劉松南, 趙新穎, 董曉倩, 許雯雯, 趙 榕

(1. 北京市茶葉質(zhì)量監(jiān)督檢驗站, 北京 100162; 2. 北京市理化分析測試中心, 有機材料檢測技術與質(zhì)量評價北京市重點實驗室, 北京 100089)

技術與應用

QuEChERS凈化-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定茶葉中氯噻啉

劉松南1*, 趙新穎2, 董曉倩1, 許雯雯1, 趙 榕1

(1. 北京市茶葉質(zhì)量監(jiān)督檢驗站, 北京 100162; 2. 北京市理化分析測試中心, 有機材料檢測技術與質(zhì)量評價北京市重點實驗室, 北京 100089)

建立了茶葉中農(nóng)藥氯噻啉殘留的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法。茶葉樣品用乙腈提取,提取液經(jīng)QuEChERS法凈化,利用PSA(N-丙基乙二胺)、C18、GCB(石墨化炭黑)等吸附劑材料進一步去除雜質(zhì),凈化液經(jīng)過離心后取上清液以水等體積稀釋。以乙腈-0.1%(v/v)甲酸水溶液為流動相,在0.30 mL/min流速下梯度洗脫,用C18色譜柱進行液相色譜分離,電噴霧正離子模式電離(ESI+),選擇反應監(jiān)測(SRM)模式檢測,外標法定量。結果表明:氯噻啉在1～500 μg/L范圍內(nèi)線性關系良好(相關系數(shù)r為0.999 9),定量限為0.01 mg/kg(S/N≥10),在烏龍茶和綠茶中3個添加水平(0.01、0.3和3 mg/kg)的平均回收率為87.0%～101.0%,相對標準偏差(RSD,n=7)在2.1%～13.1%之間。對多種茶葉的測定結果表明,該方法操作簡便、成本低、準確性高、特異性好、分析速度快,可以對茶葉中氯噻啉殘留進行定性和定量檢測。

QuEChERS;液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;氯噻啉;茶葉

氯噻啉(imidaclothiz, C7H8ClN5O2S)是我國在2002年研發(fā)的一種新型煙堿類殺蟲劑[1]。它通過作用于煙酸乙酰膽堿酯酶受體阻滯害蟲的中樞神經(jīng)正常傳導,可防治十字花科蔬菜蚜蟲、柑橘蚜蟲、溫室白粉虱、水稻飛虱、茶樹葉蟬等[2]。氯噻啉基本取代了甲胺磷等5種禁止生產(chǎn)、銷售和使用的高毒農(nóng)藥,得到廣泛應用[3]。2014年,我國最新修訂的《食品安全國家標準 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中規(guī)定了茶葉中氯噻啉的殘留限量為3.0 mg/kg[4],但沒有規(guī)定其檢測方法。目前,國內(nèi)也沒有關于茶葉中氯噻啉農(nóng)藥殘留檢測的標準方法。國內(nèi)外有關氯噻啉的檢測方法主要有液相色譜法[5]、酶聯(lián)免疫法[6]、毛細管電泳法[7]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8,9]和氣相色譜-質(zhì)譜法[10]。以上報道主要涉及水稻、蔬菜和水果等檢測對象,僅有陸小磊等[9]報道了茶葉中氯噻啉的檢測方法。該方法利用乙腈勻質(zhì)提取、GC-e/NH2固相萃取柱凈化、高效液相色譜-電噴霧離子化質(zhì)譜測定,可以實現(xiàn)茶葉中氯噻啉殘留的檢測。但這種方法的前處理過程較為繁瑣,需要進行固相萃取和多次旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)及氮吹等操作,梯度洗脫程序時間為50 min,不利于大量樣品的快速檢測。

QuEChERS前處理方法是由Anastassiades等[11]于2003年首次提出的。與固相萃取柱凈化法相比,該方法具有速度快、回收率高、穩(wěn)定性好、溶劑使用量少、樣品制備簡便等優(yōu)點,在茶葉及其他食品的農(nóng)殘分析中得到廣泛應用。本文利用乙腈提取、QuEChERS法凈化,液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定茶葉中氯噻啉殘留。方法簡單、快速,可以為茶葉中氯噻啉農(nóng)藥殘留的檢測提供技術保障。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

