謝尚微，楊俊毅*，張東聲，王春生

(1. 國家海洋局 第二海洋研究所, 浙江 杭州 310012; 2. 國家海洋局 海洋生態(tài)系統(tǒng)與生物地球化學重點實驗室，浙江 杭州 310012)

西南印度洋真光層海水中固氮細菌多樣性

謝尚微1,2，楊俊毅*1,2，張東聲1,2，王春生1,2

(1. 國家海洋局 第二海洋研究所, 浙江 杭州 310012; 2. 國家海洋局 海洋生態(tài)系統(tǒng)與生物地球化學重點實驗室，浙江 杭州 310012)

本文通過構建克隆文庫和基因測序的方法研究了西南印度洋真光層海水中固氮細菌nifH基因的多樣性。從構建的2個nifH基因克隆文庫中共獲得76條有效序列，其中46條來自CTD13-30 m文庫，分屬10個OTUs;30條來自CTD13-125 m文庫，分屬8個OTUs。系統(tǒng)發(fā)育分析結果顯示，研究站位nifH基因序列主要分布于Cluster I和Cluster III兩個分支，其中Cluster I中包含藍細菌和變形菌兩個分支，藍細菌以Group B為優(yōu)勢類群，并未獲得束毛藻和Group A的nifH基因序列。此外還有少數(shù)nifH基因序列分布于Cluster II?？傮w來看，西南印度洋固氮生物基因與大西洋的親緣關系更近；固氮生物的多樣性較為豐富，受環(huán)境條件的影響，群落結構與其它熱帶、亞熱帶寡營養(yǎng)海域具有明顯的不同。

固氮生物；nifH基因；多樣性；西南印度洋

0 引言

海洋生物固氮是海洋新氮的重要來源，據(jù)估計全球海洋生物固氮量可達200 Tg N·a-1，這幾乎與陸源生物固氮的總和持平[1]。在開放性大洋環(huán)境中，生物固氮對真光層新氮輸入的貢獻可達50%左右[2-3]，是海洋氮循環(huán)中必不可少的組成部分[4]。

長期以來關于海洋固氮生物的研究主要集中在束毛藻Trichodesmium這一絲狀、無異型細胞的藍藻上，它們是最早發(fā)現(xiàn)的海洋固氮生物，廣泛分布在全球熱帶和亞熱帶海洋，被認為是海洋生物固氮的主要貢獻者[5]。然而，基于束毛藻的生物固氮量并不能滿足海洋氮預算的平衡[6]，本世紀以來，在開放性寡營養(yǎng)大洋環(huán)境中發(fā)現(xiàn)了大量的單細胞固氮細菌，研究證明這些單細胞細菌在海洋氮循環(huán)中發(fā)揮著重要作用，其對生物固氮的貢獻甚至可能超過束毛藻[7-8]。它們主要包括單細胞藍細菌和變形菌[9-10]。其中單細胞固氮藍細菌可分為Group A和Group B兩個分支[7-8,11-13]：Group A細胞內缺乏產(chǎn)氧的光合系統(tǒng)II和具有固碳功能的加氧酶，有利于其在白天進行固氮作用，在北大西洋和北太平洋都是重要的固氮生物；Group B以Crocosphaerawatsonii(WH8501)為代表種，具有藍細菌典型的光合作用機制，但其種群內基因組的多樣性極低[14]。與藍細菌相比，變形菌也是一類重要的固氮生物，且分布更加廣泛，具有比藍細菌更高的多樣性[9]。除此之外，海洋環(huán)境中的固氮生物還包括厭氧菌(如梭狀芽孢桿菌ClostridiumPrazmowski和硫酸鹽還原菌Sulfate-Reducing Bacteria等)和古菌等，它們的多樣性及其對海洋生物固氮的貢獻也不容忽視[9,15-16]。

由于多數(shù)固氮生物還不能通過分離培養(yǎng)獲得純種菌株，目前更多的是利用分子生物學技術，以nifH基因為標記物，從分子水平研究固氮生物的多樣性。CHIEN和ZINDER[17]在固氮酶基因系統(tǒng)發(fā)育分析的基礎上將固氮生物分成4個大的分支：Cluster I、II、III、IV。海洋環(huán)境中的固氮生物多樣性豐富，來自所有4個分支的固氮生物在海洋中均有發(fā)現(xiàn)，其中Cluster I是最主要的海洋固氮生物分支，包含了藍細菌、α-變形菌、β-變形菌和γ-變形菌，在數(shù)量和多樣性上占有絕對優(yōu)勢。Cluster II包含少數(shù)變形菌和古菌，Cluster III中的固氮生物以嚴格的厭氧微生物為主，Cluster IV以產(chǎn)甲烷古菌為主[9]。

