景 勝，黃 靜，包曉航，周功銳，王 穎，楊天德△

(第三軍醫(yī)大學(xué)：1.新橋醫(yī)院麻醉科，重慶 400037；2.組織胚胎學(xué)教研室，重慶 400038)

丙泊酚對新生小鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的影響

景 勝1，黃 靜1，包曉航1，周功銳1，王 穎2，楊天德1△

(第三軍醫(yī)大學(xué)：1.新橋醫(yī)院麻醉科，重慶 400037；2.組織胚胎學(xué)教研室，重慶 400038)

目的 觀察丙泊酚麻醉對新生小鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞(AST)和小膠質(zhì)細(xì)胞的影響。方法將健康同窩日齡7 d(P7)C57小鼠15只，隨機(jī)分為丙泊酚高劑量組、低劑量組和10%脂肪乳對照組，每組5只，所有小鼠從P7開始接受藥物處理。高、低劑量組分別腹腔注射丙泊酚60、30 mg/kg；對照組腹腔注射同等體積的10%脂肪乳。藥物處理24 h后取材，采用免疫組化方法檢測AST標(biāo)記物膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)與小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物離子鈣接頭分子(Iba1)在海馬內(nèi)的表達(dá)。結(jié)果丙泊酚高劑量組小鼠海馬齒狀回分子層中GFAP標(biāo)記的AST數(shù)量較對照組明顯減少(P<0.01)，低劑量丙泊酚對新生鼠海馬中AST數(shù)量無顯著影響；高劑量和低劑量丙泊酚均顯著性降低海馬小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量(P<0.01)。結(jié)論丙泊酚抑制新生小鼠海馬AST和小膠質(zhì)細(xì)胞的發(fā)育，且存在劑量依賴關(guān)系。

二異丙酚；海馬；神經(jīng)膠質(zhì)；星形細(xì)胞；小神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞；新生小鼠

丙泊酚因其半衰期短、蘇醒完全且具有止吐功能，已廣泛應(yīng)用于兒科臨床麻醉、輔助性診斷檢查及ICU鎮(zhèn)靜。越來越多的實(shí)驗(yàn)研究表明，全身麻醉(全麻)藥物可能損傷發(fā)育期大腦，導(dǎo)致持續(xù)性神經(jīng)行為異常[1]。目前研究全麻藥物對發(fā)育期腦功能影響主要聚焦在與神經(jīng)功能發(fā)育密切相關(guān)的神經(jīng)元上；卻忽視了藥物對中樞神經(jīng)系統(tǒng)中數(shù)量幾乎是神經(jīng)元10倍的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的影響。最新研究表明，腦內(nèi)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞對腦認(rèn)知功能有重要作用[2]。全麻藥物丙泊酚是否通過調(diào)控與遠(yuǎn)期腦功能密切相關(guān)的海馬中神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)而影響腦功能尚未明確。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用免疫組化方法檢測丙泊酚對新生小鼠海馬神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的影響，以進(jìn)一步探討丙泊酚影響發(fā)育中大腦功能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 藥品及試劑：丙泊酚購自AstraZenenca公司(批號(hào)為KL569)；10%脂肪乳購自安徽豐原藥業(yè)股份有限公司(批號(hào)為120811M1)；離子鈣接頭分子(Iba1)抗體購自Wako公司；膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)抗體購自北京中杉公司；生物素化兔抗二抗購自Invitrogen公司；顯色試劑盒DAB購自北京中杉公司。儀器：冰凍切片機(jī)為Leica的CM1950型；照相儀器為ZEISS的AX10型。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物處理 健康C57/BL6臨產(chǎn)孕鼠由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，室溫飼養(yǎng)在正常晝夜交替采光的環(huán)境中，自由充足攝取食物和水，小鼠出生當(dāng)日記為P0。將日齡7 d(P7)同窩小鼠15只按照隨機(jī)數(shù)字表分為3組：丙泊酚高、低劑量組及10%脂肪乳對照組，每組5只。高、低劑量組小鼠分別腹腔注射丙泊酚60、30 mg/kg，對照組小鼠腹腔注射等體積10%脂肪乳。注射藥物后將小鼠放置于37 ℃恒溫充氧保溫箱中，直至小鼠麻醉蘇醒。注射藥物24 h后收取小鼠大腦標(biāo)本。