TSQ Quantum Ultra EMR液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀,配有電噴霧離子源(美國Thermo Fisher公司); AEL200分析天平,感量0.1 mg(日本島津公司); KDC-140HR離心機,配有2 mL、8 mL轉(zhuǎn)頭(安徽中科中佳科學儀器有限公司); Milli-Q高純水發(fā)生器(美國Millipore公司); FW135粉碎機(天津泰斯特儀器有限公司)。

氯噻啉標準樣品購自上海安譜實驗科技股份有限公司(CAS 105843-36-5,純度≥96%);乙腈(色譜純)和甲酸(質(zhì)譜級)購自美國Thermo Fisher公司;氯化鈉和無水硫酸鎂(分析純)購自天津大茂化學試劑廠;PSA(N-丙基乙二胺,primary secondary amine)吸附劑(40～60 μm)、ODS C18吸附劑(50 μm, 6 nm)和GCB吸附劑(石墨化炭黑,graphitized carbon black, 120～400目)購自天津博納艾杰爾科技有限公司。茶葉樣品均購于北京市內(nèi)的超市、茶葉店和茶葉生產(chǎn)廠,產(chǎn)地涵蓋福建、浙江、四川、云南和安徽,其中綠茶17個、烏龍茶14個、茉莉花茶12個、紅茶11個、黑茶9個、白茶3個、黃茶1個。實驗用水均為超純水(經(jīng)Milli-Q高純水發(fā)生器純化)。

1.2 溶液的配制

標準儲備液:準確稱取10 mg(準確到0.1 mg)氯噻啉標準樣品于100 mL容量瓶中,乙腈定容至刻度,配制成100 mg/L的標準溶液,4 ℃冷藏保存,有效期6個月。標準工作液:量取標準儲備液,用乙腈-水(1∶1, v/v)分別稀釋成1.0、50、100、200、500 μg/L的系列標準工作溶液,使用之前現(xiàn)配。

1.3 色譜和質(zhì)譜條件

色譜柱:Hypersil GOLD C18(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm);柱溫:40 ℃;進樣量:10 μL;流速:0.30 mL/min;流動相:A為含0.1%(v/v)甲酸的水溶液,B為乙腈。梯度洗脫程序:0～1.0 min, 99%A; 1.0～5.0 min, 99%A～5%A; 5.0～8.5 min, 5%A; 8.5～9.0 min, 5%A～99%A; 9.0～10.0 min, 99%A。

電噴霧離子化正離子(ESI+)模式;掃描模式:選擇反應監(jiān)測(SRM);噴霧電壓:4 000 V;氣化溫度:300 ℃;鞘氣流速:15 mL/min;輔助氣流速:15 mL/min;離子傳輸管溫度:320 ℃;碰撞氣體(氬氣)壓力: 0.2 Pa; SRM監(jiān)測離子對:m/z262.0/181.1(定量)和262.0/122.2;管透鏡補償電壓(tube lens offset voltage): 100 V;碰撞電壓:14 V和26 V;保留時間:4.7 min。

1.4 樣品前處理

茶葉樣品用粉碎機粉碎,過600～1 000 μm孔徑篩。準確稱取1.000 0 g樣品粉末置于8 mL離心管中,加入0.50 g氯化鈉、0.20 g無水硫酸鎂、5.00 mL乙腈,渦旋振蕩1 min,靜置浸泡10 min,再次渦旋振蕩1 min,于5 000 r/min離心3 min,取上清液1.00 mL,待凈化。將1.00 mL提取液置于2 mL離心管中,依次加入GCB、PSA和C18吸附劑各0.050 g及無水硫酸鎂0.15 g,渦旋振蕩1 min,于5 000 r/min離心3 min。取上清液0.50 mL于2 mL離心管中,加入0.50 mL水,搖勻,經(jīng)0.22 μm有機微孔濾膜過濾,待分析測試。

2 結果討論

2.1 質(zhì)譜參數(shù)的選擇

采用ESI+模式,以1 mg/L氯噻啉標準樣品溶液進行質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化,確定特征母離子和子離子。氯噻啉農(nóng)藥標準品的二級碎片離子主要有m/z181.1、122.2、123.2、132.1、95.2等。進一步優(yōu)化二級碎片離子的管透鏡補償電壓、碰撞電壓等參數(shù)。根據(jù)二級離子的響應強度和特異性,選取m/z262.0/181.1為定量離子,m/z262.0/122.2為定性離子,碰撞電壓分別為14 V和26 V,管透鏡補償電壓為100 V。