隨著分子生物學技術的進步，我們對海洋固氮生物的多樣性、系統(tǒng)發(fā)育和分布范圍有了全新的認識。例如，高通量測序的結果表明，大洋表層海水固氮生物的優(yōu)勢類群可能是變形菌而不是藍細菌[18]；在傳統(tǒng)觀點中不適合固氮生物生存的極地環(huán)境中也發(fā)現(xiàn)了nifH基因[19]。這些研究成果進一步證明了固氮生物在海洋氮循環(huán)中的重要地位。

盡管已經(jīng)得到各國學者的重視，但受采樣和研究方法等條件限制，針對固氮細菌多樣性的研究有限，主要集中在大西洋和太平洋[10,14,20]，印度洋的相關報道則相當匱乏，僅有個別報道[21-22]。西南印度洋的營養(yǎng)鹽水平較低、水文環(huán)境條件復雜[23-24]，受西風帶影響，海水溫度較低、風力較大，并不是傳統(tǒng)觀點上海洋固氮生物的理想生境[5]。然而，據(jù)估計印度洋生物固氮可達25 Tg/a[2]，其單位面積的固氮速率甚至高于大西洋[25]，關于固氮生物的研究與其在該海域的重要性有明顯差距。本文對西南印度洋真光層海水固氮生物進行研究，揭示了該海域固氮生物的多樣性和分布特征，為進一步評估海洋固氮生物的分布及其對新氮的貢獻提供科學資料。

1 材料與方法

1.1 研究海區(qū)和采樣分析方法

樣品由“大洋一號”科學考察船2010年1月采集自西南印度洋(21V-CTD13站位：37.789 4°S、49.636 7°E，圖1)。使用Seabird 911Plus采水器分別采集30 m層和125 m層海水水樣。每層取4 L水樣，用200 μm篩絹預過濾后，過濾于孔徑為0.2 μm的核孔濾膜上，濾膜保存于-20 ℃，帶回實驗室分析。

圖1 西南印度洋固氮生物采樣站位Fig.1 Sampling station in the southwest Indian Ocean

1.2 DNA提取

參照LANGLOIS et al[12]的方法，使用QIAGEN DNA提取試劑盒(DNeasy Plant mini kit)提取濾膜上的環(huán)境總DNA。

1.3 nifH基因擴增與克隆

以從濾膜上提取的環(huán)境總DNA為模板，對nifH基因進行巢式PCR，兩輪引物分別為：第一輪引物[26]：nifH1: 5’-TTYTAYGGNAARGGNGG-3’，nifH2: 5’-ATRTTRTTNGCNGCRTA-3’；第二輪引物[27]：nifH3: 5’-TGYGAYCCNAARGCNG A-3’，nifH4: 5’-ADNGCCATCATYTCNCC-3’。50 μL PCR反應體系：Mg2+(80 nmol/L)、dNTPs(400 μmol/L)、上下游引物(1 μmol/L)、Taq酶(2.5 U)、10×PCR緩沖液 5 μL、DNA模板2 μL，無菌水補充至50 μL。PCR反應條件如下：94 ℃變性4 min；30個循環(huán)：94 ℃變性60 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s；72 ℃延伸10 min。第一輪PCR產(chǎn)物作為DNA模板進行第二輪PCR反應，兩輪PCR反應條件相同。PCR產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗。

nifH基因的PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收試劑盒純化后，連接到pMD20-T Vector(TaKaRa)上，轉入大腸桿菌感受態(tài)細胞(E.coli JM109 Competent cells, TaKaRa),涂布到含有氨芐青霉素(Ampicillin)/IPTG/X-Gal的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)過夜，挑取白色克隆子，4 ℃保存。利用T7和SP6進行菌落PCR，篩選插入目的片段的陽性克隆子并直接利用菌液進行DNA序列測定，構建克隆文庫。測序反應由上海生工生物工程公司完成。

