黃桂蘭袁鈴 劉石磊 周世坤（國民核生化災害防護國家重點實驗室,防化研究院,北京102205）

原位磷?；苌?核磁共振法鑒定非磷化學毒劑前體

黃桂蘭*E-mail：hglhdm@163.com袁鈴 劉石磊 周世坤
（國民核生化災害防護國家重點實驗室,防化研究院,北京102205）

1H譜鑒定復雜基質(zhì)中禁止化學武器公約附表2的非磷化學毒劑前體化合物存在困難,一種替代方法是采用2-氯-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二噁磷雜戊環(huán)（CTMP）為衍生試劑,在核磁管中原位衍生含羥基的前體化合物并進行磷31-核磁共振譜測定。采用頻哪醇及3個同分異構體氨基醇類化合物：2-（N,N-二丙氨基）乙醇、2-（N-異丙基-N-丙基氨基）乙醇和2-（N-正丁基-N-乙基氨基）乙醇,考察了方法的專一性、穩(wěn)定性、靈敏度和選擇性。結果表明,本方法的衍生反應產(chǎn)物單一,穩(wěn)定性好,能清楚分辨同分異構體的氨基醇。本方法成功應用于禁止化學武器公約組織（OPCW）指定核查實驗室第32次官方水平考試,實現(xiàn)了有機液樣品中3個氨基醇同分異構體混合物（原始濃度10μg/mL）的檢測及鑒定。

磷31-核磁共振；原位衍生；非磷前體；化學毒劑；氨基醇；磷?；?/p>

1 引 言

二烷氨基乙醇、頻哪醇、烷基二乙醇胺是一類在制藥工業(yè)和化學毒劑合成中具有廣泛用途的化合物,其中二烷（甲、乙、正丙、異丙）氨基乙基-2-醇和頻哪醇被列為《禁止化學武器公約》附表2中B類前體化合物；乙基二乙醇胺、甲基二乙醇胺和三乙醇胺是附表3中B類前體化合物[1]。這些化合物作為監(jiān)控化學品,是聯(lián)合國禁止化學武器公約組織（OPCW）指定核查實驗室的水平考試、質(zhì)疑核查、反化學恐怖等行動中的檢測目標化合物。在實際的環(huán)境樣品和生物樣品基質(zhì)中,這類化合物的含量通常很低,在應用核磁共振技術直接檢測這些化合物時,只能采用氫譜（1H NMR）檢測方法[2]。由于1H譜化學位移范圍僅有十幾ppm,一個醇類化學毒劑前體化合物常存在多個1H NMR信號峰,并且每個峰多為多重峰,多數(shù)背景有機物的信號與這類化合物出現(xiàn)在相同區(qū)域,造成嚴重的背景干擾；另外,這些化合物存在相似結構,當它們同時存在樣品中時,信號互相重疊。在OPCW指定核查實驗室的水平考試中,核磁技術明確鑒定化合物的技術標準規(guī)定譜圖中目標化合物的所有譜峰均不受掩蓋[3]。因此,在實際樣品檢測中,1H NMR常無法滿足明確鑒定的要求。

