王 瑞 ，陳永忠 ，王湘南 ，彭邵鋒 ，楊小胡 ，陳隆升 ，馬 力

（1.中南林業(yè)科技大學(xué)，湖南 長沙 410004；2.湖南省林業(yè)科學(xué)院，湖南 長沙 410004；3.國家油茶工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410004）

油茶組培苗生根過程中生理生化指標(biāo)的變化

王 瑞1-3，陳永忠2,3，王湘南2,3，彭邵鋒2,3，楊小胡2,3，陳隆升2,3，馬 力2,3

（1.中南林業(yè)科技大學(xué)，湖南 長沙 410004；2.湖南省林業(yè)科學(xué)院，湖南 長沙 410004；3.國家油茶工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410004）

為了探明油茶組培苗生根機(jī)理，提高油茶組培苗生根率，以“湘林1號”油茶無性系組培苗為材料，對其生根過程中營養(yǎng)物質(zhì)、酶活性及內(nèi)源激素變化規(guī)律開展了研究。結(jié)果表明：油茶組培苗屬皮部生根類型；油茶組培苗生根過程中可溶性蛋白含量一直下降，可溶性糖含量呈現(xiàn)“升高—降低—升高”的趨勢；POD活性在根原基誘導(dǎo)和表達(dá)期較低，而在不定根誘導(dǎo)和表達(dá)期迅速升高，PPO活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢；內(nèi)源IAA含量呈“M”型變化，總體呈上升趨勢，內(nèi)源ABA含量呈現(xiàn)“W”型變化趨勢，ZR含量呈先上升，后下降，再上升的變化趨勢，GA含量呈現(xiàn)“上升—下降—上升”的趨勢，整體呈現(xiàn)上升趨勢。

油茶；組培苗；生根；營養(yǎng)物質(zhì)；酶活性；內(nèi)源激素

油茶Camellia oleifera為山茶科Theacae山茶屬Camellia植物，與油棕Elaeis guineensisJacq.、油橄欖Olea europaeaL.和椰子Cocos nucifera并稱為世界四大木本食用油料植物。油茶常規(guī)育種周期很長，并且受到遠(yuǎn)緣雜交不親和等條件的限制，無性繁殖成為油茶良種推廣的重要途徑[1]。油茶無性繁殖以芽苗砧嫁接為主，輔以少量扦插苗，芽苗砧嫁接和扦插苗存在操作繁瑣、繁殖系數(shù)低、純度難以控制等問題。植物組織培養(yǎng)已在快繁、脫毒、育種和種質(zhì)資源保存等方面發(fā)揮了巨大的作用，目前關(guān)于油茶組織培養(yǎng)的研究不多，多集中在愈傷組織的誘導(dǎo)及芽誘導(dǎo)階段[2-5]，關(guān)于油茶植株再生的研究較少[6-9]。油茶組織培養(yǎng)生根困難、移栽成活率低、繁殖系數(shù)低，致使良種苗木供不應(yīng)求。探索油茶組培苗生根機(jī)理，提高生根率，加快組培快繁技術(shù)在生產(chǎn)中的應(yīng)用，具有重要的理論價值和實踐意義。

許多研究表明，過氧化物酶（POD）和多酚氧化酶（PPO）與植物不定根的發(fā)生和發(fā)展有著密切的關(guān)系[10-11]。另外，植物內(nèi)源激素變化也是誘導(dǎo)不定根發(fā)生的重要因素[12-13]。目前，有關(guān)組培苗生根機(jī)理的報道較少，辜云杰等研究了植物組培苗生根過程中酶及內(nèi)源激素活性的變化[14-17]。本試驗中分析了油茶組培苗生根過程中可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、氧化酶活性和4種內(nèi)源激素含量的變化，旨在探討油茶組培生根過程中這些生理生化指標(biāo)與組培生根的關(guān)系，為提高油茶組培苗生根率提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為“XL1”油茶繼代試管苗，選擇3～4 cm高的油茶組培苗用1×10－3IBA浸泡10 s，然后接種于生根培養(yǎng)基中。

1.2 試驗方法

接種后第0天開始取樣，每隔7 d取樣1次，共取樣7次。可溶性蛋白含量的測定采用考馬斯亮藍(lán)法；可溶性糖含量的測定采用蒽酮比色法；過氧化物酶（POD）活性的測定采用愈創(chuàng)木酚法；PPO活性的測定采用鄰苯二酚法；內(nèi)源激素（IAA、ABA、ZR、GA）活性的測定采用酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)分析使用EXCEL2003。內(nèi)源激素含量采用logit曲線方法進(jìn)行計算。

