唐曙明，李愛敏，陳海霞，楊自華

(深圳市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東深圳 518000)

基因芯片快速鑒定分枝桿菌菌種方法的建立

唐曙明，李愛敏，陳海霞，楊自華△

(深圳市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東深圳 518000)

目的 利用基因芯片技術(shù)，建立一種能快速、準(zhǔn)確鑒定分枝桿菌菌種的方法，并驗(yàn)證其臨床應(yīng)用價(jià)值。方法根據(jù)23種分枝桿菌基因序列設(shè)計(jì)特異性探針并制作基因芯片，通過PCR-反向點(diǎn)雜交鑒定23種分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株、9 種非分枝桿菌和103株分枝桿菌臨床分離株的菌種。結(jié)果應(yīng)用基因芯片技術(shù)檢測(cè)23 種分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和9種非分枝桿菌菌株，特異性為100%。103株臨床分離株經(jīng)鑒定87株為結(jié)核桿菌復(fù)合群(MTC)；16株為非結(jié)核分枝桿菌(NTM)，其中膿腫分枝桿菌5株、胞內(nèi)分枝桿菌3株、鳥分枝桿菌3株、偶發(fā)分枝桿菌2株，以及堪薩斯分枝桿菌、海分枝桿菌、戈登分枝桿菌各1株。103株臨床分離株鑒定結(jié)果與測(cè)序法完全一致，該方法最低檢出限為103copy/mL。結(jié)論采用基因芯片技術(shù)能快速鑒定分枝桿菌菌種，并區(qū)分MTC和NTM，具有簡(jiǎn)便快速及準(zhǔn)確性、特異性、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。

分枝桿菌屬；菌種鑒定；寡核苷酸序列分析

近年來，中國(guó)分枝桿菌疫情不斷上升，尤其是非結(jié)核分枝桿菌(non-tuberculous mycobacteria，NTM)感染增多趨勢(shì)明顯。2010年第五次全國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查結(jié)果顯示，NTM在分枝桿菌分離菌株中占比高達(dá)22.9%，相比1990年的4.9%，漲幅超過360%。NTM病和結(jié)核病有著相似的臨床表現(xiàn)，但對(duì)藥物的敏感性完全不同，若當(dāng)成結(jié)核病用藥，其耐藥率為95.9%；耐多藥率為83.7%，往往導(dǎo)致治療失敗[1-3]。因此，建立一種快速、簡(jiǎn)便的分枝桿菌菌種鑒定方法以及時(shí)、準(zhǔn)確地鑒定分枝桿菌菌種，對(duì)診斷、控制和治療分枝桿菌感染引起的疾病具有重要的意義。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，基因芯片檢測(cè)技術(shù)得到了廣泛應(yīng)用。基因芯片技術(shù)因其高通量、平行性、快速靈敏、樣品用量少等優(yōu)點(diǎn)為病原菌的分子診斷提供了有力的技術(shù)平臺(tái)。將基因芯片技術(shù)應(yīng)用于分枝桿菌菌種鑒定中，可實(shí)現(xiàn)對(duì)多種分枝桿菌的平行海量檢測(cè)，從而提高病原菌的檢出效率。本研究建立基于基因芯片技術(shù)的檢測(cè)方法，對(duì)臨床分枝桿菌分離株進(jìn)行了檢測(cè)，并以測(cè)序法為“金標(biāo)準(zhǔn)”，探討其臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1標(biāo)本來源 23種分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株購于中國(guó)生物制品檢定所，具體菌株見表1。同時(shí)還購買了9種非分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株(大腸埃希菌、肺炎鏈球菌、卡他布蘭漢菌、紅色紅球菌、星形奴卡菌、綠膿假單胞菌、肺炎克雷伯菌、表皮葡萄球菌、草綠色鏈球菌)。103株分枝桿菌臨床分離株來自本院2012年2～8月門診和住院患者。

1.1.2儀器與試劑 PCR儀購于美國(guó)ABI公司；電泳儀購于北京六一儀器廠；核酸/蛋白凝膠圖像管理系統(tǒng)型號(hào)為GSG-2000；分子雜交箱購于韓國(guó)FINE PCR公司。

