張晶晶，李建貴，郭藝鵬，韓 超，秦韻婷

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 林業(yè)研究所，新疆 烏魯木齊 830052）

新疆核桃根際土壤中解磷菌的分離篩選及鑒定

張晶晶，李建貴，郭藝鵬，韓 超，秦韻婷

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 林業(yè)研究所，新疆 烏魯木齊 830052）

為給核桃專用微生物肥的研制提供菌株材料，通過對(duì)新疆核桃根際土壤中解磷菌的分離純化，篩選出對(duì)核桃樹具有促生作用且能在其根際穩(wěn)定定殖的優(yōu)質(zhì)高效解磷菌株。從阿克蘇、和田、喀什等新疆核桃主產(chǎn)區(qū)的根際土壤中分離出解磷菌54株，采用溶磷圈初篩法和液體搖瓶復(fù)篩法對(duì)其解磷能力進(jìn)行測(cè)定，篩選出解磷能力強(qiáng)的菌株14株。經(jīng)耐利福平誘導(dǎo)后剩余13株，再進(jìn)行大田定殖試驗(yàn)，最終篩選出11株解磷菌。經(jīng)16S rDNA鑒定，得出這11株解磷菌歸屬于5個(gè)屬，分別為假單胞菌屬Pseudomonas，葡萄球菌屬Staphylococcus，動(dòng)性桿菌屬Planomicrobium，微桿菌屬M(fèi)icrobacterium，不動(dòng)桿菌屬Acinetobacter，其中，假單胞菌屬為優(yōu)勢(shì)種群且解磷效果最好。

新疆核桃；解磷菌；篩選；鑒定

磷是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的重要限制因素之一，在土壤缺乏磷素的狀態(tài)下，作物的產(chǎn)量將大大降低。土壤中全磷含量一般都比較充足，但植物可吸收的有效磷含量很低[1]，主要是因?yàn)閷?duì)土壤施用大量的磷肥后，這些可溶性磷肥大部分很快會(huì)被轉(zhuǎn)變成植物難以吸收利用的磷酸鹽形式，主要以磷酸鈣為主[2]。研究表明，解磷菌可以將土壤中的難溶態(tài)磷通過溶解或礦化作用轉(zhuǎn)化為可溶性磷。核桃Juglans regiaL.是世界著名的四大堅(jiān)果之一，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和保健功能[3]，它作為新疆特色林果的主要樹種，同樣面臨著嚴(yán)重缺磷的問題。因此，有必要從核桃土壤中篩選出高效的解磷菌株制成生物菌劑，再回接到土壤中以促進(jìn)植物生長(zhǎng)[4]。這樣不僅可以有效地減少化學(xué)磷肥的使用，還對(duì)提高作物產(chǎn)量具有重要意義。

目前，國(guó)內(nèi)外已有大量關(guān)于解磷菌的研究。在國(guó)內(nèi)方面，2006年，Chen等分離得到多株具有解磷能力的細(xì)菌，發(fā)現(xiàn)其解磷作用與有機(jī)酸的產(chǎn)生和培養(yǎng)基pH值的降低有關(guān)[5]。2007年，呂學(xué)斌等將分離得到的4株解磷菌株和2株對(duì)照菌株進(jìn)行了解磷效果的對(duì)比試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同菌株有著不同的磷源偏好，解磷效果差異較大[6]。2008年，呂德國(guó)等探討了解磷細(xì)菌定殖規(guī)律及其與本溪山櫻地上部和地下部生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)解磷細(xì)菌的定殖數(shù)量隨外來微生物侵入數(shù)量的增多而減少[7]。國(guó)外方面，2005年，Chung等從韓國(guó)不同農(nóng)作物根際土壤中分離得到13株解磷細(xì)菌，并進(jìn)行了全細(xì)胞脂肪酸甲酯（FAME）和16S rDNA序列分析[8]。2006年，Hameeda等研究發(fā)現(xiàn)，微生物解磷的能力與其產(chǎn)生葡萄糖酸的量有很大關(guān)系，解磷能力強(qiáng)，其相應(yīng)的產(chǎn)生葡萄糖酸的量也多[9]。2008年，Delvasto等從巴西地區(qū)一種含磷量較高的鐵礦石中分離得到4株解磷細(xì)菌，并研究了菌株的多樣性、解磷活力及解磷機(jī)制[10]。

如今，解磷微生物肥的應(yīng)用已很廣泛，但對(duì)核桃專用解磷菌劑的研究還比較少。筆者從核桃根際土壤中篩選出具有解磷作用且能在根際穩(wěn)定定殖的優(yōu)質(zhì)菌株，并對(duì)其進(jìn)行鑒定，旨在為核桃專用微生物肥的研制提供菌株材料。