1.4 序列分析

將測序所得序列在NCBI中進行同源性比對，挑選與序列親緣關系最相似序列，利用CHECK-CHIMERA軟件分析檢查去除嵌合體[28]。使用Clustal X 1.83和Mega 4.0分析多重對比結果，構建系統(tǒng)發(fā)育樹。將nifH基因序列提交GenBank數(shù)據(jù)庫，登記號為KF740730—KF740805。

1.5 環(huán)境參數(shù)分析

溫度和鹽度數(shù)據(jù)由Seabird 911Plus CTD直接測得。用于葉綠素a分析的樣品采集自0、10、20、30、50、75、100、125、150、175和200 m層，每層水樣分別取500 mL，依次用孔徑為20、2和0.2 μm的濾膜(Millipore NY2004700、TTTP04700、GTTP04700)分級過濾，分析測定細胞粒徑大于20、2～20和0.2～2 μm三個粒級葉綠素a質量濃度，各粒級葉綠素a質量濃度之和為總葉綠素a質量濃度。葉綠素a測定采用熒光法[29]。

2 結果

2.1 溫度、鹽度及葉綠素a質量濃度的垂直分布

調查站位200 m以淺水層溫、鹽垂直分布較均勻，水溫在16～19 ℃之間，隨水深增大而逐漸降低；鹽度在35.5～35.6之間，垂直分布呈單峰形態(tài)，高值在水深40 m左右(圖2)。

圖2 CTD13站位溫、鹽垂直分布Fig.2 Vertical distribution of temperature and salinity on CTD13 station

葉綠素a質量濃度的垂直分布呈典型的單峰形態(tài)(圖3)，總葉綠素a質量濃度最大值(0.336 μg/L)位于100 m層，30 m層和125 m層的總葉綠素a質量濃度相近，分別為0.106 μg/L和0.134 μg/L。微微型浮游植物(Pico，0.2～2 μm)對總葉綠素a質量濃度的貢獻占絕對優(yōu)勢，平均達到70.2%，垂直分布特征也與總葉綠素a質量濃度一致；其次是微型浮游植物(Nano，2～20 μm)，占總葉綠素a質量濃度的27.4%；小型浮游植物(Micro，>20 μm)占總葉綠素a質量濃度比例最低，僅2.4%。

圖3 CTD13站位各粒級葉綠素a質量濃度垂直分布Fig.3 Vertical distribution of Chlorophyll a concentration of different size on CTD13 station

2.2 nifH基因克隆文庫構建和多樣性分析

構建CTD13-30 m和CTD13-125 m兩個nifH基因文庫，對獲得的陽性克隆進行測序，共獲得76條有效的nifH基因，其中CTD13-30 m文庫46條，CTD13-125 m文庫30條。以基因相似性≥97%為一個OTU統(tǒng)計，CTD13-30 m文庫獲得10個OTUs，CTD13-125 m文庫獲得8個OTUs，稀釋度曲線(圖4)顯示這2個文庫均已趨于飽和。

系統(tǒng)發(fā)育分析結果顯示，CTD13-30 m和CTD13-125 m兩個文庫中的nifH基因分屬于Cluster I、Cluster II和Cluster III這3個已知的分支。CTD13-30 m文庫中的nifH基因在3個分支中均有分布，CTD13-125 m文庫中的nifH基因僅分布于Cluster I和Cluster III兩個分支(圖5和圖6)。

屬于Cluster I的nifH基因大多數(shù)與固氮藍細菌親緣關系較近，其中25條nifH基因屬于Group B分支，該分支以Crocosphaerawatsonii為代表，是寡營養(yǎng)海域單細胞固氮藍細菌的一個重要分支[7]。另有3條nifH基因不屬于藍細菌nifH基因已知的分支，CTD13-30 m-56與色球藻屬Chroococcus和從現(xiàn)代海洋疊層石中獲取的未培養(yǎng)nifH基因親緣關系較近，CTD13-125 m-21與來自中國南海海水中的未培養(yǎng)nifH基因親緣關系較近，CTD13-125 m-13則與來自土壤和活性污泥等環(huán)境中的未培養(yǎng)nifH基因親緣關系較近(圖5)。4條nifH基因與γ變形菌的親緣關系較近，來自CTD13-125 m文庫的1條nifH基因與Vibriodiazotrophicus親緣關系較近，來自CTD13-30 m文庫的3條nifH基因與太平洋和大西洋寡營養(yǎng)海水中的未培養(yǎng)nifH基因親緣關系較近(圖5)。