1.1.3探針設(shè)計(jì) 根據(jù)23種常見致病性分枝桿菌的基因序列，在其16S～23S rRNA基因間隔區(qū)設(shè)計(jì)PCR引物和特異性探針。每種菌株均設(shè)計(jì)多組探針，經(jīng)比較分析后，最終選擇的探針序列見表1。另設(shè)一條保守區(qū)序列作為內(nèi)控點(diǎn)(內(nèi)對(duì)照)，以監(jiān)測(cè)整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程的有效性。

1.2方法

1.2.1基因芯片制備 尼龍纖維膜浸入5% EDAC 20 min，純水洗膜，晾干。探針稀釋液(5 μm/L)點(diǎn)樣于膜條上，晾干后浸于0.1 mol/L NaOH 3 min，純水洗膜，晾干，室溫儲(chǔ)藏備用。

1.2.2分枝桿菌核酸制備 分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株和臨床分離株、非分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株菌懸液直接離心，痰液樣本經(jīng)消化、離心后收集沉淀，將沉淀進(jìn)行裂解、煮沸、離心，取上清液備用。

表1 23種分枝桿菌特異性探針序列

1.2.3引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增 將Genebank中的分枝桿菌核酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，設(shè)計(jì)可以特異性擴(kuò)增23種常見致病性分枝桿菌的特定片段作為引物對(duì)，引物的5′進(jìn)行生物素標(biāo)記。在25 μL 反應(yīng)體系中，dNTP 混合物的終濃度為0.2 mmol/L，引物的終濃度均為0.4 μmol/L，DNA 模板的終濃度為20 ng，Taq DNA 聚合酶2.5 U。置于PCR儀上擴(kuò)增，然后在2% 瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。

1.2.4雜交與顯色 將制備好的膜條編號(hào)后放入15 mL雜交管中，加入擴(kuò)增產(chǎn)物和6 mL雜交緩沖液(2×SSC、0.1%SDS)置于沸水浴10 min，放入已預(yù)熱的雜交箱中，57 ℃雜交1.5 h。取出膜條，移至裝有預(yù)熱至57 ℃的洗液(0.5×SSC、0.1%SDS)50 mL管中，于57 ℃輕搖洗滌15 min。取出膜條，按雜交緩沖液：POD=2 000∶1配制孵育液，室溫輕搖孵育30 min，棄去POD溶液。用雜交緩沖液室溫輕搖洗2次，每次5 min。用檸檬酸緩沖液(0.1 mol/L)室溫洗膜2 min，同時(shí)配制顯色液(19 mL 0.1 mol/L檸檬酸鈉、 1 mL 2 mg/mL TMB、10 μL 3% H2O2)，將膜條浸泡于顯色液中避光顯色10～15 min，觀察結(jié)果。

1.2.5結(jié)果分析 膜條在內(nèi)控點(diǎn)(CC)位置出現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)提示本次檢測(cè)過程正常；其他出現(xiàn)的藍(lán)色斑點(diǎn)表示為相應(yīng)的分枝桿菌菌種。

1.2.6確定最低檢出限 23種分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株先用結(jié)核分枝桿菌核酸檢測(cè)試劑盒(凱杰生物，careTM TB PCR ASSAY)定量后進(jìn)行系列稀釋，分別制成104、103、102、101copy/mL的菌液，按1.2.2～1.2.5步驟檢測(cè)，以確定新建方法的最低檢出限。

1.2.7測(cè)序分析 經(jīng)芯片鑒定為NTM的臨床分離株進(jìn)一步送上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序，以檢測(cè)PCR擴(kuò)增的特異性和芯片鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2 結(jié) 果

2.1基因芯片檢測(cè)結(jié)果 用基因芯片對(duì)103株分枝桿菌臨床分離株進(jìn)行檢測(cè)，分別檢出87株結(jié)核桿菌復(fù)合群(MTC)和16株NTM。在16株NTM中，分別檢出5株膿腫分枝桿菌、3株胞內(nèi)分枝桿菌、3株鳥分枝桿菌、2株偶發(fā)分枝桿菌、1株堪薩斯分枝桿菌、1株海分枝桿菌、1株戈登分枝桿菌。

