廖小晴王會(huì)影李在均,（江南大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院,食品膠體與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,無(wú)錫4）

過(guò)氧化氫與L-半胱氨酸對(duì)BSA-Cu體系熒光“開(kāi)-關(guān)”響應(yīng)及分析應(yīng)用

廖小晴1王會(huì)影1李在均*1,2
（江南大學(xué)化學(xué)與材料工程學(xué)院1,食品膠體與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室2,無(wú)錫214122）

在堿性條件下,牛血清白蛋白（BSA）與銅離子（Cu2+）形成穩(wěn)定的BSA-Cu配合物,加入H2O2可顯著加快銅納米簇的形成,導(dǎo)致體系熒光強(qiáng)度迅速增加。本研究基于對(duì)BSA-Cu體系的熒光“開(kāi)-關(guān)”響應(yīng),建立了測(cè)定H2O2的熒光動(dòng)力學(xué)分析方法。H2O2濃度在1.0×10-6～1.5×10-3mol/L之間,熒光強(qiáng)度的增加與H2O2濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,方法的檢出限達(dá)到3.1×10-7mol/L（S/N=3）；收集檢測(cè)完H2O2的銅溶液,室溫放置,使Cu2+完全轉(zhuǎn)化為銅納米簇,體系熒光強(qiáng)度逐步增加到最大,加入L-半胱氨酸產(chǎn)生熒光猝滅。基于對(duì)BSA-Cu體系的熒光“關(guān)”響應(yīng),建立了測(cè)定L-半胱氨酸的熒光分析方法。當(dāng)L-半胱氨酸濃度在2.0×10-4～1.0×10-2mol/L范圍,熒光強(qiáng)度隨 L-半胱氨酸濃度的增加而線性下降,方法檢出限為 5.7×10-5mol/L （S/N=3）；廢液經(jīng)高溫灰化和稀H2SO4溶解,可實(shí)現(xiàn)銅簇向Cu2+的轉(zhuǎn)化,然后再按本方法進(jìn)行H2O2與L-半胱氨酸的測(cè)定。利用Cu2+與銅納米簇之間相互轉(zhuǎn)化,可實(shí)現(xiàn)H2O2和L-半胱氨酸連續(xù)檢測(cè)的循環(huán)和銅的重復(fù)利用。本方法具有靈敏、低成本和環(huán)保等優(yōu)勢(shì),可廣泛應(yīng)用于H2O2和L-半胱氨酸的日常分析。

銅離子；銅納米簇；熒光探針；過(guò)氧化氫；L-半胱氨酸

1 引 言

金屬納米簇是由幾十到幾百個(gè)原子組成的新型納米材料。不同于金屬原子、金屬納米粒子和金屬單質(zhì),金屬納米簇尺寸接近電子的費(fèi)米波長(zhǎng),可產(chǎn)生不連續(xù)的電子能級(jí),表現(xiàn)出獨(dú)特的光學(xué)、電學(xué)及化學(xué)性質(zhì)[1,2]。相對(duì)于半導(dǎo)體量子點(diǎn)[3]和有機(jī)熒光染料[4],金屬納米簇不僅可產(chǎn)生尺寸依賴且可調(diào)的熒光,還有許多其它優(yōu)良性能。例如,斯托克位移較大、熒光量子效率高和生物相容性好。目前,金屬納米簇已廣泛應(yīng)用于熒光檢測(cè)、細(xì)胞成像和生物標(biāo)記等領(lǐng)域[5～7]。

銅在電導(dǎo)率和成本方面優(yōu)于貴金屬,銅納米簇的合成與應(yīng)用近年受到關(guān)注。然而,銅化學(xué)活性高,對(duì)空氣和水都不穩(wěn)定,導(dǎo)致水溶性銅納米簇的制備比貴金屬納米簇更為困難。研究表明,穩(wěn)定劑是影響銅納米簇的形成及光學(xué)性能的重要因素。目前,用于水溶性銅納米簇合成的穩(wěn)定劑有聚乙烯亞胺[8]、組氨酸[9]、半胱氨酸[10]、青霉胺[11]、谷胱甘肽[12]、DNA[13,14]、牛血清白蛋白（BSA）[15,16]、溶菌酶[17]、胰蛋白酶[18]和轉(zhuǎn)鐵蛋白[19]等。其中,以BSA最為常用[20]。BSA含有583個(gè)氨基酸殘基、由35個(gè)半胱氨酸組成的17個(gè)二硫鍵和1個(gè)游離巰基。游離巰基的存在使BSA具有一定還原能力,因此BSA在銅納米簇制備同時(shí)起到穩(wěn)定劑、螯合劑和還原劑的作用。由于銅的標(biāo)準(zhǔn)電極電勢(shì)低于金和銀,BSA還原Cu2+生成Cu0的反應(yīng)速度慢,使銅納米簇的制備需要較長(zhǎng)的時(shí)間。此外,制備的銅納米簇中存在較高濃度的Cu2+,限制了它在生物、醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域的直接應(yīng)用。最近,研究人員嘗試引入水合肼等較強(qiáng)還原劑制備水溶性銅納米簇,但效果并不理想[21]。

