王雪 程曉敏（安徽大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,合肥230039）

羥丙基殼聚糖在水溶液中的聚集行為研究

王雪 程曉敏*
（安徽大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院,合肥230039）

在乙酸-水-甲醇體系中,通過改變乙酸酐用量,對(duì)殼聚糖進(jìn)行乙?；磻?yīng),再以異丙醇為溶劑,環(huán)氧丙烷與堿化后的N-乙?；瘹ぞ厶欠磻?yīng)制備了不同脫乙酰度（DD 98％～55％）的羥丙基殼聚糖（HPCS）。核磁和紅外光譜結(jié)果表明,羥丙基化的取代過程主要發(fā)生在C3-OH和C6-OH上。采用帶有光散射檢測(cè)器的凝膠滲透色譜（GPC-MALS）、動(dòng)態(tài)光散射（DLS）、熒光光譜法和原子力顯微鏡（AFM）研究了HPCS在水溶液中的聚集行為。結(jié)果表明,在水溶液中,HPCS主要以單鏈分子和聚集體形式存在。HPCS中乙?；南鄬?duì)含量影響臨界聚集濃度（CAC）,DLS測(cè)得DD為98％和75％HPCS的CAC值分別為1.09和1.67mg/mL,與芘熒光探針法基本一致。水溶液中,HPCS聚集體存在兩種分布,一種為成膜堆砌高度低于13 nm,輪廓長(zhǎng)度約為70～200 nm的小尺寸聚集體,占大多數(shù)；另一種成膜堆砌高度約為13～31.4 nm,輪廓長(zhǎng)度約200～610 nm的大尺寸聚集體,約占20％。

羥丙基殼聚糖；光散射；聚集行為

1 引 言

殼聚糖是甲殼素脫乙?；笮纬傻墓δ芑嗵?具有良好的生物相容性、生物降解性及無毒性,并被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、化妝品、食品添加劑等領(lǐng)域[1～3]。由于殼聚糖在應(yīng)用時(shí)很多情況下須溶解在弱酸溶液中,殼聚糖產(chǎn)品的性能與其分子結(jié)構(gòu)和溶液性質(zhì)有重要的關(guān)系,殼聚糖在溶液中聚集行為的研究受到了廣泛關(guān)注。殼聚糖具有交聯(lián)聚集的特性,在分析化學(xué)領(lǐng)域也常用作吸附劑[4]。Wu等[5]采用動(dòng)態(tài)光散射法研究了殼聚糖水溶液中擴(kuò)散系數(shù)與分子量的關(guān)系,具有伸展鏈構(gòu)象的殼聚糖傾向形成聚集體,甚至在低分子量電解質(zhì)的存在下仍可以發(fā)生聚集。Yanagisawa等[6]采用尺寸排除色譜-多角度光散射法研究了不同分子量和不同脫乙酰度殼聚糖的溶液性質(zhì)。殼聚糖溶液中殘余微量的乙?；鶊F(tuán)（低至2％）就能夠引起聚集體的產(chǎn)生,導(dǎo)致溶液的非均一性,且無法避免或去除。

由于殼聚糖不溶于水和許多有機(jī)溶劑,在很大程度上限制了它的應(yīng)用。人們通過烷基化、羧甲基化和季氨化等多種化學(xué)改性反應(yīng)得到水溶性的殼聚糖衍生物[7～9]。羥丙基殼聚糖（HPCS）是一種重要的殼聚糖衍生物,具有良好的水溶性、抗菌和抗凝等特點(diǎn),廣泛應(yīng)用于藥物、皮膚修復(fù)和組織工程等領(lǐng)域[10～13]。目前,HPCS的相關(guān)研究多集中在制備方法[10,14～16]和應(yīng)用[11～13]等方面,而在中性水溶液中聚集行為的研究尚未報(bào)道。為了更好地拓展HPCS在生物領(lǐng)域,特別是藥物傳輸方面的應(yīng)用,研究其聚集行為是至關(guān)重要的[17～19]。

本實(shí)驗(yàn)制備了不同脫乙酰度的HPCS,用紅外光譜及核磁共振探究了其微觀結(jié)構(gòu)；采用帶有光散射檢測(cè)器的凝膠滲透色譜（GPC-MALS）、動(dòng)態(tài)光散射（DLS）、熒光光譜法和原子力顯微鏡（AFM）研究了HPCS在水溶液中的聚集行為,為HPCS在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用提供依據(jù)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 試劑

