(Stenotrophomonassp.)1株。其相似性均較高，僅Y7在95%，其余都在99%以上，可以確定大部分菌種與已知菌種屬于同一種。進一步利用形態(tài)觀察和生理生化反應對9株細菌純培養(yǎng)物進行鑒定，得到如下結(jié)果:Y1、Y7屬于糞產(chǎn)堿菌(Alcaligenes faecalis)，Y2、Y3屬于產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenessp.)，Y4、Y11屬于賴氨酸芽孢桿菌屬(Lysinibacillussp.)，Y5屬于米氏硫胺素芽孢桿菌屬(Aneurinibacillus migulanus)，Y8屬于蘇云金芽孢桿菌屬(Bacillus thuringiensis)，Y9屬于微嗜酸寡氧單胞菌(Stenotrophomonas acidaminiphila)。

圖3 亞麻與黃麻漚麻池中可培養(yǎng)細菌的系統(tǒng)發(fā)育進化樹Fig.3Phylogenetictree of bacteria from flax and jute retting pond

2.2.2 16SrDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育分析

為顯示分離菌與已知菌的親緣關系及其種屬地位，利用GenBank數(shù)據(jù)庫中親緣關系最近的可培養(yǎng)細菌，部分已知脫膠菌屬與9株分離菌的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹，如圖3所示。

表4 亞麻與黃麻漚麻池中可培養(yǎng)細菌16SrDNA序列的BLAST結(jié)果Tab.4 BLAST result of 16SrDNA sequences of bacteria from flax and jute retting pond

從系統(tǒng)發(fā)育進化樹中可以發(fā)現(xiàn):Y4與Y8，Y3與Y7、Y11以及Y1、Y9與Y5和Y2這三組細菌的群落關系較為接近。所有9種細菌從親緣關系上較為接近單胞菌屬Stenotrophomonassp.，假單胞菌屬Pseudomonassp.和芽孢桿菌屬Bacillus sp.。這三類菌屬也是目前已知細菌中較為常見的脫膠菌屬。說明該9種細菌與脫膠菌屬關系較近，具有進一步研究的可能。

3 小結(jié)與討論

3.1本研究利用分離培養(yǎng)基的篩選作用，經(jīng)過富集培養(yǎng)基富集培養(yǎng)、菌種篩選、堿性美蘭染色、鏡檢觀察顯微形態(tài)，最終得到9株細菌菌株，分別記作Y1，Y2，Y3，Y4，Y5，Y7，Y8，Y9和Y11。9種細菌具有不同的菌落形態(tài)，顯微形態(tài)和生理生化特征。

3.216 SrDNA測序分析結(jié)果表明:9種細菌分別聚類為產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenessp.)4株，芽孢桿菌屬(Bacillussp.)4株，寡氧單胞菌屬(Stenotrophomonassp.)1株。Y1、Y7屬于糞產(chǎn)堿菌(Alcaligenes faecalis)，Y2、Y3屬于產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenessp.)，Y4、Y11屬于賴氨酸芽孢桿菌屬(Lysinibacillussp.)，Y5屬于米氏硫胺素芽孢桿菌屬(Aneurinibacillus migulanus)，Y8屬于蘇云金芽孢桿菌屬(Bacillus thuringiensis)，Y9屬于微嗜酸寡氧單胞菌(Stenotrophomonas acidaminiphila)。

3.3系統(tǒng)發(fā)育分析表明:Y4與Y8，Y3與Y7、Y11以及Y1、Y9與Y5和Y2這三組細菌的群落關系較為接近。所有9種細菌從親緣關系上較為接近單胞菌屬Stenotrophomonassp.，假單胞菌屬Pseudomonassp.和芽孢桿菌屬Bacillussp.。這三類菌屬也是目前已知細菌中較為常見的脫膠菌屬。說明該9種細菌與脫膠菌屬關系較近，具有進一步研究的可能。

3.4目前國內(nèi)對于苧麻系統(tǒng)中脫膠微生物的分離鑒定，進行了大量的研究，但是關于亞麻與黃麻漚麻體系中存在的脫膠微生物種類卻鮮有報道。這類兩用漚麻體系中新的脫膠微生物的菌種研究仍有很大的研究空間。通過研究亞麻與黃麻漚麻池中的細菌群落多樣性，為后續(xù)從中選出優(yōu)勢脫膠新菌株奠定了理論基礎。

［1］丁若垚.亞麻粗紗脫膠微生物的選育與應用［D］.上海:東華大學，2013.