本研究以BSA作為穩(wěn)定劑制備水溶性銅納米簇,并對(duì)其動(dòng)力學(xué)過(guò)程進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)H2O2對(duì)銅納米簇的形成具有顯著催化作用?；贖2O2和L-半胱氨酸對(duì)BSA-Cu體系熒光“開(kāi)-關(guān)”響應(yīng),建立了定量檢測(cè)H2O2和L-半胱氨酸的熒光分析方法。本方法具有快速、靈敏、成本低和環(huán)保的特征,已成功應(yīng)用于藥物樣品中H2O2和L-半胱氨酸的測(cè)定。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Cary Esclipse熒光光度計(jì)（美國(guó)瓦里安公司）；TU-1901雙光束紫外-可見(jiàn)分光光計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；JEM-2100（HR）透射電子顯微鏡（日本JEOL公司）；MOS-450圓二色光譜儀（法國(guó)Bio-Logic公司）；Zeta PALSZeta電位及納米粒度分析儀（美國(guó)布魯克海文公司）；Lab Dancer漩渦振蕩器（德國(guó)IKA公司）；ZF-1型三用紫外分析儀（上海驥輝分析儀器有限公司）。

牛血清白蛋白（BSA）、五水硫酸銅、酒石酸鉀鈉、H2O2（30％）、酒石酸鉀鈉和L-半胱氨酸純度至少為分析純,均購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司。BSA溶液：1.5 g BSA溶于100 mL水。Cu2+溶液：將0.22g CuSO4·5H2O和0.42 g酒石酸鉀鈉溶于100 mL水中,然后用1.0 mol/L NaOH調(diào)至pH 12。H2O2溶液：移取1.0 mL 30％H2O2,加水稀釋并定容至250 mL,采用高錳酸鉀滴定法測(cè)定準(zhǔn)確濃度。吸取適量此溶液,用水稀釋至所需要的濃度。L-半胱氨酸溶液：0.121g L-半胱氨酸溶于100 mL水。0.01 mol/L PBS緩沖溶液（Na2HPO4-KH2PO4-NaCl-KCl,pH 7.4）。實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水（一次蒸餾水經(jīng)石英亞沸蒸餾器蒸餾制得）。

2.2 H2O2的測(cè)定

移取1.0 mL BSA溶液于5 mL離心管,加入0.5 mL Cu2+溶液,振蕩5 s,加入不同體積的H2O2溶液,用水定容至2.0 mL,振蕩5 s,于45℃的恒溫水浴中保溫5min,然后分別以320和420 nm作為激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng),在熒光分光度計(jì)上測(cè)定熒光強(qiáng)度或進(jìn)行光譜掃描。

2.3 L-半胱氨酸的測(cè)定

移取0.4mL PBS緩沖溶液于5 mL離心管中,加入0.25 mL銅納米簇溶液,振蕩5s,加入不同體積的L-半胱氨酸溶液,用水定容至1.0 mL,振蕩5 s,室溫放置30min,然后分別以320和420 nm作為激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng),在熒光分光度計(jì)上測(cè)定熒光強(qiáng)度或進(jìn)行光譜掃描。

2.4 Cu0與Cu2+的轉(zhuǎn)化

收集檢測(cè)L-半胱氨酸后的含銅廢液,加熱除去水分。將殘?jiān)D(zhuǎn)移至鉑鉗鍋,然后放入馬弗爐,以5℃/min速率升溫至650℃,保溫至樣品中黑色的碳完全消失為止。取出鉗鍋,冷卻,最后用2 mol/L H2SO4溶解得到CuSO4溶液。

3 結(jié)果與討論

3.1 BSA-Cu配合物的形成

通常,CuSO4溶液遇強(qiáng)堿即生成Cu（OH）2沉淀,不利于分析過(guò)程中的準(zhǔn)確移取。本研究準(zhǔn)備Cu2+儲(chǔ)備液時(shí),預(yù)先在CuSO4溶液中加入酒石酸鉀鈉。Cu2+與酒石酸鉀鈉反應(yīng)生成水溶性配合物,再加入NaOH溶液就不會(huì)產(chǎn)生Cu（OH）2沉淀,得到的Cu2+儲(chǔ)備液為淺藍(lán)色透明溶液。由于Cu2+與BSA中的多個(gè)肽鍵在堿性環(huán)境下配位形成更穩(wěn)定的雙縮脲類絡(luò)合物[22],將Cu2+溶液與BSA溶液混合溶液顏色迅速變?yōu)樽仙?表明Cu-酒石酸已轉(zhuǎn)化為水溶性的BSA-Cu配合物。