核磁共振的磷譜（31P NMR）比氫譜的化學位移范圍寬得多,化學武器相關化合物的磷譜位移范圍一般在-30～200 ppm。在對氫去偶的條件下,31P{1H}NMR的譜峰信號表現(xiàn)為單峰,具有高分辨和高靈敏度的特點。另外,與一般基質(zhì)中含大量碳氫有機物不同,含磷化合物很少,磷譜檢測背景干擾很小。由于醇類化合物具有可供反應的活潑羥基,因此可以通過衍生反應的方式,將其轉換為含磷化合物,再應用31P{1H}NMR技術來檢測鑒定。磷衍生化的方法和試劑的種類繁多,磷酸/磷酸酐、磷酰鹵、磷酸酯及磷酰胺、環(huán)狀磷?；瘎┑瓤捎糜谥苯恿柞；椒?；間接磷酰化方法可利用烷基化劑、亞磷?；瘎?、縮合劑和醇活化等[4]。本研究組曾利用PCl3在核磁管中原位磷?；苌姆椒?實現(xiàn)了酒石酸對映體純度的磷譜測定[5]。含有1,3,2-二噁磷雜環(huán)的化合物是一類廣泛用于衍生含OH基團的醇、酚和羧酸的磷?；噭6],其中的2-氯-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二噁磷雜戊環(huán)（CTMP）多應用于木材[7]和食品[8,9]中組分的磷譜定量分析,并已用于化學式武器分析[10]。本研究選擇CTMP為磷酰化試劑,研究了原位磷衍生化反應的產(chǎn)物專一性、穩(wěn)定性、靈敏度、選擇性等特點,應用于OPCW指定核查實驗室第32次官方水平考試中,成功鑒定了公約附表中濃度為10μg/mL氨基醇化合物的同分異構體。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Varian NMR System 600超導核磁共振波譜儀（美國Varian公司）,600 MHz、5 mm脈沖梯度場雙通道寬帶多核共振探頭,工作站軟件VnmrJ 2.1B和VnmrJ 4.0。

2-氯-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二噁磷雜戊環(huán)（CTMP,分析純,美國Sigma-Aldrich公司）；氘代氯仿（CDCl3,99.8％氘代度,含0.03％TMS,CIL公司）；氘代NaOH（CIL）；吡啶（分析純,北京化工廠）。頻哪醇、2-（N,N-二丙氨基）乙醇、2-（N-異丙基-N-丙基氨基）乙醇、2-（N-正丁基-N-乙基氨基）乙醇及其與CTMP衍生反應產(chǎn)物的標準品由防化研究院第四研究所提供,經(jīng)過本實驗室核磁共振氫譜和磷譜測定,純度＞95％。

2.2 原位磷?；磻?/p>

氨基醇化合物溶解于經(jīng)過無水氯化鈣干燥的氘代氯仿,取0.7 mL轉移入核磁管中,先后加入2～10μL等體積的吡啶和CTMP,搖勻,室溫下放置1 h,進行31P{1H}NMR檢測。

2.3 有機液樣品的制備

2 mL有機液樣品用3×0.5mL D2O萃取,萃取液調(diào)至pH=12,用3×0.3 mL CDCl3反萃取并用無水Na2SO4干燥后,轉移入核磁管中,加入10μL CTMP和10μL吡啶,混勻并于室溫下放置反應1 h 后,31P{1H}NMR檢測,隨后繼續(xù)加入適量醇胺-CTMP衍生產(chǎn)物的合成標準品,重測磷譜,驗證產(chǎn)物峰重合。在0.7 mL CDCl3中同樣加入等量CTMP和吡啶作為空白樣品對照。

2.4 磷譜檢測條件

31P{1H}NMR檢測條件：31P核共振頻率：242.812 MHz；譜寬sw=59523.8 Hz；射頻中心位置：tof=26305.8 Hz；射頻功率：tpwr=54 dB；90度脈沖寬度：pw90=9.75 ms；檢測脈沖寬度：pw=3.25 ms；脈沖延遲時間：d1=0.3 ms；采樣時間：at=1 ms；氫去偶射頻功率：dpwr=42 dB；去偶方式：dm=′yyy′；去偶頻率中心：dof=0；采樣點：np=119048；濾波帶寬：fb=15000；接收機增益：gain=20；檢測溫度：25℃；化學位移定標是先采用85％H3PO4作為外標,確定CTMP的化學位移,在后續(xù)的實驗中以CTMP的化學位移定標。