1.2.2免疫組化檢測 小鼠斷頭處死取材，將腦標(biāo)本置于新鮮配制的4%多聚甲醛中固定24 h，隨后依次采用10%、20%及30%蔗糖溶液梯度脫水，待其充分脫水后，以40 μm冰凍切片，后將腦片置于凍存液中-20 ℃保存?zhèn)溆谩?.01 mol/L PBS漂洗后，3%H2O2室溫處理20 min，PBS漂洗后0.3% Triton X-100置于37 ℃孵箱孵育30 min，3%胎牛血清(BSA)封閉反應(yīng)1 h。分別加入兔來源的一抗工作液GFAP(1∶200)及Iba1(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜。PBS漂洗后分別加入生物素化抗兔二抗(1∶200)，置于37 ℃孵箱中反應(yīng)2 h。PBS漂洗后與鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(SABC)在37 ℃中孵育1 h，DAB顯色，貼片晾干，中性樹脂封片。通過檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞(Astrocvte，AST)的特異性標(biāo)記物GFAP評(píng)估丙泊酚對小鼠海馬中AST的影響；通過檢測小膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)記物Iba1評(píng)估丙泊酚對小鼠海馬中小膠質(zhì)細(xì)胞的影響。

1.2.3計(jì)數(shù)GFAP及Iba1陽性細(xì)胞 每只小鼠選取海馬區(qū)域大小相似切片各3張，在顯微鏡下統(tǒng)計(jì)海馬中的GFAP及Iba1陽性細(xì)胞數(shù)。

2 結(jié) 果

2.13組小鼠海馬中GFAP標(biāo)記的AST數(shù)量比較 GFAP標(biāo)記的AST主要分布于海馬齒狀回分子層(圖1)。丙泊酚藥物處理后新生小鼠海馬中GFAP數(shù)量出現(xiàn)下降，與對照組比較，低劑量組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，高劑量組出現(xiàn)顯著性減少(P<0.01)，見表1。

2.23組新生小鼠海馬中Iba1標(biāo)記的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量比較 新生期小鼠腹腔注射丙泊酚后，海馬中Iba1陽性細(xì)胞數(shù)量出現(xiàn)下降(圖2)。與對照組比較，低、高劑量組小鼠海馬中小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量均顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見表1。

圖1 3組小鼠海馬中AST免疫組化結(jié)果

圖2 3組小鼠海馬中Microglia免疫組化結(jié)果

表1 3組小鼠海馬中GFAP及Iba1陽性細(xì)胞比較個(gè))

a：P<0.01，與對照組比較。

3 討 論

大腦功能發(fā)育是一個(gè)漫長且錯(cuò)綜復(fù)雜的過程。Hudson等[3]認(rèn)為腦功能在嬰幼兒或老齡人極易受到外界因素的影響。McCann等[4]認(rèn)為在大腦快速發(fā)育期外界對腦發(fā)育影響最大。此期因物種而異：嚙齒類動(dòng)物，這段時(shí)間是從生后7 d持續(xù)到生后第10天(甚至第17天);在靈長類動(dòng)物(恒河猴)，大腦快速發(fā)育期是從生后第5天持續(xù)到生后第16天；而在人類，認(rèn)為大腦快速發(fā)育期從第3期妊娠持續(xù)到生后3歲[5]。近年來，全麻藥物對發(fā)育機(jī)體的中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)的毒性作用越來越引起大家的重視。丙泊酚因其誘導(dǎo)、蘇醒快且不良反應(yīng)小已成為兒科臨床中最常用的靜脈麻醉藥。既往研究表明，在大腦快速發(fā)育期接觸全麻藥物后，全麻藥物通過促進(jìn)腦內(nèi)神經(jīng)元凋亡或抑制神經(jīng)元的神經(jīng)發(fā)生等方式影響腦功能發(fā)育[6]。而全麻藥物是否通過調(diào)控在CNS發(fā)育過程中與神經(jīng)元同樣具有舉足輕重的神經(jīng)膠質(zhì)的報(bào)道較少。