圖4 CTD13-30 m和CTD13-125 m nifH基因文庫稀釋度曲線Fig.4 Rarefaction curves of OTUs of uncultured nifH clones

41條nifH基因序列屬于Cluster III，該分支包含厭氧的硫還原菌(如δ變形菌)、梭狀芽胞桿菌和紫硫菌(Purple Sulfur Bacteria)等。Cluster III又可以分成2個聚類分支，1支包含CTD13-125 m文庫的8條nifH基因，它們與來自開放性大洋和深海沉積物的未培養(yǎng)nifH基因親緣關系較近，另一支包含CTD13-30 m文庫的23條nifH基因和CTD 13-125 m文庫的10條nifH基因，它們與來自活性污泥環(huán)境中的未培養(yǎng)nifH基因親緣關系較近(圖6)。

Cluster II僅包含3條CTD13-30 m文庫的nifH基因，也可分成2個分支，CTD13-30 m-2和CTD13-30 m-44與來自波羅的海的未培養(yǎng)nifH基因親緣關系較近，CTD13-30 m-13與密螺旋體的nifH基因親緣關系較近(圖6)。

3 討論與結論

本文結果顯示西南印度洋海域固氮細菌nifH基因具有較為獨特的多樣性和群落結構特征。與熱帶、亞熱帶的太平洋[7]和大西洋[30]海域相比，本文構建的克隆文庫中未獲得來自束毛藻的nifH基因，這可能是受溫度限制的結果。溫度是限制固氮細菌生長和分布的一個重要因素，例如束毛藻，主要分布在水溫大于20 ℃的海域[31]，相比較而言，單細胞固氮生物對溫度的耐受性更強，是低溫環(huán)境下固氮生物的優(yōu)勢類群[12]。調查站位200 m以淺水層溫度在16～19 ℃之間(圖2)，30 m和125 m層的溫度分別為17.9 ℃和16.6 ℃，均低于束毛藻的適宜溫度下限，不利于束毛藻的生長繁殖。

Group B是本文研究站位固氮生物的主要優(yōu)勢類群，溫度較高的CTD13-30 m文庫中共獲得16條屬于Group B的nifH基因，占其文庫百分比的34.8%，溫度較低的CTD13-125 m文庫獲得9條屬于Group B的nifH基因，占文庫總序列數(shù)的30.0%，前者明顯高于后者。有研究表明，單細胞固氮藍細菌Group B的數(shù)量與所在環(huán)境水溫之間存在顯著的正相關[13]，溫度越高數(shù)量越多。這與本文的結果一致，說明本文調查站位中Group B的數(shù)量與溫度可能也存在正相關關系。

固氮生物是一類全球性分布的生物，LANGLOIS et al[30]認為熱帶、亞熱帶大西洋和太平洋的單細胞藍細菌和Cluster III的nifH基因具有很高的同源性。BIRD et al[32]發(fā)現(xiàn)北印度洋阿拉伯海的變形菌nifH基因與大西洋和太平洋的變形菌nifH基因相似性很高。本文獲得的Group BnifH基因與大西洋Group B的非培養(yǎng)nifH基因相似性較高(98%)，與太平洋Group B的非培養(yǎng)nifH基因相似性較低(93%)，這意味著，西南印度洋Group B固氮藍細菌與大西洋固氮藍細菌具有更近的親緣關系。來自變形菌分支的nifH基因與大西洋和太平洋的變形菌nifH基因都具有很高的相似性，而Cluster III的nifH基因與大西洋和太平洋同一分支中的nifH基因相似性都很低。本文還獲得了屬于Cluster II分支的3條nifH基因，這一分支很少出現(xiàn)在熱帶、亞熱帶的太平洋和大西洋，在深海沉積物[33]、熱液噴口[34]等海洋環(huán)境中更為常見，受這一環(huán)境特征影響，可能與產(chǎn)甲烷細菌具有較近的親緣關系[34]。