2.2測(cè)序鑒定結(jié)果 將16株經(jīng)基因芯片鑒定為NTM的臨床分離株送上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行DNA 測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與GeneBank中已報(bào)道的序列進(jìn)行比對(duì)分析，芯片鑒定結(jié)果和測(cè)序結(jié)果完全一致。部分NTM測(cè)序結(jié)果，見圖1。

A：膿腫分枝桿菌；B：胞內(nèi)分枝桿菌；C：鳥分枝桿菌；D：偶發(fā)分枝桿菌。

圖1 部分NTM測(cè)序結(jié)果

2.3基因芯片的準(zhǔn)確性與特異性 基因芯片與23 種分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的擴(kuò)增產(chǎn)物均可進(jìn)行雜交反應(yīng)，檢測(cè)準(zhǔn)確性為100%；9種非分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株擴(kuò)增產(chǎn)物與基因芯片上的探針均不雜交，檢測(cè)特異性為100%。

2.4基因芯片最低檢出限的確定 對(duì)23種分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株系列稀釋菌液進(jìn)行檢測(cè)，各菌株濃度在103copy/mL時(shí)檢測(cè)結(jié)果仍為陽性；當(dāng)菌液稀釋至102copy/mL時(shí)，MTC、鳥分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌等19種菌株的陽性顯色已經(jīng)明顯變?nèi)?而海分枝桿菌、戈登分枝桿菌、膿腫分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌的檢測(cè)結(jié)果為陰性；當(dāng)菌液濃度稀釋至101copy/mL時(shí)，所有膜條未見顯色，結(jié)果見表2。

表2 部分分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株不同濃度的檢出結(jié)果(copy/mL)

續(xù)表2 部分分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株不同濃度的檢出結(jié)果(copy/mL)

3 討 論

NTM引起的感染日益增多，特別是由其引發(fā)的醫(yī)院感染出現(xiàn)頻率逐漸增高，已越來越受到人們的關(guān)注[4-6]?？焖佟?zhǔn)確、靈敏、特異地對(duì)致病性分枝桿菌做出診斷，是有效預(yù)防分枝桿菌病發(fā)生和控制其迅速傳播的前提和關(guān)鍵，對(duì)治療和疫情控制具有重要意義。傳統(tǒng)的分枝桿菌篩查方法主要有涂片抗酸染色法、羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)法和結(jié)核抗體金標(biāo)法，其中抗酸染色涂片法具有簡(jiǎn)便、快捷、價(jià)格低廉的優(yōu)點(diǎn)，但其敏感性太低；而羅氏培養(yǎng)基培養(yǎng)法報(bào)告時(shí)間較長(zhǎng)(2～8周)；結(jié)核抗體金標(biāo)法則只能檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌，對(duì)NTM檢測(cè)無效。后期發(fā)展的BACTEC快速菌種鑒定法可初步鑒別MTC和NTM，但其培養(yǎng)周期仍較長(zhǎng)(2～6 d)，有研究對(duì)BACTECTB460檢測(cè)出來的NTM進(jìn)行菌種鑒定，發(fā)現(xiàn)有7.7%的菌株為結(jié)核分枝桿菌[7]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性方法也被應(yīng)用于分枝桿菌菌種鑒定，該方法通過分析分枝桿菌16S rRNA,根據(jù)其電泳圖譜與標(biāo)準(zhǔn)株的相似性進(jìn)行菌種鑒定，但結(jié)果顯示對(duì)結(jié)核分枝桿菌、牛結(jié)核分枝桿菌及堪薩斯分枝桿菌、胃分支桿菌之間不能特異性區(qū)分[8]。前述方法敏感性或特異性不強(qiáng)，很難滿足臨床診斷的需要。