1 試驗(yàn)區(qū)氣象條件

試驗(yàn)于2013～2014年在新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，試驗(yàn)區(qū)設(shè)于阿克蘇紅旗坡農(nóng)場(chǎng)某核桃園（N39°30′～ 41°27′，E79°39′～ 82°01′）。 試驗(yàn)區(qū)地處歐亞大陸深處，遠(yuǎn)離海洋，具有典型的暖溫帶大陸性干旱氣候特征。降水稀少，蒸發(fā)量大，主要靠灌溉水，蓄水量穩(wěn)定。光照充足，熱量豐富，晝夜溫差大，無霜期較長(zhǎng)。地面平均溫度12.0～15.1 ℃，年平均降水量為80.4 mm，年平均蒸發(fā)量為1 948 mm，年平均日照時(shí)數(shù)2 809 h，一般年份最低氣溫－15 ℃左右，極端最低氣溫－21 ℃。

2 材料與方法

2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)材料為阿克蘇、和田、喀什等地的核桃根際土壤。土樣帶回實(shí)驗(yàn)室后，取根系及黏附其上的土壤用于解磷菌的分離篩選，將篩選好的解磷菌進(jìn)行抗生素標(biāo)記后，定殖于試驗(yàn)區(qū)，并于加入菌劑后的0、10、25、45 d進(jìn)行根際土壤的回收，再次進(jìn)行解磷能力測(cè)定及菌落計(jì)數(shù)。最后，將篩選出的優(yōu)質(zhì)解磷菌進(jìn)行菌種鑒定。

2.2 試驗(yàn)方法

對(duì)土壤中解有機(jī)磷菌和解無機(jī)磷菌的分離分別采用的是卵磷脂與磷酸三鈣解磷培養(yǎng)基[11-12]；解磷能力測(cè)定采用的是溶磷圈初篩法[13]和液體搖瓶復(fù)篩法[14]；定殖能力測(cè)定采用的是含利福平肉湯梯度培養(yǎng)法，從而獲得耐利福平350 μg/mL的標(biāo)記菌株并進(jìn)行灌根及回收試驗(yàn)；菌種鑒定采用的是16S rDNA鑒定[15]。

3 結(jié)果與分析

3.1 解磷菌的分離

通過對(duì)采集的核桃根際土壤進(jìn)行解磷菌的分離，共得到54株解磷菌株并對(duì)其進(jìn)行了編號(hào)，具體編號(hào)見表1。

表 1 新疆核桃解磷菌株Table 1 The phosphate-solubilizing bacteria of Xinjiang walnut

3.2 解磷菌的初篩

將分離得到的54株解磷菌進(jìn)行溶磷圈法試驗(yàn)，初步選出以下14株解磷效果較好的解磷菌，并重新進(jìn)行編號(hào)。測(cè)定其培養(yǎng)1 d和3 d后，在磷灰石板和卵黃板上形成的透明圈和渾濁圈的半徑，如圖1、圖2所示。

從圖1可以看出，除PH-4外，培養(yǎng)1 d后，解無機(jī)磷菌在磷灰石板上形成了透明圈，其半徑為1.71～4.02 mm；培養(yǎng)3 d后，各菌株均形成了明顯的透明圈，其半徑為2.15～6.17 mm。其中，PH-6、PH-7、PH-11、PH-12的解無機(jī)磷能力相對(duì)較高。

從圖2可以看出，培養(yǎng)1 d后，解有機(jī)磷菌在卵黃板上均形成渾濁圈，半徑為2.00～7.82 mm；培養(yǎng)3 d后，各菌株均形成了明顯的渾濁圈，其半徑為3.91～11.83 mm。解有機(jī)磷效果好的有：PH-1、PH-4、PH-7、PH-8、PH-11。綜合圖1和2可以得出，在初篩中，PH-1、PH-7、PH-8、PH-11的解無機(jī)磷和解有機(jī)磷效果均較好。

圖1 新疆核桃解磷菌在磷灰石板上形成的透明圈半徑Fig. 1 Transparent circle radii forming on the apatite board of xinjiang walnut phosphate-solubilizing bacteria

圖2 新疆核桃解磷菌在卵黃板上形成的渾濁圈半徑Fig. 2 Turbidity circle radii forming on the yolk board of xinjiang walnut phosphate-solubilizing bacteria

圖3 解無機(jī)磷菌液含磷量Fig. 3 Phosphorus contents of inorganic phosphorus solubilizing bacteria solutions

3.3 解磷菌的復(fù)篩

將初篩得到的14株解磷菌與CK（加入等量滅活培養(yǎng)液）一起進(jìn)行液體搖瓶復(fù)篩，其發(fā)酵液1、3、6 d后的可溶性磷含量測(cè)定結(jié)果見圖3和圖4。