為了研究BSA-Cu配合物的形成過(guò)程,分別測(cè)定了CuSO4、Cu-酒石酸和BSA-Cu溶液的吸收光譜。從圖1可知,上述3種溶液的顏色存在明顯差異,它們的最大吸收波長(zhǎng)分別位于800、640和540 nm,且吸收峰重疊程度小。因此,通過(guò)觀察溶液顏色的變化或測(cè)定它們的吸收光譜,可了解BSA-Cu配合物的形成過(guò)程。圖1B是BSA濃度與BSA-Cu溶液最大吸收波長(zhǎng)下吸光度的關(guān)系曲線。當(dāng)固定溶液中Cu2+儲(chǔ)備液加入量為1 mL時(shí),隨著B(niǎo)SA溶液加入體積增加,BSA-Cu體系在540 nm處的吸光度迅速增大,表明有更多的Cu-酒石酸轉(zhuǎn)化為BSA-Cu配合物。當(dāng)BSA體積增大到2 mL時(shí),吸光度達(dá)到最大。繼續(xù)增加BSA的濃度,吸光度基本保持不變,說(shuō)明溶液中Cu-酒石酸已完全轉(zhuǎn)化為BSA-Cu配合物。BSA-Cu配合物的形成顯著降低了體系中游離Cu2+的濃度,導(dǎo)致Cu2+/Cu0的還原電位降低,有利于加快銅納米簇形成速率。為進(jìn)一步提高BSA-Cu配合物的穩(wěn)定性,銅納米簇合成中BSA溶液用量選擇為3 mL。

圖1 A：CuSO4（a）、Cu-酒石酸（b）和BSA-Cu（c）溶液的吸收光譜；B：BSA的體積與BSA-Cu溶液最大吸收波長(zhǎng)下吸光度關(guān)系曲線。Fig.1 A：Absorption spectra of CuSO4（a）,Cu-tartrate（b）and BSA-Cu solution（c）.Inset：Optical photographs of CuSO4（I）,Cu-tartrate（II）,BSA-Cu solution（III）.B：Relationship curve of BSA volume with absorbance atmaximum absorption wavelength of the BSA-Cu solution

3.2 H2O2對(duì)銅納米簇形成的催化行為

BSA在銅納米簇的制備過(guò)程中發(fā)揮著多種功能。一方面,BSA中的巰基與Cu+結(jié)合形成穩(wěn)定的CuS鍵,銅納米簇表面包裹一層致密的BSA親水性殼,從而顯著提升了納米簇的穩(wěn)定性和在水中的溶解度。另一方面,BSA中的游離巰基有一定還原性,可將BSA-Cu中的Cu2+還原為Cu0,形成銅納米簇。由圖2可見(jiàn),BSA-Cu溶液有一個(gè)弱小的熒光發(fā)射峰,表明產(chǎn)生了銅納米簇。然而,熒光強(qiáng)度增加非常緩慢。這是因?yàn)锽SA還原Cu2+的能力較弱,銅納米簇的形成需要較長(zhǎng)時(shí)間才能完成。為了加快銅納米簇的生成,在體系中引入少量H2O2作為催化劑,此時(shí)體系熒光強(qiáng)度顯著增長(zhǎng)。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過(guò)10min,熒光強(qiáng)度的增勢(shì)變緩,隨后增加幅度與未加H2O2時(shí)相當(dāng)。實(shí)驗(yàn)表明,H2O2對(duì)銅納米簇的形成具有高效催化作用。隨著H2O2的消耗殆盡,銅納米簇的產(chǎn)生速率也趨于平常。

圖2 BSA-Cu體系在無(wú)H2O2（a）和1.0×10-3mol/LH2O2存在下（b）的熒光光譜（A）及420 nm處的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化曲線（B）。激發(fā)波長(zhǎng)、反應(yīng)溫度和時(shí)間分別為320 nm、45℃和10minFig.2 Fluorescence spectra（A）and change curves（B）of BSA-Cu system in the absence of H2O2（a）and the presence of 1.0×10-3mol/L H2O2（b）.The excitation wavelength,reaction temperature and time are 320 nm,45℃ and 10min,respectively

同步熒光和圓二色譜技術(shù)被應(yīng)用于研究H2O2加入前后BSA構(gòu)型的變化。圖3是BSA和BSA-Cu配合物加入H2O2前后的同步熒光光譜。通常,同步熒光光譜能給予一些發(fā)色團(tuán)的分子環(huán)境信息,如BSA中的酪氨酸和色氨酸。同步熒光光譜中最大發(fā)射峰的移動(dòng)反映了發(fā)色團(tuán)分子極性環(huán)境的變化。當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)與發(fā)射波長(zhǎng)的Δλ為15和60 nm時(shí),同步熒光光譜給予的分別是酪氨酸和色氨酸的環(huán)境特征信息[23]。從圖3可見(jiàn),H2O2加入后BSA和BSA-Cu的酪氨酸和色氨酸熒光強(qiáng)度都有增強(qiáng),這證明H2O2的加入導(dǎo)致BSA和BSA-Cu結(jié)構(gòu)變化,增加了酪氨酸和色氨酸的暴露程度,導(dǎo)致同步熒光強(qiáng)度有所增加。

圖3 H2O2加入前（b）后（a）BSA的同步熒光光譜,H2O2加入前（d）后（c）BSA-Cu同步熒光光譜Fig.3 SynchronousfluorescencespectraofBSAbefore（b）andafter（a）addedH2O2,synchronous fluorescencespectraofBSA-Cubefore（d）andafter（c）addedH2O2（b）Δλ：15nm（A）and60nm（B）,pH：12,BSA：15mg/mL,H2O2：1.0×10-3mol/L