既往研究表明，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞與腦認(rèn)知功能關(guān)系密切[7]。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是廣泛分布于CNS內(nèi)除了神經(jīng)元以外的所有細(xì)胞，主要由小膠質(zhì)細(xì)胞、AST及少突膠質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成，而在海馬中主要存在的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是前兩種細(xì)胞。AST是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中體積最大的一種細(xì)胞，它可以通過存在于AST內(nèi)的一種中間絲蛋白，即GFAP進(jìn)行特異性標(biāo)記。AST能合成和分泌多種細(xì)胞因子，它不僅參與CNS內(nèi)炎癥及免疫應(yīng)答，而且對神經(jīng)元遷移、突起生長及再生等有重要影響。離體實(shí)驗(yàn)表明，長時(shí)間使用丙泊酚導(dǎo)致單純培養(yǎng)的AST存活率下降[8-9]。臨床濃度的丙泊酚對發(fā)育中神經(jīng)系統(tǒng)的影響并不局限于神經(jīng)元，它對皮層AST也能產(chǎn)生抑制[10]。Gomez-Pinilla等[11]研究發(fā)現(xiàn)，大鼠在學(xué)習(xí)記憶的過程中海馬中AST的數(shù)量和突起密度均出現(xiàn)增加。本研究發(fā)現(xiàn)，在丙泊酚低劑量組，海馬中AST數(shù)量較注射等體積10%脂肪乳的對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但高劑量組海馬中AST數(shù)量明顯減少(P<0.01)，提示丙泊酚能抑制AST表達(dá)，并呈現(xiàn)一定劑量依賴性。高劑量丙泊酚抑制AST 表達(dá)從而觸發(fā)后續(xù)連鎖反應(yīng)可能是丙泊酚暴露導(dǎo)致腦功能及行為異常的病理學(xué)基礎(chǔ)之一。

小膠質(zhì)細(xì)胞是CNS內(nèi)一群獨(dú)特的細(xì)胞群體，在腦內(nèi)各部分均有分布，其來源至今尚無明確定論。小膠質(zhì)細(xì)胞相當(dāng)于腦中的巨噬細(xì)胞，是CNS中最主要的免疫防線?；罨男∧z質(zhì)細(xì)胞可釋放很多介質(zhì)，可構(gòu)成CNS抵御外界感染、炎癥、神經(jīng)退行性變等的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。Iba1是一種新的鈣結(jié)合蛋白，能夠特異標(biāo)記小膠質(zhì)細(xì)胞。Luo等[12]發(fā)現(xiàn)，丙泊酚可抑制腦外傷后大腦中小膠質(zhì)細(xì)胞的活化。本文對照組新生鼠大腦海馬中Iba1大量表達(dá)，而丙泊酚處理組表達(dá)明顯減弱，說明丙泊酚能抑制新生小鼠海馬中小膠質(zhì)細(xì)胞的活化。小膠質(zhì)細(xì)胞活化能力降低可導(dǎo)致海馬抵御外界影響能力降低，致使海馬中神經(jīng)元易受到攻擊，最終影響機(jī)體遠(yuǎn)期的腦功能。這可能是丙泊酚暴露導(dǎo)致嬰幼兒腦功能改變及行為異常的機(jī)制之一。另有研究表明，AST可以激活小膠質(zhì)細(xì)胞釋放可溶性因子來阻止和限制CNS炎性反應(yīng)過度的表達(dá)。本研究中丙泊酚抑制AST表達(dá)是否協(xié)同導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞的影響還有待驗(yàn)證。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，丙泊酚抑制新生小鼠海馬神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)，且呈現(xiàn)出劑量依賴性。本研究推測高劑量丙泊酚可能通過抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的生長，觸發(fā)后續(xù)系列的連鎖反應(yīng)導(dǎo)致機(jī)體遠(yuǎn)期腦功能改變。

[1]Olsen EA,Brambrink AM.Anesthesia for the young child undergoing ambulatory procedures:current concerns regarding harm to the developing brain[J].Curr Opin Anaesthesiol,2013,26(6):677-684.