殼聚糖（生化試劑,成都市科龍化工試劑廠）；1,2-環(huán)氧丙烷、異丙醇、甲醇、乙醇、丙酮、氨水、乙醚、冰醋酸等（分析純,國(guó)藥化學(xué)試劑有限公司）；NaCl（色譜純,天津光復(fù)科技發(fā)展公司）；芘（95％,薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司）；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

2.2 不同脫乙酰度羥丙基殼聚糖的制備

參照文獻(xiàn)[20],通過改變乙酸酐和殼聚糖的摩爾比（約為0～0.6）,制備脫乙酰度為98％,88％, 75％,67％和55％的殼聚糖,編號(hào)為CS-R（R=1～5）。產(chǎn)物置于40℃真空烘箱中干燥24 h。

不同脫乙酰度羥丙基殼聚糖的合成路線見圖1。在三頸瓶中加入2 g CS,5 mL 40％（w/V）NaOH 和20 mL異丙醇,室溫下攪拌堿化1 h,然后加入5 mL 9％（V/V）的四甲基氫氧化銨和20 mL環(huán)氧丙烷,室溫下攪拌30 min后升溫至60℃,攪拌反應(yīng)6 h,反應(yīng)結(jié)束后用15％（V/V）HCl溶液中和至中性,用丙酮沉淀出產(chǎn)物,并多次洗滌沉淀物。最后,真空干燥至恒重。即可得到不同脫乙酰度的羥丙基殼聚糖HPCS-R（R=1～5）。

圖1 不同脫乙酰度羥丙基殼聚糖的合成路線Fig.1 Synthesis procedure of hydroxypropyl chitosans（HPCS）with different degrees of deacetylation（DD）values

2.3 HPCS結(jié)構(gòu)表征

NEXUS-870型傅里葉變換紅外儀（美國(guó)尼高利公司）：KBr壓片法,波長(zhǎng)掃描范圍在4000～500 cm-1,分辨率4 cm-1。Bruker 400 MHz型核磁共振儀（NMR,瑞士布魯克公司）：以重水（D2O）為溶劑,四甲基硅烷（TMS）為內(nèi)標(biāo)。

2.4 HPCS聚集行為研究

GPC-MALS-RI體系（美國(guó)Wyatt公司）,主要包括凝膠滲透色譜柱（GPC）、DAWN HELEOS-Ⅱ多角激光光散射檢測(cè)器（MALLS）和Optilab Rex型示差檢測(cè)器（RI）,采用AstraV軟件處理數(shù)據(jù)。樣品濃度為2mg/mL（w/V）,進(jìn)樣量50.0μL,激發(fā)波長(zhǎng)658 nm,以0.1 mol/L NaCl溶液為流動(dòng)相,流速0.5 mL/min,測(cè)試溫度25℃。

Hitachi F-7000型熒光光譜儀（日本Hitachi公司）：1 cm石英池,激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫帶寬均為5 nm,激發(fā)波長(zhǎng)337 nm,發(fā)射光波范圍360～440 nm,掃描速度300 nm/min。芘在水中的最終濃度6.0×10-7mol/L。

CSPM500型原子力顯微（AFM）（中國(guó)納米本原）：測(cè)試膜尺寸為10 mm×10 mm。采用輕敲模式在大氣環(huán)境、室溫下進(jìn)行成像觀察。

3 結(jié)果與討論

3.1 不同脫乙酰度羥丙基殼聚糖的微觀結(jié)構(gòu)

3.1.1 紅外圖譜分析由不同脫乙酰度殼聚糖的FT-IR光譜圖（圖2a）可見,殼聚糖乙酰化后,保持了在3450 cm-1處的OH與NH 的伸縮振動(dòng)重疊而成的寬峰。2920 cm-1附近甲基或次甲基的CH伸縮振動(dòng)吸收峰增強(qiáng),1655和1310 cm-1處出現(xiàn)了較為明顯的酰胺和酰胺特征峰,1550 cm-1出現(xiàn)了新的酰胺特征峰。說明殼聚糖發(fā)生了乙?；磻?yīng)。此外,隨著乙酰度的增加,1600 cm-1處的NH2吸收峰強(qiáng)度逐漸減弱,說明殼聚糖的乙?；饕l(fā)生在NH2上。圖2b為羥丙基殼聚糖（HPCS-5）的FT-IR光譜圖。對(duì)比CS-5,HPCS-5在2973和1376 cm-1處出現(xiàn)新峰,分別屬于CH3中的CH伸縮振動(dòng)吸收峰和彎曲振動(dòng)峰,表明CS與環(huán)氧丙烷反應(yīng)后,CS分子鏈上引入了CH3。另外,1030和1160 cm-1（分別歸屬于CS上3-OH和6-OH的C-O振動(dòng)吸收峰）消失,表明羥丙基化取代過程主要發(fā)生在 C3OH和C6OH上。