2 結(jié)果與分析

2.1 油茶組培苗生根特性

研究發(fā)現(xiàn)：油茶XL1組培苗經(jīng)IBA處理后第21天開始形成不定根（見圖1）。接種后第42天生根調(diào)查結(jié)果顯示：XL1組培苗生根率為86.7%，平均根數(shù)3.5條，平均根長0.71 cm（見表1）。經(jīng)觀察根系均從皮部產(chǎn)生，不是通過愈傷組織產(chǎn)生的，因此，油茶XL1組培苗為皮部生根類型。性蛋白的含量從第0天的20.53 mg/g降低到第42天的11.25 mg/g，降低了45.2%。可見不定根誘導(dǎo)期、

表 1 油茶組培苗生根特性Table 1 Rooting characteristics of C. oleifera tissue culture seedlings

圖 1 油茶組培苗生根情況Fig. 1 Rooting situation of C. oleifera tissue culture seedlings

圖 2 油茶組培苗生根過程中可溶性蛋白含量變化Fig. 2 Change of soluble protein content in C. oleifera tissue culture seedlings during rooting

2.2 油茶組培苗生根過程中營養(yǎng)物質(zhì)的變化

2.2.1 可溶性蛋白含量變化

油茶組培苗生根過程中可溶性蛋白含量變化如圖2所示。由圖2可見，生根過程中可溶性蛋白含量一直下降，從接種后第28～42天下降平緩，到第42天時達(dá)到最低值。在整個生根過程中，可溶形成期和伸長期的可溶性蛋白含量一直處于降低趨勢。說明在生根過程中，根原基的發(fā)育及不定根的形成與伸長與可溶性蛋白的不斷消耗有密切關(guān)系。

2.2.2 可溶性糖含量變化

油茶組培苗生根過程中可溶性糖含量變化如圖3所示。由圖3可見，油茶組培苗生根過程中可溶性糖含量呈現(xiàn)“升高—降低—升高”的變化趨勢。可溶性糖是啟動不定根形成所需能量的主要來源，第0～14天可溶性糖含量在不定根根原基誘導(dǎo)期隨培養(yǎng)時間延長而上升，可溶性糖含量在不定根形成期（第14～28天）降低，在不定根伸長期（第28～42天）又呈上升趨勢。在生根的不同天數(shù)內(nèi)可溶性糖含量變化明顯，說明不定根的形成需要消耗大量的營養(yǎng)物質(zhì)，糖的消耗對生根有明顯促進(jìn)作用，油茶組培苗生根與可溶性糖含量有極密切的關(guān)系。

圖 3 油茶組培苗生根過程中可溶性糖含量變化Fig. 3 Change of soluble sugar content in C. oleifera tissue culture seedlings during rooting

2.3 油茶組培苗生根過程中酶活性變化

2.3.1 過氧化物酶（POD）活性變化

油茶組培苗生根過程中POD活性變化如圖4所示。由圖4可見，油茶組培苗生根過程中，POD活性呈現(xiàn)有規(guī)律的變化，第0～21天過氧化物酶活性變化不大，且保持在較低水平，第21天后迅速上升，一致保持較高的水平，第35天時達(dá)到最高點。

圖 4 油茶組培苗生根過程中POD活性變化Fig. 4 Change of POD activity in C. oleifera tissue culture seedlings during rooting

POD是通過調(diào)節(jié)植物體內(nèi)IAA水平影響生根的，在不定根誘導(dǎo)期和表達(dá)期，POD活性升高是有生根能力的標(biāo)志[18-19]。同時，外源的生長素也會誘導(dǎo)、調(diào)節(jié)POD活性。第0～21天POD活性較低，為不定根根原基感知生長素信號的時期，對內(nèi)源IAA的降解能力較弱，有利于根原基的誘導(dǎo)和表達(dá)；第21天以后，不定根處于表達(dá)和伸長的活躍時期，POD活性迅速升高，促進(jìn)了不定根的伸長和根系的發(fā)育。

2.3.2 多酚氧化酶（PPO）活性變化

油茶組培苗生根過程中PPO活性變化如圖5所示。由圖5可見，PPO活性在油茶組培苗生根過程中呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。第0～28天逐漸上升，在第28天達(dá)到了高峰，然后迅速下降。IBA誘導(dǎo)后使PPO活性上升，從而促進(jìn)了根原基的發(fā)育和不定根的誘導(dǎo)、形成。第28天后，在不定根伸長期，PPO活性下降。由此可見，PPO對油茶組培苗不定根的發(fā)生和發(fā)展起著極其重要的作用。

圖 5 油茶組培苗生根過程中PPO活性變化Fig. 5 Change of PPO activity in C. oleifera tissue culture seedlings during rooting