2.2 流動相的選擇

比較了甲醇-水和乙腈-水兩個流動相體系對分離的影響。實驗結果表明,氯噻啉在上述兩種體系中的峰形接近,但在乙腈-水體系下保留時間更短。這是由于乙腈的極性弱于甲醇,在反相液相色譜中對氯噻啉的洗脫能力強于甲醇,所以出峰更早。因此選擇乙腈-水體系作為流動相。同時,在乙腈-水流動相中添加了0.1%(v/v)的甲酸以增加氯噻啉在正離子模式下的離子化效率[12],改變洗脫程序以縮短氯噻啉的保留時間。在優(yōu)化條件下,氯噻啉的保留時間為4.7 min,全部梯度程序時間為10 min,可以實現(xiàn)氯噻啉的較快速檢測。

2.3 提取條件的選擇

2.3.1提取溶劑

考察了乙腈、乙酸乙酯、丙酮和甲醇4種常見的提取溶劑對氯噻啉提取效率的影響。結果表明,氯噻啉的峰面積按照乙腈≈甲醇>丙酮>乙酸乙酯的順序排列。但是以甲醇作為提取溶劑時同時提取出的干擾物質(zhì)也較多,定量離子通道有干擾峰存在,基線噪聲也較高,因此實驗選用乙腈為提取溶劑。

2.3.2干擾組分

圖1 4種溶劑對茶葉樣品中干擾組分的提取情況Fig.1 Extraction of interference components in tea samples with four solvents

咖啡因是茶葉等少數(shù)植物的特有成分,茶多酚是茶葉中含量最多的成分,葉綠素是茶葉色素的主要成分之一[13]。分別以乙腈、乙酸乙酯、丙酮和甲醇4種溶劑進行提取,對提取液和凈化液中咖啡因、茶多酚和葉綠素3種茶葉中主要干擾成分進行測定?？Х纫騾⒄誈B/T 8312-2013以液相色譜法進行檢測,茶多酚參照GB/T 8313-2008方法二紫外-可見分光光度計法進行檢測,葉綠素參照GB/T 22182-2008紫外-可見分光光度計法進行檢測。實驗結果表明,相較于其他3種溶劑,乙腈作為提取溶劑時提取出的咖啡因和葉綠素最少,提取出的茶多酚僅多于乙酸乙酯(見圖1)。因此,選擇乙腈為提取溶劑可以最少地提取茶葉中的干擾組分,且乙腈與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜流動相基本一致,減少溶劑置換操作。此外,參考AOAC 2007.01方法,在樣品中加入無水硫酸鎂脫除水分,加入氯化鈉，通過鹽析作用提高提取效率,從而增加提取方法的穩(wěn)定性和提取效率。

2.4 凈化方式

茶葉中含有大量的色素、生物堿、多酚和有機酸等物質(zhì),提取液需要進一步凈化處理,以減少色譜柱和質(zhì)譜系統(tǒng)的污染,確保檢測結果的準確性。PSA能有效去除脂肪酸、碳水化合物、酚類和少量色素;GCB能去除色素、類胡蘿卜素、固醇和平面結構的干擾雜質(zhì)[14]; C18對非極性物質(zhì)有較高的容量,對色素、甾醇和維生素的去除能力較強[15]。本文參照AOAC 2007.01的凈化方法,在凈化過程中依次加入GCB、PSA和C18等吸附劑各0.050 g、無水硫酸鎂0.15 g。實驗結果表明,經(jīng)過本方法凈化過的樣品溶液中咖啡因、茶多酚和葉綠素的含量分別為94、19.4和0.005 2 mg/L。計算得到本方法對咖啡因和茶多酚的去除率分別為99.95%和98.66%,提取液中的色素肉眼不可見。以上結果說明本方法可有效去除茶葉中的主要干擾組分。

2.5 樣品溶劑的選擇

考察了不同體積比的乙腈-水溶液作為溶劑溶解樣品時對色譜峰形的影響。結果表明,純乙腈作為樣品溶劑時氯噻啉的色譜峰展寬最嚴重;隨著乙腈含量的下降峰形變窄、柱效增加,當乙腈含量低于50%(v/v)后,峰形不再有顯著變化。以純乙腈為溶劑進樣時,因樣品溶劑和流動相不匹配而產(chǎn)生溶劑效應,導致色譜峰展寬,對乙腈溶劑進行稀釋后可以有效緩解這種效應的影響。因此,選擇乙腈-水(1∶1, v/v)作為氯噻啉的樣品溶解溶劑可以確保最佳的色譜峰形和檢出限。