3.1.2 核磁氫譜分析由HPCS的1H-NMR譜圖（圖3）可知,δ=1.1附近出現(xiàn)了明顯的CH3質(zhì)子峰,證明在殼聚糖分子鏈上引入了羥丙基[8]；δ=2.02處是甲殼素脫乙酰化不完全殘留的乙?；∣CCH3）的甲基質(zhì)子峰,δ=2.56～2.81是C2上H的振動(dòng)吸收峰；δ=3.57～3.9歸屬于C3-C8上H的振動(dòng)吸收峰。

圖2 （a）不同脫乙酰度殼聚糖和（b）羥丙基殼聚糖的紅外譜圖Fig.2 FTIR spectra of（a）chitosan（CS）with different DD values and（b）HPCS

圖3 羥丙基殼聚糖的1H-NMR譜圖Fig.31H-NMR spectrum of HPCS

3.2 CPC-MALS-RI信號(hào)分析

由不同脫乙酰度HPCS樣品的激光光散射（LS）和示差指數(shù)（RI）信號(hào)（圖4）可見,RI信號(hào)為單峰,而LS信號(hào)中則含有兩個(gè)峰。HPCS-1的 LS信號(hào)中,高淋洗體積（約為7.2 mL）處的峰代表HPCS的單鏈分子。低淋洗體積（約為5.5 mL）處的小肩峰對(duì)應(yīng)的RI示差信號(hào)峰很小,這種LS 和RI信號(hào)之間不匹配的關(guān)系意味著其溶液體系具有不均一性。與之類似,HPCS-2～5樣品的LS和RI信號(hào)也呈現(xiàn)了類似現(xiàn)象,說明HPCS-2～5水溶液同樣具有不均一性,存在聚集體。隨著 HPCS分子中乙?；康脑黾樱℉PCS-2→HPCS-5）,聚集體的峰面積增大,分子量范圍為3.16×105～8.35×105g/mol；而單鏈分子的峰面積減小,分子量范圍為1.13×105～1.75×105g/mol,但RI信號(hào)峰面積基本沒有變化。說明聚集體的存在與HPCS中乙酰基的含量有關(guān)。乙?；吭礁?聚集體數(shù)目越多。

3.3 光散射強(qiáng)度分析

當(dāng)溶液中高分子鏈發(fā)生聚集時(shí),隨著聚集體數(shù)不斷增加,光散射強(qiáng)度會(huì)不斷增強(qiáng)。因此利用散射光強(qiáng)度-溶液濃度曲線中的突變點(diǎn)可以確定臨界聚集濃度。HPCS光散射強(qiáng)度隨濃度變化的關(guān)系見圖5。

利用曲線中的突變點(diǎn)得到HPCS-1和HPCS-3的CAC分別為1.09和1.67mg/mL。由此可見, HPCS的CAC值隨乙?；鶊F(tuán)量的增加而增大。結(jié)果表明,疏水基團(tuán)N-乙?；鶊F(tuán)含量增加,促進(jìn)了HPCS的聚集。可能是因?yàn)镠PCS分子鏈上羥丙基、氨基及羥基的存在,使分子間形成較強(qiáng)的氫鍵,同時(shí)疏水基團(tuán)例如乙酰基和糖苷環(huán)之間的相互作用導(dǎo)致HPCS聚集。

圖4 不同脫乙酰度HPCS光散射（LS）和相對(duì)示差（RI）檢測(cè)器的GPC圖Fig.4 Gel permeation chromatogram（GPC）of HPCS samples with various DD values from light scattering （LS）and refractive index（RI）detectors