2.4 油茶組培苗生根過程中內(nèi)源激素變化

2.4.1 生長素（IAA）含量變化

生長素對根原基的誘導(dǎo)、生長和發(fā)育均起著重要的作用[20]。油茶組培苗生根過程中IAA含量變化如圖6所示。由圖6可知，在生根過程中，內(nèi)源IAA呈“M”型變化，即呈現(xiàn)先升高，后下降，然后迅速升高，最后下降的變化趨勢，但總體呈上升趨勢。在整個過程中出現(xiàn)2個高峰，在第14天和第35天各出現(xiàn)1個，第2個高峰值（第35天）IAA含量（810.83 ng/g）是第1個高峰值（第14天）IAA含量（546.06 ng/g）的1.48倍。第1個峰值的出現(xiàn)與根原基形成有關(guān)，第2個峰值的出現(xiàn)與根的伸長生長有關(guān)。以上結(jié)果表明，在根系啟動和根原基形成時外源IBA提供較高濃度的IAA，根原基分化時需要IAA的含量較低，根的伸長生長時所需IAA含量上升，這與梁伯璠等的研究結(jié)果相同[21-24]。

圖 6 油茶組培苗生根過程中IAA含量變化Fig. 6 Change of IAA content in C. oleifera tissue culture seedlings during rooting

2.4.2 脫落酸（ABA）含量變化

油茶組培苗生根過程中ABA含量變化如圖7所示。由圖7可知，在生根過程中，ABA含量呈現(xiàn)“W”型變化，在第0天、第21天和第35天出現(xiàn)峰值，峰值分別為：240.67、233.57、259.45 ng/g。接種后ABA含量緩慢下降，在第14天達(dá)到最低點（209.43 ng/g）。外源IBA抑制內(nèi)源ABA，使其含量大幅度下降，利于植株內(nèi)淀粉水解轉(zhuǎn)化為糖，同時也有利于IAA受體的形成，有利于根原基的誘導(dǎo)，說明根系的啟動階段需要的ABA少或ABA不利于根系的啟動；第28天后ABA含量一直緩慢上升，在42天達(dá)到最高值，說明此階段對IAA運(yùn)輸?shù)囊种谱饔米顝?qiáng)，若此時能夠降低ABA含量，可能更有利于油茶組培苗根系的生長。

圖 7 油茶組培苗生根過程中ABA含量變化Fig. 7 Change of ABA content in C. oleifera tissue culture seedlings during rooting

圖 8 油茶組培苗生根過程中ZR含量變化Fig. 8 Change of ZR content in C. oleifera tissue culture seedlings during rooting

2.4.3 細(xì)胞分裂素（ZR）含量變化

油茶組培苗生根過程中ZR含量變化如圖8所示。由圖8可知，細(xì)胞分裂素ZR在油茶組培苗生根過程中呈先上升，后下降，再上升的變化趨勢，最后ZR含量基本趨于穩(wěn)定。在第14天和第28天出現(xiàn)2個高峰。在第0～14天，即外源IBA誘導(dǎo)不定根根原基分化形成前，ZR含量呈上升趨勢，此時高濃度的ZR含量有利于根原基的形成，這與Feito等的研究結(jié)果一致[25]。第14～21天，隨著不定根分化的進(jìn)行，ZR的消耗利用正常進(jìn)行，使其含量逐漸下降，第21天達(dá)到谷值。第21天后，自身啟動了ZR的合成，ZR含量隨著生根時間的推移而不斷增加。

2.4.4 赤霉素（GA）含量變化

油茶組培苗生根過程中GA含量變化如圖9所示。由圖9可知，在油茶組培苗生根過程中，赤霉素GA含量呈現(xiàn)“N”型變化趨勢，即“上升—下降—上升”，整體呈現(xiàn)上升趨勢。赤霉素含量在第0天時最低，為667.18 ng/g，第0～14天，IBA誘導(dǎo)赤霉素的合成使赤霉素含量不斷升高，此時正是不定根根原基的誘導(dǎo)生根時期；第14～21天在不定根形成期赤霉素的消耗使其含量逐漸下降，在第21天不定根形成時出現(xiàn)谷值（738.44 ng/g）。隨后不定根自身合成的激素促使赤霉素的合成，使其含量增加。第42天時達(dá)到最高值（873.76 ng/g）。說明油茶組培苗不定根在根原基誘導(dǎo)形成和分化的時期，GA起很重要的作用。

圖 9 油茶組培苗生根過程中GA含量變化Fig. 9 Change of GA content in C. oleifera tissue culture seedlings during rooting