3 結果與討論

3.1 磷酰化試劑的選擇

理想的核磁管中原位磷?；磻鬂M足以下條件：（1）反應溫和,反應溫度不能超過溶劑的沸點,最好在室溫下進行；（2）反應迅速,能在1 h內(nèi)反應完全；（3）反應產(chǎn)物單一,因為檢測的目標化合物濃度常在μg/mL濃度水平,反應產(chǎn)物若超過一個,造成產(chǎn)物濃度分散,達不到檢測濃度；（4）反應專一,抗基質(zhì)干擾能力強,適用于復雜基質(zhì),避免復雜的樣品凈化過程。CTMP在室溫下可與醇、酚和羧酸在吡啶中定量反應,衍生產(chǎn)物用磷譜測定,具有譜峰分辨率好、穩(wěn)定的優(yōu)點[11～14],已成為定量分析木材中的木質(zhì)素[15～17]、食品油中含羥基的甘油、甘油酯、脂肪酸、固醇、多酚類等組分[18]、生物汽油/柴油中甘油三酸酯、甘油和脂肪酸含量[19～21]、考古中的脂質(zhì)類化合物[22],以及評估纖維素反應活性[23]的有效手段。

CTMP與醇類化合物在室溫下進行反應的原理如圖1所示。吡啶作為縛酸劑,中和反應產(chǎn)生的HCl,促使反應平衡向磷?；a(chǎn)物方向進行。

圖1 醇與CTMP磷?；磻狥ig.1 Phosphitylation of alcohols using 2-chloro-4,4,5,5-tetramethyl-1,3-2-dioxaphspholane（CTMP）

3.2 磷?；磻a(chǎn)物的專一性和穩(wěn)定性

對于1～10μg/mL濃度水平的醇類化合物,要求其磷?；a(chǎn)物有足夠的穩(wěn)定性,以滿足31P{1H}譜測試時所必需的長時間累加的要求,同時要求產(chǎn)物單一,反應完全,以保證31P{1H}譜檢測所必需足夠的產(chǎn)物濃度。如圖2A所示,CTMP在氘代氯仿中的化學位移是176.457 ppm,與其它文獻報道一致。圖2A顯示,頻哪醇的氘代氯仿標準溶液中不存在其它含磷雜質(zhì)化合物。將過量CTMP和氘代吡啶加入到頻哪醇/氘代氯仿溶液的核磁管中,混勻,分別在0.5,2,6,12和48 h后測試31P{1H}譜,結果如圖2B所示：與圖2A（CTMP）相比,176.457 ppm的CTMP峰顯著降低,在147.457 ppm處出現(xiàn)了一個磷酰化產(chǎn)物2-頻哪基-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二噁磷雜戊環(huán)的峰。圖2A（CTMP）和圖2B中,19 ppm峰是兩個CTMP分子與1個水分子反應,脫去兩個HCl分子,形成的二聚體化合物[24]。該峰在后面的圖3C中比圖2A（CTMP）明顯增高,是因為空氣及氘代氯仿中含水,加入頻哪醇的氯仿標準溶液的操作增加了水分與CTMP的反應。圖2結果表明,頻哪醇與CTMP發(fā)生了磷?；磻?只有一種含磷產(chǎn)物。圖2B中殘余的176 ppm峰說明CTMP保證過量。不同時段檢測的31P{1H}譜結果相似,說明反應后的體系是穩(wěn)定的。

圖2 31P{1H}NMR譜：（A）CTMP和頻哪醇；（B）頻哪醇與CTMP的原位磷?；苌鶩ig.231P{1H}NMR spectra：（A）CTMP and pinacol；（B）in situ phosphorylation of pinacol using CTMP

3.3 磷酰化反應產(chǎn)物的分辨率

在同一體系中往往存在多種醇類化合物,應用磷?；磻a(chǎn)物作為鑒定依據(jù)的前提,要求不同的反應產(chǎn)物之間有足夠的分辨率,能相互區(qū)分。選擇3個同分異構體的氨基醇化合物：2-（N-異丙基-N-丙基氨基）乙醇、2-（N-正丁基-N-乙基氨基）乙醇、2-（N,N-二丙氨基）乙醇,分別測定各自的原位磷?；磻w系和三者混合后的原位磷?；磻w系的31P{1H}譜,如圖3所示。3個同分異構體的衍生產(chǎn)物在磷譜上的化學位移非常接近,相差不到0.5 ppm,僅靠測試標樣的磷譜來比對化學位移值難以確定對應的化合物,通過增大3個同分異構體的含量差值或單標加入的方式,根據(jù)產(chǎn)物信號強度比例,分辨出對應的化合物如圖3A所示。對于同分異構體的氨基醇化合物的磷?；苌?其磷?；a(chǎn)物的磷譜譜峰可以區(qū)分識別,滿足鑒定要求。