從圖3和圖4可以看出，接種后，隨著天數(shù)的增加發(fā)酵液中可溶性磷（解有機(jī)磷P＋和解無機(jī)磷P－）含量也基本上呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，僅有極少數(shù)出現(xiàn)下降，如解無機(jī)磷中的PH-3、PH-13和解有機(jī)磷的PH-2、PH-4在6 d后濃度有所下降，但其含量與CK相比均有所提高，故將其保留。其中解無機(jī)磷效果好的有：PH-7、PH-11、PH-12；解有機(jī)磷效果好的有：PH-1、PH-8、PH-11、PH-12。綜合以上結(jié)果來看，這14株解磷菌均可進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

圖4 解有機(jī)磷菌液含磷量Fig. 4 Phosphorus contents of organic phosphorus solubilizing bacteria solutions

3.4 耐利福平誘導(dǎo)后菌株的解磷能力

將篩選后的14株解磷菌經(jīng)利福平標(biāo)記后，再次進(jìn)行溶磷圈測(cè)定，其結(jié)果如圖5所示。

圖5 利福平標(biāo)記后解磷菌的解磷能力Fig. 5 Phosphate-solubilizing ability of phosphate-solubilizing bacteria after inducted by rifampicin resistance

從圖5可以看出，經(jīng)利福平標(biāo)記后，PH-7、PH-8、PH-11仍能保持相對(duì)較高的解磷能力，但大多數(shù)解磷菌的解磷能力變?nèi)?，PH-4、PH-10和PH-13甚至喪失了解無機(jī)磷能力，PH-6失去了解有機(jī)磷能力。其中，PH-10的解有機(jī)磷能力又相對(duì)較低，將其去除，采用其它13株解磷菌進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

3.5 解磷菌定殖試驗(yàn)

3.5.1 解磷菌定殖后菌落計(jì)數(shù)結(jié)果

將利福平標(biāo)記過的解磷菌培養(yǎng)液經(jīng)計(jì)數(shù)達(dá)108cfu/mL后，將其稀釋液與CK（設(shè)等量滅活的細(xì)菌培養(yǎng)基為對(duì)照）一起施入核桃根際，并在加入菌劑后的0、10、25、45 d進(jìn)行根際土壤的回收計(jì)數(shù)，試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表 2 定殖后解磷菌菌落計(jì)數(shù)Table 2 Colony count of phosphate-solubilizing bacteria after colonization cfu/mL

從表2可以看出，施入核桃根際的解磷菌株在定殖過程中數(shù)量呈快速下降的趨勢(shì)，這主要是由于初始接種量較大，超出了土壤的承載量，隨著時(shí)間的推移，接種進(jìn)去的解磷菌慢慢適應(yīng)了當(dāng)?shù)赝寥拉h(huán)境，菌株數(shù)量也逐漸穩(wěn)定下來，45 d后保持在107cfu/mL。其中PH-1、PH-7、PH-8、PH-11、PH-12的菌株數(shù)量較多，達(dá)到2×107cfu/mL以上，說明其具有較強(qiáng)的適應(yīng)性。

3.5.2 解磷菌定殖后解磷能力測(cè)定結(jié)果

將定殖45 d后的解磷菌進(jìn)行回收，純化后進(jìn)行溶磷圈試驗(yàn)，所得結(jié)果見圖6。

圖6 定殖后解磷菌解磷能力Fig. 6 Phosphate-solubilizing ability of phosphate-solubilizing bacteria after colonization

從圖6可以得出以下結(jié)論，篩選出的13株解磷菌在定殖后基本上仍能保持其解磷能力。其中，PH-1、PH-7、PH-8、PH-11、PH-12的解磷效果相對(duì)較好；PH-2、PH-4與PH-13失去了解無機(jī)磷能力，且PH-2、PH-13的解有機(jī)磷能力效果也不好，將其去除，而PH-4的解有機(jī)磷能力相對(duì)較好，將其保留。故最終篩選出11株解磷能力較好的菌株。

3.6 菌種鑒定

3.6.1 16S rDNA的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)

采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒對(duì)核桃解磷菌進(jìn)行DNA提取后，對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，所得電泳圖譜如圖7所示。

圖7 解磷菌16S rDNA 的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果Fig. 7 Electrophoresis test results of PCR ampli fi cation products of phosphate-solubilizing bacteria 16S rDNA

從圖7中可以看出擴(kuò)增出的16S rDNA片段序列長(zhǎng)度在1 000～2 000 bp，符合常規(guī)的16S rDNA序列長(zhǎng)度。

3.6.2 16S rDNA基因序列分析

將回收的片段送至上海生工生物工程服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，共獲得11條DNA序列，采用ClustalX1.8軟件進(jìn)行拼接，使用NCBI的BLAST功能，與GenBank中已有序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果如表3所示。