圓二色譜分析結(jié)果可以反映蛋白中二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。表1是BSA、BSA-H2O2、BSA-Cu和BSA-Cu-H2O2體系中BSA的二級(jí)結(jié)構(gòu)。表1表明,H2O2的加入降低了BSA的α-螺旋結(jié)構(gòu),增加了β-轉(zhuǎn)角和無(wú)序結(jié)構(gòu),這說(shuō)明H2O2破壞了BSA中部分有序結(jié)構(gòu)。相對(duì)于BSA的二級(jí)結(jié)構(gòu),BSA-Cu體系中α-螺旋結(jié)構(gòu)比例明顯減少。因?yàn)镃u2+破壞了蛋白質(zhì)中氨基酸殘基亞氨基 （NH）上的氫原子和羰基上的氧原子之間形成的氫鍵,繼而與肽鏈形成配合物。表1還顯示,在BSA-Cu溶液中加入H2O2后,α-螺旋結(jié)構(gòu)的比例進(jìn)一步降低,證明Cu2+催化存在下H2O2對(duì)BSA具有更強(qiáng)的破壞作用,基團(tuán)暴露程度更大,導(dǎo)致α-螺旋等有序結(jié)構(gòu)進(jìn)一步下降。

表1 不同體系中BSA的二級(jí)結(jié)構(gòu)Table1 SecondarystructuresofBSAindifferentsystem

同步熒光和圓二色譜分析結(jié)果表明,H2O2在銅納米簇形成過(guò)程中發(fā)揮了兩種作用,一方面,在堿性條件下,Cu2+催化H2O2產(chǎn)生·OH自由基。與H2O2相比,·OH自由基有更強(qiáng)的氧化性,它破壞了BSA分子的部分二硫鍵,巰基和氨基更充分暴露[20]。所產(chǎn)生的游離氨基與Cu2+充分結(jié)合成穩(wěn)定的配合物,降低Cu2+/Cu0的還原電勢(shì),加快銅納米簇形成。同時(shí),裸露出來(lái)的巰基能與Cu+形成穩(wěn)定的CuS進(jìn)一步提高了銅納米簇的穩(wěn)定性。另一方面,H2O2作為配體可與BSA-Cu結(jié)合形成飽和的BSA-Cu-H2O2配合物。由于BSA配位環(huán)境空間位阻大,Cu2+不可能同時(shí)與4個(gè)氨基形成四配體飽和配合物[21,22]。然而,H2O2分子小,配位能力強(qiáng),可深入到BSA-Cu內(nèi)部與Cu2+雜化軌道中未成鍵的軌道成鍵,形成更為穩(wěn)定的BSA-Cu2+-H2O2配合物。配合物穩(wěn)定性的提高可減少體系中游離Cu2+濃度,進(jìn)一步降低了Cu2+/Cu0的還原電勢(shì)?？傊?H2O2的加入降低了Cu2+/Cu0的還原電勢(shì),增加了銅納米簇的穩(wěn)定性,從而加快了銅納米簇形成。

3.3 L-半胱氨酸對(duì)銅納米簇?zé)晒獾拟缱饔?/p>

為了研究L-半胱氨酸與銅納米簇之間的相互作用,分別測(cè)定了加入L-半胱氨酸前后銅納米簇溶液的熒光光譜。由圖4可見(jiàn),L-半胱氨酸的加入使銅納米簇的熒光強(qiáng)度明顯下降,實(shí)現(xiàn)了對(duì)BSA-Cu體系熒光“關(guān)”響應(yīng),這表明L-半胱氨酸對(duì)體系的熒光具有顯著的猝滅效應(yīng)。

為探究導(dǎo)致熒光猝滅的原因,采用透射電鏡研究了銅納米簇在加入L-半胱氨酸前后的粒子形貌及聚集形式。由圖5可見(jiàn),以H2O2作為添加劑制備的銅納米簇的形狀為規(guī)整的球形,粒徑均勻,平均粒徑在0.5～1.5nm之間。然而,加入L-半胱氨酸后,銅納米簇發(fā)生明顯的團(tuán)聚現(xiàn)象,且形狀變得不規(guī)整,說(shuō)明L-半胱氨酸與銅納米簇相互作用導(dǎo)致了銅納米簇的聚集和破壞。L-半胱氨酸屬于生物巰基類小分子氨基酸,游離巰基中的硫能在銅表面提供電子對(duì),協(xié)調(diào)電子的不飽和狀態(tài),同時(shí)這也存在一個(gè)空置的軌道,由此更容易吸附在銅表面,對(duì)銅具有強(qiáng)的螯合能力[23,24]。盡管BSA穩(wěn)定的銅納米簇表面被一層BSA殼層包裹,但表面仍存在空隙,親水性L-半胱氨酸可穿透BSA殼而深入到銅納米簇表面,并與Cu結(jié)合。這種結(jié)合將破壞已經(jīng)形成的CuS鍵,使BSA殼層與銅納米簇表面脫離,失去對(duì)銅納米簇的保護(hù)作用,最終導(dǎo)致銅納米簇團(tuán)聚。同時(shí),銅納米簇從外殼脫離程度愈大,愈容易被溶解氧氧化腐蝕,造成熒光猝滅[25]。