[2]Han X,Chen M,Wang F,et al.Forebrain engraftment by human glial progenitor cells enhances synaptic plasticity and learning in adult mice[J].Cell Stem Cell,2013,12(3):342-353.

[3]Hudson AE,Hemmings HC.Are anaesthetics toxic to the brain?[J].Br J anaesth,2011,107(1):30-37.

[4]McCann ME,Soriano SG.General anesthetics in pediatric anesthesia:influences on the developing brain[J].Curr Drug Targets,2012,13(7):944-951.

[5]Sowell ER,Peterson BS,Thompson PM,et al.Mapping cortical change across the human life span[J].Nat Neurosci,2003,6(3):309-315.

[6]Sinner B,Becke K,Engelhard K.General anaesthetics and the developing brain:an overview[J].Anaesthesia,2014,69(9):1009-1022.

[7]孟凡珍,萬燕杰,徐靜,等.中樞神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞與認(rèn)知功能[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2008,24(23):4145-4146.

[8]Berns M,Seeberg L,Schmidt M,et al.High-dose propofol triggers short-term neuroprotection and long-term neurodegeneration in primary neuronal cultures from rat embryos[J].J Int Med Res,2009,37(3):680-688.

[9]Turina D,Loitto VM,Bjornstrom K,et al.Propofol causes neurite retraction in neurones[J].Br J Anaesth,2008,101(3):374-379.

[10]張砡,李俁,李偉光,等.丙泊酚對新生大鼠大腦皮層星形膠質(zhì)細(xì)胞合成凝血酶敏感蛋白1的影響[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2013,33(9):1316-1320.

[11]Gomez-Pinilla F,So V,Kesslak JP.Spatial learning and physical activity contribute to the induction of fibroblast growth factor:neural substrates for increased cognition associated with exercise[J].Neuroscience,1998,85(1):53-61.

[12]Luo T,Wu J,Kabadi SV,et al.Propofol limits microglial activation after experimental brain trauma through inhibition of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase[J].Anesthesiology,2013,119(6):1370-1388.

Effects of propofol on hippocampal astrocytes and microglia in neonatal mice

JingSheng1,HuangJing1,BaoXiaohang1,ZhouGongrui1,WangYing2,YangTiande1△

(1.DepartmentofAnesthesiology,XinqiaoHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400037,China;2.DepartmentofHistologyandEmbryology,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400038,China)

Objective To observe the effects of propofol on the hippocampal astrocytes and microglia in the nenotal mice.Methods 15 healthy mice from the same litters on postnatal 7 d were randomized into 3 groups:high dose propofol group,low dose propofol group and 10% intralipid control group.All mice were treated with drugs on postnatal 7 d by intraperitoneal injection and were sacrificed at 24 h after drugs treatment.The high dose group was injected with propofol 60mg·kg-1;the low dose group was injected with propofol 30mg·kg-1;the control group was injected with the equal volume of 10% intralipid.The immunohistochemistry assay was used to detect the expression of glial fibrillary acidic protein (GFAP) and ionized calcium binding adapter molecular 1 (Iba1) for observing the effect of propofol on the astrocytes(AST) and microglia in the hippocampus.Results Compared with the control group,the number of GFAP-labeled AST in the dentate gyms(DG) molecular layer of hippocampus in P7 mice of the high dose propofol group was significantly reduced(P<0.01),while no obvious effect of the low-dose propofol on the number of AST was observed;high dose and low dose propofol all significantly decreased the number of Iba1-labeled microglia.Conclusion Propofol can inhibit the growth of the hippocampal AST and microglia in a dose-dependent manner.

propofol;hippocampus;neuroglia;astrocyte;microglia;neonatal mice

景勝(1982-)主治醫(yī)師，碩士研究生，主要從事麻醉藥物毒性研究。

△通訊作者,Tel:13883008811;E-mail：31011@sina.com。

·基礎(chǔ)研究

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.11.009

R994.1；R329.24

A

1671-8348(2015)11-1469-03

2014-11-08

2015-01-15)