陸想想，錢志余，李韙韜，湯飛飛

（南京航空航天大學 生物醫(yī)學工程系，江蘇 南京 210016）

越來越多的研究領(lǐng)域需要檢測生物組織的熒光強度變化[1]。用于熒光檢測的儀器有熒光分光光度計、CCD相機、光纖光譜儀等。熒光分光光度計具有非常高的精密度，對微弱信號有著較好的適應性，但只能應用于離體檢測[2]。CCD相機能夠觀測到生物體整體的熒光強度分布情況，且有比較高的分辨率，但是不便于進行連續(xù)長時間的在體熒光檢測[3]。光纖光譜儀雖然可以通過光纖，實現(xiàn)在體檢測，但是檢測靈敏度有限[4－5]。

本文提出采用高靈敏度的光電倍增管（Photomultiplier Tube，PMT）作為核心探測器[6]，使用高速數(shù)據(jù)采集卡進行數(shù)據(jù)采集，采用虛擬儀器技術(shù)，以Labview為信息處理平臺，設計采集系統(tǒng)軟件。同時設計了適用于在體檢測的微創(chuàng)光纖探頭，探頭可直接深入生物組織。光纖探頭的頂端安裝有聚焦透鏡，將光聚焦到光纖中可以提高微弱信號的檢測效率。光纖探頭獲得的光信號通過光電檢測系統(tǒng)處理，轉(zhuǎn)換為電信號，進過數(shù)據(jù)采集卡進入上位機后可實時顯示熒光強度的變化。

1 光電檢測系統(tǒng)設計

1.1 系統(tǒng)總體結(jié)構(gòu)

系統(tǒng)由光電探測模塊、PMT分壓與外部供電模塊、信號預處理模塊和上位機信號實時動態(tài)顯示等部分組成。

圖1 熒光檢測系統(tǒng)結(jié)構(gòu)框圖Fig.1 Structure diagram of the fluorescence detection system

為了滿足生物組織內(nèi)部熒光信號的探測，采用微創(chuàng)光纖探頭深入組織發(fā)光部位，采集微弱熒光信號。所用的光纖為春暉科技公司生產(chǎn)的石英光纖，有效工作波長200～1200 nm，根據(jù)實際探測需要，可給探頭裝配聚焦透鏡，達到匯聚微弱熒光的作用，提高信號的檢測效率。

生物組織的熒光信號比較微弱，在檢測過程中容易受到背景噪聲的干擾，將待檢測的有用信號完全淹沒在噪聲中。為光電倍增管設計了金屬屏蔽罩。金屬屏蔽罩有兩點重要的作用，一是可以屏蔽背景雜光，二是電磁屏蔽，防止信號處理電路產(chǎn)生的電磁波對光電倍增管的影響。屏蔽罩需要接地。在光電倍增管與光纖的入射窗之間加入適當?shù)臑V光片，保證只有特定波段的光通過。

1.2 PMT分壓與供電電路設計

由一系列電阻構(gòu)成分壓器提供PMT各倍增極之間的電壓，如圖2所示。

在理想情況下，分壓器回路各個倍增級之間的電壓是均等的，流過各級分壓電阻的電流IR為：

式中UH是負高壓，Ri是分壓電阻，流過各個倍增極分壓電阻上的電流并不是相等的，陽極電流Ia最大，該電阻上的壓降也最大，產(chǎn)生電壓重分配效應，導致各個倍增極的分壓隨陽極電流的變化而變化，從而使PMT的增益發(fā)生改變。但是，當流過分壓電阻的電流IR遠大于Ia時，流過各個分壓電阻IR的電流可以認為近似相等。因此，分壓電阻阻值的選取應盡量小。

另一方面，分壓電阻阻值越小，電阻功率損耗越大，越容易產(chǎn)生熱效應，導致PMT溫度升高、性能降低。綜上，需要折衷考慮電阻的取值，本系統(tǒng)設計選用390 kΩ的電阻。當入射信號為快速變化的信號或脈沖信號時，會引起最后三級倍增極電流的劇烈變化，破壞PMT增益的穩(wěn)定性。末三極分別并聯(lián)一個電容，通過電容的充放電，使末三級電壓保持相對穩(wěn)定。

系統(tǒng)使用的高壓供電模塊是北京濱松光子公司的產(chǎn)品，型號為 CC228－01Y，輸入電壓 12 V，輸出電壓 0～－1250 V。通過控制電阻的調(diào)節(jié)，可以給PMT提供千伏以上的負高壓。