2.6 線性關系、檢出限和定量限

分別配制1.0、50、100、200和500 μg/L氯噻啉標準溶液并進行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析。結果表明,在1.0～500 μg/L范圍內(nèi)線性關系良好,回歸方程為y=299.9+6 874.21x(r=0.999 9)。當茶葉中氯噻啉的含量為GB 2763-2014中規(guī)定的茶葉類食品限量值3.0 mg/kg時,參照1.4節(jié)方法處理后對應最終測試液中氯噻啉的質(zhì)量濃度為300 μg/L,處于校正曲線的中段,有利于對氯噻啉含量處于上述限量值附近樣品進行準確定量。以不含氯噻啉的茶葉樣品提取液稀釋氯噻啉標準溶液,當定量離子和定性離子色譜峰的S/N≥3時,樣品中對應的氯噻啉含量為0.005 mg/kg,即本方法的檢出限。當定量離子色譜峰的S/N≥10且定性離子色譜峰的S/N≥3時,樣品中氯噻啉對應的含量為0.01 mg/kg,即本方法的定量限。以上結果符合氯噻啉殘留的判定要求[4]。

2.7 回收率和精密度

選取色素及浸出物最多的茶葉品種烏龍茶和綠茶為樣品,分別添加0.010 mg/kg(方法定量限)、0.30 mg/kg、3.0 mg/kg(GB 2763-2014中的限量值)的氯噻啉,考察方法的回收率和精密度。實驗結果表明,烏龍茶的加標平均回收率為88.5%～101.0%,相對標準偏差為2.7%～13.1%;綠茶的加標平均回收率為87.0%～101.0%,相對標準偏差為2.1%～11.7%(見表1)。加標回收率和精密度均符合檢測方法的相關要求[16]。

表1 茶葉樣品中氯噻啉的平均加標回收率和精密度(n=7)

2.8 空白樣品和基質(zhì)效應

以不含氯噻啉的黑茶、烏龍茶、綠茶、紅茶、白茶、黃茶和茉莉花茶7種茶葉為樣品,用本方法進行分析。實驗結果表明,空白樣品均不含氯噻啉,定量離子通道離子強度(NL)均小于5×102,譜圖不存在干擾情況。分別以上述7種空白提取液作為標準溶液的稀釋液,以各組分的峰面積(Y)對質(zhì)量濃度(X, μg/mL)繪制基質(zhì)加標標準曲線,將其斜率與標準品的標準曲線的斜率相比,斜率比為97.1%～102.2%。結果表明以本方法測定上述7種茶葉中氯噻啉殘留量時的基質(zhì)效應不明顯。

2.9 特異性

在茶葉樣品中添加氯噻啉和10種常見農(nóng)藥(殺螟丹、多菌靈、滅多威、噻蟲嗪、吡蟲啉、氯噻啉、啶蟲脒、除蟲脲、腐霉利、喹螨醚、丁醚脲),按本方法進行測定,考察方法的特異性。實驗結果表明,其余10種常見農(nóng)藥成分沒有對氯噻啉的檢測造成干擾。

2.10 樣品檢測

采用本方法對67個茶葉樣品進行檢測,只有1個樣品檢出氯噻啉,含量為0.055 mg/kg。檢出氯噻啉的茶葉樣品的色譜圖見圖2。

圖2 含有氯噻啉農(nóng)藥殘留的茶葉色譜圖Fig.2 Chromatograms of imidaclothiz residue in tea sample a. total ion chromatogram (TIC); b. selective reaction monitoring (SRM) transitions for quantification; c. SRM transitions for confirmation.