Mazumder等[10]認為這種方法不能識別非對稱的氨基醇,但本實驗結果表明,非對稱的同分異構體2-（N-異丙基-N-丙基氨基）乙醇和2-（N-正丁基-N-乙基氨基）乙醇與CTMP的原位衍生化產(chǎn)物在31P譜上的譜峰完全分離,化學位移差值達到0.37 ppm。文獻[10]采用400兆核磁共振波譜儀進行31P{1H}譜檢測,而本研究在600兆波譜儀上檢測,具有更高的分辨率,另外勻場條件和樣品狀態(tài)也對譜峰的分辨率有直接影響。

3.4 磷?；磻撵`敏度

根據(jù)OPCW水平考試配樣標準中規(guī)定的考試樣品基質(zhì)中添加的檢測目標化合物的濃度水平不小于1μg/mL的要求[25],以氘代氯仿為溶劑,配制了頻哪醇、2-（N,N-二丙氨基）乙醇、2-（N-異丙基-N-丙基氨基）乙醇和2-（N-正丁基-N-乙基氨基）乙醇4種化合物的混合標準溶液,濃度分別為5,10,20,50 和100μg/mL,各取0.7 mL加入5 mm核磁管中,加入等體積的吡啶和CTMP各2～10μL?；衔锬柋扔嬎惚砻?各加入1μL吡啶和CTMP時,對于上述濃度的溶液,已能保證CTMP過量。31P{1H}譜檢測結果表明,2～10μL不同體積的吡啶和CTMP對磷?；a(chǎn)物的檢測結果并無明顯影響。相比于Mazumder等[10]報道的方法,本方法不需要預先配制CTMP的氘代氯仿溶液和進行細致的計算,實驗操作上更簡單、反應到終點更快。在5μg/mL濃度水平下,累加次數(shù)15000次,累加時間5.5 h,窗函數(shù)lb=3時,4種磷?；a(chǎn)物的31P{1H}譜峰的信噪比大于9,已經(jīng)滿足定性鑒定的要求。由于本實驗中核磁共振儀器的含磷化合物的31P{1H}譜檢測靈敏度約為5μg/mL,因此,未測試1μg/mL的濃度水平。

圖3 氨基醇與CTMP原位磷?；苌蟮?1P{1H}NMR譜：（A）3種氨基醇的混合樣品；（B）2-（N-異丙基-N-丙基氨基）乙醇；（C）2-（N,N-二丙氨基）乙醇；（D）2-（N-正丁基-N-乙基氨基）乙醇Fig.331P{1H}NMR spectra of in situ phosphorylation of aminoalcohols：（A）themixture of three aminoalcohols；（B）2-（N-Isopropyl-N-propylamino）ethanol；（C）2-（N,N-Dipropylamino）ethanol；and（D）2-（N-Butyl-N-ethylamino）ethanol