經(jīng)拼接對(duì)比鑒定，發(fā)現(xiàn)這11株解磷菌歸屬于 5個(gè) 屬。 其 中，PH-1、PH-4、PH-5、PH-7、PH-9、PH-11為 假 單 胞 菌 屬Pseudomonas，PH-6和PH-14為葡萄球菌屬Staphylococcus，PH-3為動(dòng)性桿菌屬Planomicrobium，PH-8為微桿菌屬M(fèi)icrobacterium，PH-12為不動(dòng)桿菌屬Acinetobacter。

4 小 結(jié)

4.1 新疆核桃解磷菌的分離篩選

從新疆核桃根際土壤中分離出54株解磷菌，采用溶磷圈初篩和液體搖瓶復(fù)篩法，選出解磷菌14株。經(jīng)耐利福平誘導(dǎo)后，淘汰1株。然后將這13株菌株數(shù)量在108cfu/mL水平的解磷菌菌劑進(jìn)行大田定殖45 d后，13株菌株的數(shù)量均保持在107cfu/mL水平（對(duì)照為106cfu/mL水平），再用溶磷圈法測(cè)定其解磷能力，最終篩選出11株解磷效果較好的菌株。

表 3 解磷菌16S rDNA序列BLAST結(jié)果Table 3 BLAST results of 16S rDNA sequence in phosphate-solubilizing bacteria

4.2 新疆核桃解磷菌的鑒定

經(jīng)16S rDNA進(jìn)行鑒定，得出這11株解磷菌歸屬于5個(gè)屬，其中6株菌株屬于假單胞菌屬Pseudomonas，1株為微桿菌屬M(fèi)icrobacterium，1株為不動(dòng)桿菌屬Acinetobacter，2株為葡萄球菌屬Staphylococcus，1株為動(dòng)性桿菌屬Planomicrobium。

綜合以上結(jié)果得出，假單胞菌屬為解磷菌的優(yōu)勢(shì)種群，而且是解磷能力最好的。本試驗(yàn)再次證實(shí)了解磷微生物的資源種類繁多，可供人們的開發(fā)和利用，特別是假單胞菌屬。但是，由于解磷菌的解磷能力具有不穩(wěn)定性，在菌株保存過程中，有些菌株會(huì)失去解磷能力。因此，深入研究解磷能力的穩(wěn)定性和解磷機(jī)制是今后的研究目標(biāo)。

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Screening and identi fi cation of phosphate-solubilizing bacteria in rhizosphere soil of Xinjiang walnut

ZHANG Jing-jing, LI Jian-gui, GUO Yi-peng, HAN Chao, QIN Yun-ting
(Institute of Forestry, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052, Xinjiang, China)

In order to provide strain material for development of speci fi c walnut microbial fertilizer, through separation and purification of the phosphate-solubilizing bacteria in rhizosphere soil of Xinjiang walnut, some high quality and efficient phosphate-solubilizing strains were screened, which had growth-promoting effect for walnut tree and could colonize stably in its rhizosphere. 54 strains of phosphate-solubilizing bacteria were isolated from the rhizosphere soil of Aksu, Hotan and Kashgar walnut-producing areas in Xinjiang, ability of its phosphate-solubilizing were measured by using the methods of dissolved phosphorus ring screening and liquid shake fl ask screening, and 14 strains of bacteria with strong phosphate-solubilizing ability were screened out. 13 strains of phosphate-solubilizing bacteria were reserved after inducted by rifampicin resistance, and eventually 11 strains of phosphate-solubilizing bacteria were selected out after the field colonization experiments. The 11 strains of phosphate-solubilizing bacteria were identified by 16S rDNA, they belonged to 5 genera, and they werePseudomonas,Staphylococcus,Planomicrobium,Microbacterium, andAcinetobacter.Among them,Pseudomonaswas the dominant population and its phosphate-solubilizing effect was best.

Xinjiang walnut; phosphate-solubilizing bacteria; screening; identi fi cation

S664.1

A

1003—8981(2015)02—0057—06

2015-01-04

國(guó)家林業(yè)公益性項(xiàng)目重大專項(xiàng)課題“新疆紅棗、核桃專用微生物肥料研制與應(yīng)用示范”(201304701)；新疆自治區(qū)重點(diǎn)學(xué)科森林培育。

張晶晶，碩士研究生。

李建貴，教授，博士生導(dǎo)師。E-mail：lijiangui1971@163.com

張晶晶,李建貴,郭藝鵬,等.新疆核桃根際土壤中解磷菌的分離篩選及鑒定[J].經(jīng)濟(jì)林研究,2015,33(2):57－62.

10.14067/j.cnki.1003-8981.2015.02.010

http: //qks.csuft.edu.cn

[本文編校：聞 麗]