3 結(jié)論與討論

（1）油茶組培苗生根過程中（第0～42天）可溶性蛋白含量一直處于下降的趨勢?？赡苁怯捎谏^程中需要激活生長素等內(nèi)源激素的表達(dá)，從而誘導(dǎo)不定根根原基的形成、表達(dá)和伸長，這一系列的反應(yīng)過程均需要消耗可溶性蛋白等營養(yǎng)物質(zhì)提供的能量?？扇苄蕴呛孔兓尸F(xiàn)“升高—降低—升高”的趨勢，也說明在不定根形成期需要消耗大量的營養(yǎng)物質(zhì)，說明可溶性糖是啟動不定根形成所需能量的主要來源?？扇苄缘鞍缀涂扇苄蕴堑南膶M培苗不定根的形成與發(fā)育提供能量。

（2）在本試驗中，在生根過程中的愈傷組織誘導(dǎo)階段，POD、PPO活性上升，在不定根形成和伸長期，各種酶活性上升速度放慢，甚至稍有下降。這充分揭示了油茶不定根的發(fā)生和發(fā)展與這2種氧化酶的密切聯(lián)系。本研究中，油茶屬于難生根植物，POD活性高，降解IAA的作用強(qiáng)，向下輸送的IAA含量較少，對誘導(dǎo)生根不利；同時，油茶組培苗生根前期PPO活性較低，催化形成的生根輔助因子也較少，也不利于生根。所以，在生根前可以利用外源生長素處理油茶組培苗，提供足夠的IAA，來誘導(dǎo)、促使油茶不定根的形成。

（3）油茶組培苗生根過程中，內(nèi)源激素（IAA、ABA、ZR與GA）含量與不定根形成與生長密切相關(guān)。高濃度的內(nèi)源IAA及低濃度的內(nèi)源ABA有利于不定根根原基的誘導(dǎo)分化和生長發(fā)育，高濃度的內(nèi)源GA抑制了油茶不定根的形成，外源IBA對內(nèi)源IAA的合成有促進(jìn)作用，可抑制組培苗中內(nèi)源ABA含量。所以，采用IBA速蘸組培苗基部可促進(jìn)其生根。

本試驗中結(jié)果表明赤霉素GA含量變化在生根過程中呈現(xiàn)“上升—下降—上升”的趨勢，原因可能是外源IBA誘導(dǎo)赤霉素的合成使赤霉素含量升高。隨著培養(yǎng)時間的延長，內(nèi)源生長素、乙烯、細(xì)胞分裂素等通過抑制調(diào)節(jié)內(nèi)源赤霉素的水平，促進(jìn)油茶不定根的形成和發(fā)育。這充分說明了在油茶不定根根原基形成和分化時期，GA起著重要的作用。

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Changes of physiological and biochemical indexes during tissue culture seedlings rooting inCamellia oleifera

WANG Rui1-3, CHEN Yong-zhong2,3, WANG Xiang-nan2,3, PENG Shao-feng2,3, YANG Xiao-hu2,3, CHEN Long-sheng2,3, MA Li2,3
(1. Central South University of Forestry & Technology, Changsha 410004, Hunan, China;2.Hunan Academy of Forestry, Changsha 410004, Hunan, China;3. National Oil-Tea Camellia Engineering & Technology Research Center, Changsha 410004, Hunan, China)

In order to determine the rooting mechanism of tissue culture seedling inCamellia oleiferaand promote rooting rate of tissue culture seedling, taking tissue culture seedlings inC. oleiferaXL1 as materials, change regulations of nutrient substance, enzyme activity and endogenous hormones were studied during rooting. The results showed that roots inC.oleiferatissue culture seedling was derived from the callus. During tissue culture seedlings rooting, the content of soluble proteins was decreased, while the content of soluble sugar was increased fi rstly, decreased later, and then increased rapidly.POD activity was very low during induction and expression of root primordium, while POD activity was increased rapidly during induction and expression of adventitious roots. PPO activity was fi rstly increased and then decreased. Additionally,the content of endogenous IAA, ZR and GA were all increased fi rstly, decreased later, and then increased, and they showed an increasing tendency as a whole, while the content of endogenous ABA showed “W” type of trend.

Camellia oleifera; tissue culture seedling; rooting; nutrient substance; enzyme activity; endogenous hormones

S601；S794.4

A

1003—8981(2015)02—0068—05

2015-01-15

湖南省科技重大專項“油茶良種繁育與生態(tài)高效培育關(guān)鍵技術(shù)研究與示范”（2013FJ1006）。

王 瑞，助理研究員，博士研究生。E-mail：wangrui102@163.com 通訊作者：陳永忠，研究員，博士。

王 瑞,陳永忠,王湘南,等.油茶組培苗生根過程中生理生化指標(biāo)的變化[J].經(jīng)濟(jì)林研究,2015,33(2):68－72.

10.14067/j.cnki.1003-8981.2015.02.012

http: //qks.csuft.edu.cn

[本文編校：聞 麗]