3.5 磷酰化反應的選擇性

以上的磷?；磻窃诨衔锏碾确聵藴嗜芤褐羞M行的,沒有樣品基質(zhì)的影響,而考試化合物的樣品基質(zhì)中總要添加干擾背景化合物,如果原位磷?；磻梢灾苯討糜诤蓴_的基質(zhì)溶液,將可以省略樣品凈化的制備步驟,大大提高樣品的分析鑒定效率。為此,本研究將4種化合物的混合標準溶液分別加入到兩種基質(zhì)中,一種基質(zhì)組成是含500μg/mL汽油的十二烷,另一種是含0.5％柴油的正己烷。目標化合物的添加水平為5,10和50μg/mL。加入吡啶和CTMP進行原位磷?；磻?檢測31P{1H}譜?；|(zhì)中如果含微量水或其它與CTMP反應的組分,會導致CTMP不足,因此在開始31P{1H}譜累加時,需要先確認存在CTMP的峰,如在176 ppm位置無峰,需補充吡啶和CTMP。實驗結果表明,在保證CTMP過量的條件下,3個濃度水平下的4種磷?；a(chǎn)物峰均能檢出,但是當醇的濃度水平低于10μg/mL時,需要的累加次數(shù)大大增加,累加時間延長。如圖4所示,在含0.5％柴油的正己烷的基質(zhì)溶液中,4種醇的濃度在50μg/mL時,累加次數(shù)800次時,磷?；a(chǎn)物的信噪比已經(jīng)完全符合鑒定要求,并且不受干擾。但醇的濃度在10μg/mL時,累加次數(shù)30000次時,磷?；a(chǎn)物的信噪比勉強達到定性鑒定的要求,同時在檢測目標物峰的相近位移處出現(xiàn)其它雜質(zhì)峰,有的峰與目標產(chǎn)物峰重疊,干擾目標峰的檢出和識別。而4種醇的濃度為5μg/mL的混合CDCl3標準溶液的磷?；苌蟮?1P{1H}譜中并未出現(xiàn)這些雜峰,可見這些雜峰來自基質(zhì)溶液存在的化合物。因此,對于復雜基質(zhì)中低濃度水平的醇類化合物的直接原位磷酰化衍生,衍生產(chǎn)物的磷譜檢測可能會受到干擾,需對樣品進行凈化和濃縮后,再進行磷?；苌?。

3.6 磷酰化反應的實際應用

第32次OPCW官方水平考試有機液樣品的基質(zhì)是在十二烷中添加了500μg/mL汽油、濃度均為10μg/mL的2-（N,N-二丙氨基）乙醇、2-（N-異丙基-N-丙基氨基）乙醇和2-（N-正丁基-N-乙基氨基）乙醇[26]。針對同分異構體的部分譜峰重疊和基質(zhì)干擾,導致1H譜無法作為明確鑒定數(shù)據(jù)的問題,采用了磷酰化原位衍生的鑒定技術途徑。本研究先用重水萃取有機液樣品,再用氘代氯仿反萃取處理,原位磷?；苌确螺腿∫?31P{1H}譜檢測結果（圖5的OANE3P）與標準溶液模擬樣品SOANP的結果相似,信號強度和去干擾效果顯著好于直接衍生原始有機液樣品（OANP）。由于測試樣品的基質(zhì)不同, OANE3P和OANP的譜峰位移略有偏差。通過先后標準加入對應的高純度的磷酰化合成產(chǎn)物,完成了定性鑒定。

圖4 含0.5％柴油的正己烷溶液中醇與CTMP原位衍生的31P{1H}NMR譜：（A）醇濃度50μg/mL,累加800次；（B）醇濃度10μg/mL,累加30000次；（C）空白基質(zhì),累加30000次；2-（N,N-二丙氨基）乙醇1,2-（N-正丁基-N-乙基氨基）乙醇2,2-（N-異丙基-N-丙基氨基）乙醇3,頻哪醇4Fig.431P{1H}NMR spectra of themixture of four alcohols in hexane contained 0.5％diesel fuelafter in situ phosphorylation with CTMP：（A）50μg/mL of alcohols,number of scans=800；（B）10μg/mL of alcohols, number of scans=30000；（C）blank matrix,number of scans=30000；1,2-（N,N-Dipropylamino）ethanol；2,2-（N-Butyl-N-ethylamino）ethanol；3,2-（N-Isopropyl-N-propylamino）ethanol；4,pinacol