［2］金關榮，傅福道，鄒清成，等.制約黃、紅麻纖維生產(chǎn)發(fā)展的主要因素與對策［J］.中國麻業(yè)科學，2008，(1):48-53.

［3］孫慶祥.麻類作物的微生物脫膠(綜述)［J］.中國麻作，1981，(1):38-41.

［4］劉正初，彭源德，孫慶祥.黃麻和紅麻脫膠的影響因素研究［J］.中國農(nóng)業(yè)科學，1995，28(3):28-34.

［5］陳楊棟.苧麻纖維天然處理體系的微生態(tài)解析［D］.上海:東華大學，2010.

［6］陳楊棟，陳婷，李力炯，等.幾種苧麻園土壤微生物總DNA提取方法比較［J］.實驗室研究與探索，2010，(4):17-20.

［7］Yu H，Yu C.Study on microbe retting of kenaf fiber［J］.Enzyme and microbial technology，2007，40(7):1806-1809.

［8］布坎南R·E，吉布斯N·E.伯杰細菌鑒定手冊［M］.8版.北京:科學出版社，1984.

［9］東秀珠，蔡妙英.常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊［M］.北京:科學出版社，2001.

［10］楊永華，姚健.分子生物學方法在微生物多樣性研究中的應用［J］.生物多樣性，2000，8(3):337-342.

Analysis On Bacteria Biodiversity in Flax and Jute Retting Pond

ZHANG Xing-qun1，2，YUAN Yue-meng1，2，KONG De-zhi1，2，YU Chong-wen1，2，3，JIN Guan-rong4，F(xiàn)U Jia-jia5，DING Ruo-yao1，2，3*
(1.Key Laboratory of Textile Science＆Technology，Ministry of Education，Shanghai 201620，China; 2.Key Laboratory of Science＆Technology of Eco-Textile，Ministry of Education，Shanghai 201620，China;3.College of Textiles，Donghua University，Shanghai 201620，China; 4.Cotton and Fiber Institute of Xiaoshan of Zhejiang Academy of Agricultural Sciences，Hangzhou 311202，China;5.Key Laboratory of Science＆Technology of Eco-Textile，Ministry of Education，Wuxi 214122，China)

In this study，bacteria strains isolated from flax and jute retting pond were studied.Traditional microbiology method and molecular biology method were used to analyze bacteria biodiversity.The results showed that 9 isolated strains of bacteria belong to members of 3 genuses that four strains are classified intoAlcaligenessp.，four strains are classified intoBacillussp.and one strain are classified intoStenotrophomonassp..Phylogenetic analysis showed that all these strains are close toStenotroph-omonas sp.，Pseudomonassp.andBacillussp.which were recognized as degumming bacteria in genetic relationship.

flax;jute;retting;bacteria;biodiversity

S154.38+1

A

1671-3532(2015)01-0014-07

2014-09-24

中國博士后科學基金面上資助(2014M561386);國家麻類產(chǎn)業(yè)技術體系建設專項資金資助項目(CARS-19);國家自然科學基金項目(31201134);江蘇省基礎研究計劃青年基金項目(BK2012112);東華大學中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金(14D110524);大學生“小平科技創(chuàng)新團隊”(麻類纖維生物脫膠技術產(chǎn)業(yè)化集成研發(fā)團隊)

張興群(1963-)，男，副教授。研究方向:工業(yè)微生物。E-mail:xqz@dhu.edu.cn。

*通訊作者:丁若垚(1986-)，男，博士，研究方向:紡織微生物。E-mail:dingruoyao@dhu.edu.cn。