基因芯片技術(shù)是伴隨人類基因組計(jì)劃的實(shí)施而發(fā)展起來的一門新興技術(shù)，該技術(shù)將成千上萬個(gè)DNA或寡核苷酸片段固定在玻璃、尼龍膜或硅片等載體上，與標(biāo)記的樣品雜交，分析樣品中基因表達(dá)、基因序列、基因突變和多態(tài)性變化等情況。該技術(shù)將PCR技術(shù)的高靈敏度和反向點(diǎn)雜交技術(shù)的高特異性相結(jié)合，真正達(dá)到了快速檢測(cè)的要求，其結(jié)果更加準(zhǔn)確可靠。本研究以測(cè)序法為對(duì)照，采用本院與亞能生物技術(shù)(深圳)有限公司聯(lián)合研發(fā)的分枝桿菌菌種鑒定試劑盒，利用膜芯片技術(shù)，在膜上固定一系列的特異性探針，根據(jù)分枝桿菌16S～23S rRNA基因間隔區(qū)序列設(shè)計(jì)引物，利用PCR體外擴(kuò)增各菌株的DNA，與固定在膜上的基因型特異探針雜交，再通過顯色判斷分枝桿菌菌種。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本研究中基因芯片上的探針只與23種分枝桿菌的擴(kuò)增產(chǎn)物雜交，與9種非分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株擴(kuò)增產(chǎn)物均不雜交，為進(jìn)一步驗(yàn)證本芯片的準(zhǔn)確性，將16株臨床NTM進(jìn)行DNA測(cè)序，證實(shí)與GenBank對(duì)應(yīng)序列相一致，其檢測(cè)特異性達(dá)到了100%。據(jù)報(bào)道，基因芯片檢測(cè)靈敏度比PCR-電泳法高10倍[9-10]，從本研究對(duì)23種類型的分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的系列稀釋檢測(cè)結(jié)果可以看出，該方法的最低檢出限達(dá)到了103copy/mL，解決了傳統(tǒng)方法對(duì)臨床標(biāo)本中低濃度分枝桿菌不能檢出的難題，提高了檢測(cè)靈敏度。

上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，本研究所建立的基因芯片法具備高通量、高特異性、高靈敏度、操作簡(jiǎn)便、結(jié)果直觀的優(yōu)點(diǎn),且能在6～8 h內(nèi)直接測(cè)定痰液標(biāo)本中的MTC和其他22種NTM，具有很好的臨床應(yīng)用價(jià)值，是一項(xiàng)值得推廣的技術(shù)。

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Establishment of a rapid and accurate gene microarray for identifying Mycobacterium species*

TangShuming,LiAimin,ChenHaixia,YangZihua△

(DepartmentofClinicalLaboratory,ShenzhenPeople′sHospital,Shenzhen,Guangdong518000,China)

Objective To establish a rapid and accurate method for the identification of Mycobacterium species by the gene microarray and to verify its clinical application value.Methods According to the gene sequence of 23 species of Mycobacteria,the specific probes were designed and the gene chips were prepared.23 Mycobacterial standard strains,9 non-mycobacterial strains,103 clinically isolated mycobacterial strains were detected by PCR-based reverse blot hybridization assay in the gene chip.Results 23 mycobacterial standard strains,9 non-mycobacterial strains were detected by gene chip，the results showed that the specificity was 100%.Of 103 mycobacterial clinically isolated strains,87 strains were identified as Mycobacterium tuberculosis compounds (MTC) and 16 strains as non-tuberculosis mycobacteria (NTM) including 5 strains of M.abscessus，3 strains of M.intracellulare，3 strains of M.avium，2 strains of M.fortuitum，1 strain of M.kansas，1 strain of M.marinum and 1 strain of M.gordonae.The identification results of 103 clinically isolated strains were completely consistent with the sequencing results.The lowest detection limit by this method was 103copies/mL.Conclusion The gene microarray technique for rapidly identifying Mycobacteria and differentiate MTC and NTM has the advantages of simpleness,rapidness,high accuracy,high specificity and high sensitivity.

mycobacterium;species identification;oligonucleotide array sequence analysis

術(shù)與方法·

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.11.026

深圳市科技局資助項(xiàng)目(201102151)。

唐曙明(1975-)，副主任技師，碩士研究生，主要從事分子診斷技術(shù)研究。

△通訊作者，Tel：13590265712；E-mail：tangshuming@126.com。

R446.5

A

1671-8348(2015)11-1516-03

2014-10-28

2015-01-20)