盡管固氮生物廣泛分布在全球海洋當中，但不同海域固氮生物的群落結構和多樣性存在顯著差異[18]。在熱帶、亞熱帶北大西洋，以束毛藻為主的固氮藍細菌在固氮生物中占絕對優(yōu)勢，是生物固氮的主要來源[12,35]；在亞熱帶北太平洋單細胞藍細菌(Group A)則成為固氮生物的優(yōu)勢類群，同時也是生物固氮的主要來源[8,11]。本文的研究結果表明西南印度洋固氮細菌群落結構與西南太平洋[18]相似，以藍細菌和Cluster III的單細胞固氮細菌為主，這可能是由兩者之間相似的環(huán)境特征造成的。盡管還缺乏更為直接的證據(jù)，本文結果仍表明Cluster III可能在西南印度洋的生物固氮和單循環(huán)中扮演重要角色。實際的固氮酶表達活性和細菌豐度仍需要進一步研究，以證明Cluster III固氮細菌的固氮能力。

圖5 nifH基因Cluster I分支的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Neighbor-joining phylogenetic tree of Cluster I nifH gene sequences

圖6 nifH基因Cluster II和Cluster III分支的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Neighbor-joining phylogenetic tree of Cluster II and Cluster III nifH gene sequences

綜上所述，西南印度洋固氮細菌nifH基因與其他海區(qū)相比具有較為獨特的群落結構，Group B和Cluster III是固氮細菌的主要優(yōu)勢類群。從系統(tǒng)發(fā)育上來看，該海域的nifH基因與大西洋更為接近。

致謝 感謝“大洋一號”全體船員在采樣過程中提供的幫助，感謝國家海洋局第二海洋研究所王淵助理研究員提供溫、鹽數(shù)據(jù)。

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Phylogenetic diversity ofnifHgenes in the euphotic zone of the southwest Indian Ocean

XIE Shang-wei1,2, YANG Jun-yi*1,2, ZHANG Dong-sheng1,2, WANG Chun-sheng1,2

(1.TheSecondInstituteofOceanography,SOA,Hangzhou310012,China; 2.LaboratoryofMarineEcosystemandBiogeochemistry,SOA,Hangzhou310012,China)

Our knowledge on diazotrophs is limited in the Indian Ocean, which is considered an important source of biological N2fixation of the global ocean. Phylogenetic diversity ofnifHgenes in the southwest Indian Ocean was studied through cloning and sequencing methods. After sequences were checked, twonifHgene libraries were established. Overall, 76nifHgene sequences are recovered from Station CTD13, including 46nifHgene sequences of 10 OTUs from libraries CTD13-30 m, and 30nifHgene sequences of 8 OTUs from libraries CTD13-125 m, respectively. Results of phylogenetic analysis show that mostnifHgene sequences fall into Cluster I and III, only 3 recoverednifHgene sequences are grouped with Cluster II. In Cluster I, most ofnifHgene sequences cluster with unicellular cyanobacteria Group B, while in Cluster III, mostnifHgene sequences are closely related with uncultured clone from active sludge. NonifHgene sequences clustered withTrichodesmiumare recovered, which may be attributed to low water temperature. In general, diazotroph community in the southwest Indian Ocean is different from those in tropical and subtropical oligotrophic ocean.

diazotroph;nifHgene; diversity; the southwest Indian Ocean

10.3969/j.issn.1001-909X.2015.03.008.

2015-03-24

2015-05-19

國家自然科學基金項目資助(41206104); 國際海域資源調查與開發(fā)“十二五”課題資助(DY125-11-E-03)

謝尚微(1990-)，女，浙江溫州市人，主要從事海洋生物學方面的研究。E-mail：410074144@qq.com

*通訊作者:楊俊毅(1970-)，男，研究員，主要從事海洋生物與生態(tài)環(huán)境監(jiān)測技術方面的研究。E-mail:junyiyang@sio.org.cn

Q938.1

A

1001-909X(2015)03-0054-08

10.3969/j.issn.1001-909X.2015.03.008

謝尚微，楊俊毅，張東聲，等. 西南印度洋真光層海水中固氮細菌多樣性[J]. 海洋學研究,2015,33(3):54-61,

XIE Shang-wei, YANG Jun-yi, ZHANG Dong-sheng, et al. Phylogenetic diversity ofnifHgenes in the euphotic zone of the southwest Indian Ocean[J]. Journal of Marine Sciences, 2015,33(3):54-61, doi:10.3969/j.issn.1001-909X.2015.03.008.