圖5 31P{1H}NMR譜：（A）直接原位磷?；苌?.5 mL有機液樣品（子樣編號：OANP）；（B）2 mL有機液樣品先用重水萃取,再用氘代氯仿反萃取重水溶液,最后原位磷?；苌确螺腿∫海ㄗ訕泳幪枺篛ANE3P）；（C）原位磷?；苌?-（N,N-二丙氨基）乙醇、2-（N-異丙基-N-丙基氨基）乙醇和2-（N-正丁基-N-乙基氨基）乙醇的混合標準溶液（子樣編號：SOANP）Fig.531P{1H}NMR spectra：（A）direct in situ phosphorylation of 0.5 mL of original organic sample （aliquot code：OANP）；（B）2 m L of organic sample was extracted with D2O firstly,then the D2O extractwas extracted with CDCl3,at last in situ phosphorylation of the CDCl3extract（aliquot code：OANE3P）；（C）in situ phosphorylation of the standard solution of themixture of2-（N,N-Dipropylamino）ethanol,2-（N-Isopropyl-N-propylamino）ethanol and 2-（N-Butyl-N-ethylamino）ethanol（aliquot code：SOANP）

4 結論

以2-氯-4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二噁磷雜戊環(huán)為衍生試劑,氘代氯仿為溶劑,在核磁管內(nèi)原位衍生醇類化合物測定磷譜的分析方法,反應專一、產(chǎn)物穩(wěn)定、磷譜分辨率高,且操作簡便,成功應用于OPCW官方水平考試有機液樣品中氨基醇化合物同分異構體的檢測鑒定。本研究表明,針對目前大多數(shù)核磁儀器缺乏在線色譜分離、檢測靈敏度低于其他光譜檢測器、靈敏度最高的核磁氫譜容易受到背景物質(zhì)干擾的缺點,采用原位衍生轉換檢測核,不僅可以有效解決干擾,同時還能將樣品制備過程簡化。在轉換檢測核的選擇上,不僅要考慮譜峰分辨率和基質(zhì)背景干擾的問題,還要考慮檢測靈敏度,因此,除了磷衍生化,還可氟衍生轉化為同樣具有高靈敏度和高分辨的氟核檢測；在轉換檢測核的樣品處理上,操作越簡單、轉換效率越高越有利于方法的應用。通過開展適用于核磁檢測的衍生化試劑和反應條件的研究,將有利于進一步發(fā)揮核磁技術在無損檢測復雜樣品中的作用。

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（Received 5 April2015；accepted 20 July 2015）

In Situ Phosphitylation for Nuclear M agnetic Resonance Identification of Precursors of Chem icalW arfare Agents

HUANG Gui-Lan*,YUAN Ling,LIU Shi-Lei,ZHOU Shi-Kun
（State key Laboratory ofNBC Protection for Civilian,Research Institute ofChemical Defence,Beijing 102205,China）

There is a trouble for1H NMR identification of non-phosphorus precursors of chemical warfare agents listed in Schedule 2,part B of Chemical Weapons Convention（CWC）in complex matrix.Analternativemethod was proposed for identification by in situ derivatization of the precursors containing hydroxyl functionswith 2-chloro-4,4,5,5-tetramethyl-1,3,2-dioxaphospholane（CTMP）in a NMR tube followed by phosphorus-31 NMR detection.The specificity,stability,sensitivity and selectivity of the method were evaluated with pinacol and three aminoalcohols isomers,2-（N,N-dipropylamino）ethanol,2-（N-butyl-N-ethylamino）ethanol and 2-（N-isopropyl-N-propylamino）ethanol.The results showed that the phosphorylation productswere single,stable and allowing clear distinction between aminoalcohols isomers.The method was used for the detection and identification of threemixed aminoalcohols isomers present（atoriginal concentration of 10μg/mL）in an organic sample from 32thOPCW Official Proficiency Tests.

Phosphorus-31 nuclear magnetic resonance；In situ derivatization；Non-phosphorus precursors；Chemical warfare agents；Aminoalcohols；Phosphitylation

10.11895/j.issn.0253-3820.150178

2015-04-05收稿；2015-07-20接受