圖4 加入1.0×10-2mol/L L-半胱氨酸前（a）后（b）銅納米簇的熒光光譜。激發(fā)波長(zhǎng)、反應(yīng)溫度和時(shí)間分別為320 nm、25℃和30minFig.4 Fluorescence spectra of copper nanoclustars （CuNCs）before（a）and after（b）the addition of1.0× 10-2mol/L of L-cysteine with an excitation wavelength of 320 nm.The reaction temperature and time are 25℃ and 30min,respectivelty

圖5 加入L-半胱氨酸前（A）后（B）銅納米簇的TEM圖Fig.5 TEM images of copper nanoclusters before（A）and after（B）the addition of L-cysteine

3.4 H2O2對(duì)BSA-Cu熒光“開(kāi)”響應(yīng)動(dòng)力學(xué)特征

為進(jìn)一步研究H2O2對(duì)BSA-Cu體系熒光“開(kāi)”響應(yīng)的動(dòng)力學(xué)特征,考察了H2O2加入量對(duì)熒光強(qiáng)度的影響。由圖6可見(jiàn),H2O2濃度不影響熒光發(fā)射峰形狀,它們的最大發(fā)射波長(zhǎng)均在420 nm。然而,體系熒光強(qiáng)度隨 H2O2加入量的增加而迅速增大。當(dāng)H2O2濃度在1.0×10-6～1.5×10-3mol/L之間,熒光強(qiáng)度（F）與H2O2濃度（C,mmol/L）呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,線性方程為F=471.65C+22.087,相關(guān)系數(shù)R2為0.9983,方法檢出限達(dá)到 3.1×10-7mol/L （S/N=3）?；贐SA-Cu體系對(duì)H2O2熒光“開(kāi)”響應(yīng),建立了測(cè)定H2O2含量的熒光分析方法。采用此方法測(cè)定20份H2O2溶液（0.5mmol/L）,檢測(cè)結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.2％,表明方法具有良好的重現(xiàn)性。將BSA溶液和Cu2+儲(chǔ)備液在4℃儲(chǔ)藏一定時(shí)間,然后用于檢測(cè)0.5×10-3mol/L H2O2。結(jié)果表明,儲(chǔ)備液儲(chǔ)藏3個(gè)月后測(cè)定結(jié)果相對(duì)偏差小于1.8％,表明儲(chǔ)備液有較好的穩(wěn)定性。

圖6 A：不同H2O2濃度下BSA-Cu體系的熒光光譜；B：熒光峰強(qiáng)度與H2O2濃度關(guān)系曲線。Fig.6 A：Fluorescence spectra of BSA-Cu system in the presence of 0.001,0.005,0.01,0.05,0.1,0.25, 0.35,0.50,0.60,0.75,0.85,1.00,1.20,1.30,1.40 and 1.50mmol/L H2O2respectively（from a to p）.B：Relationship curve of fluorescence peak intensity with H2O2concentration

不同外來(lái)成分被分別加入到BSA-Cu溶液,然后在熒光光度計(jì)上測(cè)定體系熒光強(qiáng)度變化（ΔF）,結(jié)果見(jiàn)圖7。在所有測(cè)試對(duì)象中,僅有H2O2能顯著提高體系的熒光強(qiáng)度,再次證明H2O2的存在對(duì)銅納米簇的形成具有較大的催化作用；CI-,F-,K+,Ca2+,Al3+,Na+,Mg2+和Zn2+本身還原能力差,它們對(duì)Cu2+轉(zhuǎn)化為Cu0的反應(yīng)沒(méi)有促進(jìn)作用,因此相當(dāng)于5倍于H2O2濃度（1.0mmol/L）的上述離子僅產(chǎn)生一個(gè)極小的熒光增加；Hg2+和Pb2+的存在將導(dǎo)致體系熒光強(qiáng)度下降。一方面,Hg2+和Pb2+能與BSA中的游離巰基結(jié)合形成穩(wěn)定的硫化物,使BSA喪失還原Cu2+的能力,從而抑制了銅納米簇的形成；另一方面,Hg2+和Pb2+可能對(duì)已形成的銅納米簇表面CuS鍵作用,造成BSA殼層的脫落,使銅納米簇氧化而分解,從而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度下降。研究表明,預(yù)先在樣品中加入少量EDTA螯合劑可以消除 Hg2+和 Pb2+對(duì)測(cè)定的干擾；CH3COOH和CH3CONH2的引入BSA-Cu體系對(duì)熒光強(qiáng)度略有增加。這是因?yàn)樗鼈兌加泻码娮訉?duì)的原子,通過(guò)供電子效應(yīng)使銅納米簇量子效率提高,從而導(dǎo)致熒光強(qiáng)度略有增加。然而,它們對(duì)H2O2測(cè)定的影響是容易消除的。研究表明,CH3COOH和CH3CONH2對(duì)體系的作用是一個(gè)相對(duì)慢的動(dòng)力學(xué)過(guò)程。CH3COOH 或CH3CONH2加入使體系熒光強(qiáng)度緩慢增長(zhǎng),這一速率明顯低于H2O2對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響。因此,實(shí)際樣品測(cè)定時(shí)可以利用樣品加入后一個(gè)迅速的熒光增加過(guò)程對(duì)H2O2進(jìn)行定量分析,從而有效避免了因CH3COOH或CH3CONH2存在對(duì)測(cè)定結(jié)果的干擾。