圖5 HPCS光散射強(qiáng)度隨濃度變化圖Fig.5 Light scattering intensity as a function of HPCS concentration

圖6 HPCS水溶液中芘的I1/I3值隨羥丙基殼聚糖濃度變化圖Fig.6 Variation of I1/I3with HPCS concentration in aqueous solution

3.4 熒光光譜分析

芘熒光探針法是普遍采用的測(cè)定高分子在水溶液中臨界聚集濃度的方法。圖6為芘熒光光譜中羥丙基殼聚糖樣品的I1/I3隨濃度變化的曲線。根據(jù)芘熒光光譜中的I1/I3強(qiáng)度比值的水平部分與急劇下降部分的曲線轉(zhuǎn)折點(diǎn)可作為殼聚糖的 CAC[21],得到 HPCS-1和 HPCS-3的 CAC分別為1.05和1.73mg/mL。

綜上可知,動(dòng)態(tài)光散射法可以方便地測(cè)定高分子在水溶液中的臨界聚集濃度,且測(cè)定結(jié)果與芘熒光探針法基本一致。

3.5 AFM形貌分析

采用AFM觀測(cè)到羥丙基殼聚糖（圖7）尺寸分布不均勻的聚集體。羥丙基殼聚糖溶液中的聚集體存在兩種分布,一種為高度低于13 nm,輪廓長(zhǎng)度約為70～200 nm的小尺寸聚集體,占大多數(shù)；另一種高度約為13～31.4 nm,輪廓長(zhǎng)度約200～610 nm的大尺寸聚集體,約占20％。Winnik等[22]在研究殼聚糖溶液性質(zhì)時(shí)發(fā)現(xiàn),殼聚糖存在少量的聚集,且不同殼聚糖分子很可能通過片段之間的側(cè)向連接發(fā)生聚集。羥丙基基團(tuán)引入殼聚糖分子鏈并沒有改變殼聚糖本身的結(jié)構(gòu),所以羥丙基殼聚糖分子間的聚集也是通過片段之間的側(cè)向連接而發(fā)生的。

圖7 HPCS聚集體的AFM圖Fig.7 AFM images of HPCSaggregates

4 結(jié) 論

通過改變乙酸酐與殼聚糖的摩爾比,制備了脫乙酰度為98％～55％的HPCS。GPC-MALS結(jié)果表明,HPCS在水溶液中可以發(fā)生聚集,且聚集體的存在與HPCS所含乙酰基的量有關(guān)。通過光散射和穩(wěn)態(tài)熒光光譜法確定了HPCS聚集體的CAC,兩種測(cè)量的結(jié)果接近,CAC數(shù)值隨著HPCS中乙酰基含量的增加而增大。在HPCS水溶液中,存在兩種不同尺寸的聚集體,尺寸范圍分別為200～610 nm和70～200 nm,其中大尺寸的聚集體,約占20％。