3 結論

本方法將QuEChERS法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜結合,兼具有QuEChERS的便捷、快速、低成本、環(huán)保和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的高選擇性、高靈敏度等優(yōu)點。方法學結果均符合《實驗室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(GB/T 27404-2008)》的相關規(guī)定,能滿足茶葉中氯噻啉農(nóng)藥殘留的檢測要求,是對《食品安全國家標準 食品中農(nóng)藥最大殘留限量(GB 2763-2014)》的有效補充。

[1] Dai B J. World Pesticides (戴寶江. 世界農(nóng)藥), 2005, 27(6): 46

[2] He M, Jia C H, Zhu X D, et al. Agrochemicals (賀敏, 賈春虹, 朱曉丹, 等. 農(nóng)藥), 2010, 49(1): 50

[3] Zhang M H, Zhao P, Yan Q X, et al. Agrochemicals (張敏恒, 趙平, 嚴秋旭, 等. 農(nóng)藥), 2012, 51(12): 859

[4] GB 2763-2014

[5] Wu M, Cai J G, Yao J Y, et al. Bull Environ Contam Toxicol, 2010, 84: 289

[6] Li H X, Yan X, Shi H Y, et al. Food Chem, 2014, 164(1): 166

[7] Zhang S H, Yang X M, Yin X F, et al. Food Chem, 2012, 133(2): 544

[8] Qin L, Liu F G, Wu H M, et al. Adv Mater Res, 2012, 343/344: 855

[9] Lu X L, Ye M J, Zhou W L. Agrochemicals (陸小磊, 葉美君, 周衛(wèi)龍. 農(nóng)藥), 2014, 53(11): 825

[10] Xu X Y, Shi H Y, Wang M H. Journal of Chinese Mass Spectrometry Society (許秀瑩, 施海燕, 王鳴華. 質(zhì)譜學報), 2012, 33(2): 99

[11] Anastassiades M, Lehotay S J, Stajnbaher D. et al. J AOAC Int, 2003, 86(2): 412

[12] Lei M K, Peng F, Ding T, et al. Chinese Journal of Chromatography (雷美康, 彭芳, 丁濤, 等. 色譜), 2015, 33(1): 65

[13] Chen J, Wang L L, Song Z S. Tea Science and Technology (陳鍵, 王麗麗, 宋振碩. 茶葉科學技術), 2013(4): 13

[14] Zhang F, Zhang X Z, Luo F J, et al. Journal of Instrumental Analysis (張芬, 張新忠, 羅逢健, 等. 分析測試學報), 2013, 32(4): 393

[15] Wilkowska A, Biziuk M. Food Chem, 2011, 125(3): 803

[16] GB/T 27404-2008

Determination of imidaclothiz in tea by QuEChERS cleanup and liquid chromatography-tandem mass spectrometry

LIU Songnan1*, ZHAO Xinying2, DONG Xiaoqian1, XU Wenwen1, ZHAO Rong1

(1.BeijingTeaQualifySupervisionandInspectionStation,Beijing100162,China, 2.BeijingCentreforPhysicalandChemicalAnalysis,BeijingKeyLaboratoryofOrganicMaterialsTestingTechnology&QualityEvaluation,Beijing100089,China)

The method for the determination of imidaclothiz residue in tea by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) has been developed. The imidaclothiz in tea was extracted by acetonitrile and purified by QuEChERS with PSA (primary secondary amine), C18, GCB (graphitized carbon black) as the adsorbents. The purified solution was centrifuged and the supernatant was diluted with water of equal volume. The separation was performed on a C18column with a gradient elution program of acetonitrile (containing 0.1% (v/v) formic acid) and water at a flow rate of 0.30 mL/min. The mass spectrometer was carried out with electrospray ion source in the positive mode (ESI+) and selective reaction monitoring (SRM), quantified by external standard solution. The results showed that the mass concentration of imidaclothiz in the range of 1 to 500 μg/L was linearly correlated with the peak area, and the correlation coefficient (r) was 0.999 9. The limit of quantification (LOQ,S/N≥10) was 0.01 mg/kg. The recoveries in oolong tea and green tea at three spiked levels (0.01, 0.3 and 3 mg/kg) varied from 87.0%-101.0% and the relative standard deviations (RSDs,n=7) were between 2.1% and 13.1%. The real sample tests showed that the method is simple, cheap, accurate, specific, rapid, and suitable for the qualitative and quantitative confirmation of imidaclothiz residue in tea.

QuEChERS; liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS); imidaclothiz; tea

10.3724/SP.J.1123.2015.07006

2015-07-06

O658

:A

:1000-8713(2015)11-1205-05

*通訊聯(lián)系人.Tel:(010)60221648;E-mail:lsnmail@qq.com.