圖7 不同干擾物（5mmol/L）對(duì)BSA-Cu體系檢測(cè)H2O2的影響。ΔF=F-F0,為BSA-Cu體系加入不同成分前（F0）后（F）測(cè)得的熒光強(qiáng)度變化值。Fig.7 Fluorescence intensity of different substances （5mmol/L）in the presence of BSA-Cu.ΔF=F-F0, were the fluorescence intensity of BSA-Cu in the absence （F0）and presence（F）of various substances

3.5 L-半胱氨酸對(duì)銅納米簇?zé)晒狻瓣P(guān)”響應(yīng)的分析性能

在銅納米簇的溶液中分別加入不同濃度的L-半胱氨酸,然后在熒光光度計(jì)測(cè)定體系的熒光光譜。由圖8A可見(jiàn),在0.2～10mmol/L之間,銅納米簇?zé)晒鈴?qiáng)度與L-半胱氨酸濃度線性相關(guān),回歸方程為F=-6946.4C（mmol/L）+768.33,相關(guān)系數(shù)為R2=0.9997,檢出限為5.7×10-5mol/L（S/N=3）。基于BSA-Cu體系對(duì)L-半胱氨酸熒光“關(guān)”響應(yīng),建立測(cè)定L-半胱氨酸含量的熒光分析方法。采用此方法測(cè)定20份1.0mmol/L L-半胱氨酸,檢測(cè)結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.8％,表明本方法具有良好的重現(xiàn)性。將銅納米簇溶液在4℃條件下儲(chǔ)藏一定時(shí)間,然后用于檢測(cè)1.0mmol/L L-半胱氨酸。結(jié)果表明,銅納米簇儲(chǔ)藏3個(gè)月后測(cè)定結(jié)果相對(duì)偏差小于2.4％,表明以BSA為保護(hù)劑的銅納米簇具有良好的穩(wěn)定性。

圖8 A：不同濃度的L-半胱氨酸存在下銅納米簇的熒光光譜；B：熒光強(qiáng)度與L-半胱氨酸濃度關(guān)系曲線。Fig.8 A：Fluorescence spectra of copper nanoclusters in the presence of 0.2,0.5,0.8,1.0,2.0,3.0, 4.0,5.0,6.0,7.0,8.0,9.0 and 10.0mmol/L of L-cysteine,respectivelty（from a tom）.B：Relationship curves of fluorescence intensity with L-cysteine concentration

氨基酸的檢測(cè)常受到其它氨基酸干擾,本研究考察了12種氨基酸與銅納米簇的作用。由圖9可見(jiàn),12種氨基酸中,只有L-半胱氨酸（Cys）能顯著猝滅熒光,加入其它氨基酸基本不影響銅納米簇的熒光強(qiáng)度。這應(yīng)歸因于它們分子結(jié)構(gòu)上的不同。只有L-半胱氨酸中含有游離巰基,它可與銅納米簇表面的銅原子強(qiáng)烈作用,造成銅納米簇的聚集和破壞,導(dǎo)致熒光強(qiáng)度的顯著降低。其它氨基酸中沒(méi)有游離巰基,只有少量游離氨基和羧基。由于氨基和羧基與銅的結(jié)合力較弱,不能破壞BSA穩(wěn)定的銅納米簇。銅納米簇對(duì)L-半胱氨酸特異性地產(chǎn)生熒光“關(guān)”響應(yīng),表明本分析方法具有較高的選擇性。

圖9 不同氨基酸（0.01 mol/L）對(duì)銅納米簇?zé)晒鈴?qiáng)度的影響。ΔF=F0-F,為銅納米簇溶液加入不同氨基酸前（F0）后（F）測(cè)得的熒光強(qiáng)度變化值Fig.9 Effect of different amino acid（0.01 mol/L）on fluorescence intensity of copper nanoclusters.ΔF=F0-F, were the fluorescence intensity of the copper nanoclusters in the absence（F0）and presence（F）of the various amino acids

圖10 銅的重復(fù)利用和檢測(cè)的循環(huán)方案Fig.10 Schematic of circle detection

3.6 銅的重復(fù)利用和分析檢測(cè)的循環(huán)