1 Sarvaiya J,Agrawal Y K.Int.J.Biol.Macromol.,2015,72：454-465

2 CUIHong-Min,CHEN Ji,YANG Hua-Ling,WANGWei,LIU Yu,DENG Yue-Feng,ZHANG Dong-Li.Chinese J.Anal.Chem.,2014,42（3）：446-451

崔紅敏,陳繼,楊華玲,王威,劉郁,鄧岳鋒,張冬麗.分析化學(xué),2014,42（3）：446-451

3 Friedman M,Juneja V K.J.Food Protect,2010,73（9）：1737-1761

4 HUANG Zhong-Hua,SUN Xiu-Yun,LIYan,GEWei,WANG Jun-De.Spectroscopy and Spectral Analysis,2005,25（5）：698-700

黃中華,孫秀云,李燕,葛瑋,王俊德.光譜學(xué)與光譜分析,2005,25（5）：698-700

5 Wu C,Zhou SQ,WangW.Biopolymers,1995,35（4）：385-392

6 Yanagisawa M,Kato Y,Yoshida Y,Isoogai A.Carbohyd.Polym.,2006,66（2）：192-198

7 Sajomsang W,Tantayanon S,Tangpasuthadol V,Daly W H.Carbohyd.Polym.,2008,72（4）：740-750

8 Faizuloev E,Marova A,Nikonova A,Volkova I,Gorshkova M,Izumrudov V.Carbohyd.Polym.,2012,89（4）：1088-1094

9 Fernanda R D A,Sérgio PC F.Carbohyd.Polym.,2009,75（2）：214-221

10 Peng Y F,Han BQ,Liu W S,Xu 1X J.Carbohyd.Res.,2005,340（11）：1846-1851

11 Wang Z H,Yan Y B,Jiang Y Y,LiW,Hu X C,Fu B Q,Xia C F,Qin C Q.Int.J.Biol.Macromol.,2014,64：25-29

12 Yiang Y,Liu W S,Han B Q,Yang C Z,Ma Q,Song F L,Bi Q Q.Colloid Surface B,2011,82（1）：1-7

13 Wang S L,Liu W S,Han BQ,Yang L L.Appl.Surf.Sci.,2009,255（20）：8701-8705

14 Wan Y,Creber K A M,Peppley B,Bui V T.J.Polym.Sci.Phys.B,2004,42（8）：1379-1397

15 Zhang C,Ping Q N,Ding Y.J.Appl.Polym.Sci.,2005,97（5）：2161-2167

16 Fan L H,LiM J,Gong Y G,Peng K,Xie W G.J.Appl.Polym.Sci.,2012,125（2）：829-835

17 Shi M,Shoichet M S.J.Biomat Sci-Polym.E,2008,19（9）：1143-1157

18 Kwon G S,Forrest M L.Drug Develop.Res.,2006,67（1）：15-22

19 LIN Bao-Feng,LIYan-Ming,ZHOU Yu-Lian,DU Yu-Min.Acta Polymerica Sinica,2011,3（3）：267-273林寶鳳,黎演明,周妤蓮,杜予民.高分子學(xué)報(bào),2011,3（3）：267-273

20 Schatz C,Viton C,Delair T,Pichot C,Domard A.Biomacromolecules,2003,4（3）：641-648

21 Fee M,Errington N,Jumel K,Illum L,Smith A,Harding SE.Eur.Biophys.J.,2003,32（5）：457-464

22 Winnik FM,Winnik M A,Tazuke S.J.Phys.Chem.,1987,91（3）：594-597

23 Philippova O E,Volkov E V,Sitnikova N L,Khokhlov A R,Desbrieres J,Rinaudo M.Evgenii V V,Natalia L S,Alexei R K.Biomacromolecules,2001,2（2）：483-490

（Received 20 May 2015；accepted 10 August2015）

Study on Aggregation Behavior of Hydroxypropyl Chitosan in Aqueous Solution

WANG Xue,CHENG Xiao-Min*
（College ofChemistry and Chemical Engineering,Anhui University,Hefei230039,China）

Hydroxypropyl chitosan（HPCS）with various degrees of deacetylation（DD 98％-55％）was successfully prepared by the reaction of pre-basified N-acetylchitosan and propylene epoxidewith ispropanol as solvent.The acetylations of chitosan at N-position were carried out by changing the dosage of acetic anhydride in acetic acid-water-methanol solution.The hydroxypropyl substitutionmainly occurred atboth C3-OH and C6-OH groups,which was approved by FTIR and1H-NMR.The aggregation behavior of HPCS samples was carefully investigated by gel permeation chromatography with multi-angle light scattering（GPC-MALS）, dynamic light scattering（DLS）,fluorescence spectrometry and atomic forcemicroscope（AFM）.The results indicated that HPCS single chains and aggregates were coexistence in aqueous solution.With the increasing content of N-acetyl of HPCS, the apparent aggregation number increased. The critical aggregation concentration（CAC）from DLSwere 1.09mg/mL for HPCSwith DD 98％and 1.67mg/mL for HPCSwith DD 75％,which were consistent with the results of pyrene probe fluoresce spectrometry.The content of N-acetyl groups had an effect on the CAC values.Two types of HPCS（DD 55％）aggregates occurred in aqueous solution.Themajority was smaller aggregates with lower than 13 nm in height after film pilling and 70-200 nm in length,while the minority（about 20％）was comparatively larger aggregates with about 13-31.4 nm in height after film pilling and 200-610 nm in length.

Hydroxypropyl chitosan；Light scattering；Aggregation behavior

10.11895/j.issn.0253-3820.150416

2015-05-20收稿；2015-08-10接受

本文系安徽省綠色高分子重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和教育部創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)培育計(jì)劃資助項(xiàng)目

E-mail：xmcheng@adu.edu.cn