銅是保貴資源又是環(huán)境污染物,它的重復(fù)利用具有經(jīng)濟(jì)和環(huán)保價(jià)值。基于BSA-Cu體系對(duì)H2O2和L-半胱氨酸熒光“開(kāi)-關(guān)”響應(yīng)的特點(diǎn),設(shè)計(jì)了銅的重復(fù)利用和分析檢測(cè)的循環(huán)方案（圖10）。首先,利用H2O2對(duì)銅納米簇形成的催化作用實(shí)現(xiàn)對(duì)微量H2O2的熒光檢測(cè)。收集檢測(cè)完H2O2后的銅溶液,放置一段時(shí)間,其熒光增至最大,完成了Cu2+→Cu0的轉(zhuǎn)化和銅納米簇的合成；利用L-半胱氨酸對(duì)銅納米簇?zé)晒忖缧?yīng)實(shí)現(xiàn)對(duì)微量L-半胱氨酸的熒光檢測(cè)。收集檢測(cè)完 L-半胱氨酸后的銅溶液,采用灰化和稀H2SO4溶解相結(jié)合的方法將所有Cu0轉(zhuǎn)化為Cu2+。所得到的CuSO4溶液應(yīng)用于下一個(gè)循環(huán),如此操作可實(shí)現(xiàn)銅的重復(fù)利用和分析檢測(cè)的循環(huán)。

為了檢驗(yàn)此循環(huán)方法的可行性,分別考察了不同循環(huán)次數(shù)中檢測(cè)H2O2和L-半胱氨酸分析方法的線性范圍和檢出限。從表2可知,每次循環(huán)相關(guān)的分析參數(shù)基本相近,這說(shuō)明循環(huán)不影響檢測(cè)方法的主要性能指標(biāo)。另外,每次循環(huán)銅的重復(fù)利用率也被測(cè)定和計(jì)算。結(jié)果表明,每次循環(huán)過(guò)程中銅的重復(fù)利用率在95％以上,表明方案可實(shí)現(xiàn)較好的銅重復(fù)利用。

3.7 樣品分析

所建立的熒光分析方法應(yīng)用于藥物中H2O2和L-半胱氨酸的連續(xù)測(cè)定。從表3可知,本方法測(cè)定結(jié)果與相應(yīng)的參考方法結(jié)果一致,其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）都在0～4％之間,表明本方法具有較好的精密度和準(zhǔn)確性。

表2 不同循環(huán)次數(shù)下分析方法的主要技術(shù)參數(shù)Table 2 Results of circle detection by proposed method

表3 藥物中H2O2溶液和L-半胱氨酸測(cè)定結(jié)果Table 3 Detection results of H2O2and L-cysteine in drug formulations

4 結(jié)論

在堿性介質(zhì)和Cu2+存在下,H2O2具有強(qiáng)的氧化和螯合能力,促進(jìn)了Cu2+→Cu0轉(zhuǎn)化,導(dǎo)致銅納米簇的快速形成和熒光強(qiáng)度的顯著增加?；贐SA-Cu體系對(duì)H2O2熒光“開(kāi)”響應(yīng),成功建立了微量H2O2的熒光測(cè)定方法。由于L-半胱氨酸中游離巰基可破壞銅納米簇表面的CuS鍵,導(dǎo)致銅納米簇的分解和熒光強(qiáng)度的下降?；贐SA-Cu體系對(duì)L-半胱氨酸熒光“關(guān)”響應(yīng),建立了微量L-半胱氨酸的熒光測(cè)定方法。此外,通過(guò)Cu2+與Cu0之間相互轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)銅的重復(fù)利用和分析檢測(cè)的循環(huán),方法具有靈敏,低成本和環(huán)保的顯著優(yōu)勢(shì),可廣泛應(yīng)用于H2O2和L-半胱氨酸的日常分析。此外,研究還可應(yīng)用于銅納米簇的快速制備。

1 Lin Y H,Ren JS,Qu X G.Acc.Chem.Res.,2014,47（4）：1097-1105

2 Díez I,Ras R H A.Springer Ser.Fluoresc.,2010,9：307-332

3 Li SY,Wei S,Gao ZQ.Chem.Soc.Rev.,2015,44（1）：362-381

4 Yu J,Zhang X J,Hao X J,Zhang X H,Zhou M J,Lee C S,Chen X F.Biomaterials,2014,35（10）：3356-3364

5 Shang L,Dong S J,Nienhaus G U.Nano Today,2011,6（4）：401-418

6 Wu X F,Li R Y,Li Z J,Liu JK,Wang G L,Gu Z G.RSC Adv.,2014,4（48）：24978-24985

7 Li JJ,Wang W J,Sun D F,Chen J N,Zhang P H,Zhang J R,Min Q H,Zhu J J.Chem.Sci.,2013,4（9）：3514-3521

8 Ling Y,Zhang N,Qu F.Spectrochim.Acta,Part A,2014,118：315-320

9 Zhao X J,Huang C Z.New J.Chem.,2014,38（8）：3673-3677

10 Yang X M,Feng Y J,Zhu SS,Luo YW,Zhuo Y,Dou Y.Anal.Chim.Acta,2014,847：49-54

11 Jia X F,Yang X,Li J,Li D Y,Wang E K.Chem.Commun.,2014,50（2）：237-239

12 Jia X F,Li J,Wang E K.Small,2013,9（22）：3873-3879

13 LiW H,LiW,Hu Y F,Xia Y L,Shen Q P,Nie Z,Huang Y,Yao SZ.Biosens.Bioelectron.,2013,47：345-349

14 Jia X F,Li J,Han L,Ren JT,Yang X,Wang E K.ACSNano,2012,6（4）：3311-3317

15 Hu L Z,Yuan Y L,Zhang L,Zhao JM,SaadatM,Xu G B.Anal.Chim.Acta,2013,762：83-86

16 Wu X F,Li R Y,Li Z J.RSC Adv.,2014,4（20）：9935-9941

17 Rama G,Amaresh K S,Siddhartha S G,Anumita P,Arun C.ACS Applied Materials＆Interfaces,2014,6（6）：3822-3828

18 WangW,Leng F,Zhan L,Chang Y,Yang X X,Lan J,Huang C Z.Analyst,2014,139（12）：2990-2993

19 Zhao T,He XW,LiW Y,Zhang Y K.J.Mater.Chem.B,2015,3（11）：2388-2394

20 Xu S J,Chen F N,Deng M,Sui Y Y.RSC Adv.,2014,4（30）：15664-15670

21 Wang C,Wang C X,Xu L,Cheng H,Lin Q,Zhang C.Nanoscale,2014,6（3）：1775-1781

22 Drochioiu G,Damocb N E,PrzybylskiM.Talanta,2006,69（3）：556-564

23 Zhang H,Liu R T,Chi Z X,Gao C Z.Spectrochim.Acta,Part A,2011,78：523-527

24 Zou M M,Li Y,Wang J,Gao JQ,Wang Q,Wang B X,Fan P.Spectrochim.Acta,Part A,2013,112：206-213

25 SUN Tao,GUO Hong-Rui,XU Huan-Lin,ZHOU Bao-Kuan.Chem.J.Chinese Universities,2007,28（5）：856-858

孫濤,郭洪瑞,許環(huán)麟,周寶寬.高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報(bào),2007,28（5）：856-858

26 Li Z P,Li K A,Tong SY.Anal.Lett.,1999,32（5）：901-913

27 Wu Z Z,LiW Y,Chen J,Yu C.Talanta,2014,119：538-543

28 Chen Z,Lu D T,Cai ZW,Dong C,Shuang SM.Luminescence,2014,29（7）：722-727

29 Hu Y H,Wu Y M,Chen T T,Chu X,Yu R Q.Anal.Methods,2013,5（14）：3577-3581

（Received 20 May 2015；accepted 3 July 2015）

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China（No.21176101）

Fluorescence"on-off"Response of Bovine Serum Album in-Cu System Towards Hydrogen Peroxide and L-Cysteine and Their Analysis Applications

LIAO Xiao-Qing1,WANG Hui-Ying1,LIZai-Jun*1,21（School ofChemical and Materials Engineering,Jiangnan University,Wuxi214122,China）
2（The Key Laboratory of Food Colloids and Biotechnology,Ministry ofEducation,Jiangnan University,Wuxi214122,China）

The synthesis and application of copper nanoclusters（CuNCs）as optical probe have attracted a great attention.The study shows that bovine serum albumin（BSA）CAN reactwith copper ions（Cu2+）in a basemedium to form stable BSA-Cu complex.In the solution,the introduction of hydrogen peroxide can remarkably accelerate the formation of CuNCs.At the same time,the fluorescence intensity rapidly increases.Based on the fluorescence"light-on"response of BSA-Cu system,a kineticsmethod was developed for the fluorescent detection of hydrogen peroxide.The fluorescence intensity of BSA-Cu linearly increased with the increase of hydrogen peroxide in the range from 1.0×10-6mol/L to 1.5×10-3mol/L with the detection limit of 3.1×10-7mol/L（S/N=3）.After that,the collected BSA-Cu solution was placed until its fluorescence intensity increases to the maximum value,in which the Cu2+ions were fully changed into CuNCs.The experiment demonstrated that the addition of L-cysteine into the solution led to an obvious fluorescence quenching.Based on the fluorescence"light-off"response of BSA-Cu system towards L-cysteine,an analytical method was established for the fluorescent determination of L-cysteine.The fluorescence intensity linearly reduced with the increase of L-cysteine concentration in the range of 2.0×10-4-1.0×10-2mol/L with the detection limit of 5.7×10-5mol/L（S/N=3）.Finally,the resulted BSA-Cu waste was treated by high temperature ashing and then dissolvingwith sulfuric acid,in which the CuNCswere turned into Cu2+ions.The resulting Cu2+solution continued to be used for the detection of H2O2and L-cysteine in the next cycle.In the work,the cycle detection of hydrogen peroxide and L-cysteine and reuse of copper could be achieved using the conversion between Cu2+and copper nanoclusters.Themethod provides the characteristics of high sensitivity, low cost and environment-friendly,and can be widely used for routine analysis of hydrogen peroxide and L-cysteine.

Copper ions；Copper nanoclusters；Fluorescence probe；Hydrogen peroxide；L-Cysteine

10.11895/j.issn.0253-3820.150413

2015-05-20收稿；2015-07-03接受

本文系國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No.21176101）

E-mail：zaijunli@jiangnan.edu.cn