1.3 轉(zhuǎn)換電路設計

PMT的輸出信號是電流信號，但是后續(xù)電路是基于電壓信號而設計的，因此，首先需把電流信號轉(zhuǎn)換為電壓信號。通過串聯(lián)一個負載電阻，實現(xiàn)信號的轉(zhuǎn)換。如圖3所示。

PMT 輸出電流范圍為 10－10～10－3A，近似當作恒流源。 如果負載電阻過大，將導致輸出線性和頻率響應的惡化。信號輸出的截止頻率fC為：

圖3 電流－電壓轉(zhuǎn)換電路Fig.3 Current-voltage conversion circuit

式中RL是負載電阻，CS是負載電阻PMT陽極和其他電極之間的靜電電容量，以及由于布線等引起的雜散電容量的總和。由上式可以看出，雖然PMT和放大器響應時間極快，輸出響應也會受到截止頻率的限制。如果負載電阻RL過大，在高輸出電流的情況下，負載電阻RL將導致陽極電壓降增大，導致陽極與末級倍增極電壓降低，破壞輸出線性性。負載電阻應采用溫度系數(shù)較小的金屬膜電阻，以減小溫度漂移對測量結(jié)果的影響。PMT的信號輸出部分選用低噪聲同軸電纜線，降低噪聲對關(guān)鍵信號的影響。

1.4 信號濾波與放大電路設計

經(jīng)負載電阻RL后輸出的電壓信號為毫伏級別甚至更低，同時混有各種干擾信號，需要濾波處理并進一步放大，以滿足后續(xù)數(shù)據(jù)采集的要求。運算放大器選擇零點偏移小，無外部調(diào)零的器件。同時輸入阻抗和開環(huán)放大倍數(shù)無窮大，保證輸入端工作電流為0；輸出阻抗無窮小，保證輸出電壓不隨下級負載而變。系統(tǒng)選用TI公司的TLC272放大器芯片，該芯片的特點是低噪聲、低失調(diào)電壓、高輸入阻抗，高響應速度，適用于微弱信號放大的場合。

圖4 信號放大及倍率選擇電路Fig.4 Amplifying and ratio selection circuit

系統(tǒng)設計了一個換擋開關(guān)，分4個倍率檔位，以適應不同強度的熒光信號。每個檔位分別由一個電阻和一個電容構(gòu)成，放大倍數(shù)由電阻值決定。電容起積分作用，抑制或平滑高頻噪聲。電容值越大，抗干擾能力越強，但是會犧牲系統(tǒng)的響應速度，因此需要根據(jù)系統(tǒng)的需求，合理地選取C1～C4的值。

2 數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)設計

本文采用美國國家儀器公司，型號為PCI－6251的數(shù)據(jù)采集卡進行數(shù)據(jù)采集。以Labview為平臺構(gòu)建虛擬儀器。實時監(jiān)測信號特征。系統(tǒng)的信號變化范圍為0～10 V。本文用于數(shù)據(jù)采集的子VI主要有：

DAQmx Create Channel.VI，創(chuàng)建虛擬通道，配置接線端的接線模式，設定輸入的范圍等。本文接線端采用差分輸入模式，設定的輸入范圍為－0.1～10 V。差分輸入模式有利于消除信號在傳輸過程中受到的大部分環(huán)境干擾。

DAQmx Timing.VI，設置采樣時鐘源以及時鐘頻率等信息。本文設定的采樣模式是連續(xù)采樣模式，每通道采樣數(shù)參與定義循環(huán)緩沖的大小。數(shù)據(jù)的讀取速度有限，可以適當增加每通道采樣數(shù)以增大緩存，防止數(shù)據(jù)溢出。

DAQmx Read.VI，從指定的虛擬通道讀取數(shù)據(jù)，讀入的數(shù)據(jù)為熒光光強轉(zhuǎn)換得到的電壓值，模擬信號以波形的方式直觀地顯示。信號不可避免地會受到50 Hz工頻干擾，以及其他系統(tǒng)高頻干擾，因此有必要設置低通濾波器，截止頻率為5 Hz。

設計的數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)儀器面板如圖5所示。儀器面板的左下部分為系統(tǒng)配置窗口，在開始采集之前首先進行通道設置，選擇數(shù)據(jù)采集卡任一可用的模擬輸入通道，然后設置采樣率，每通道采樣數(shù)以及采樣模式等。啟動程序，通過右側(cè)部分的窗口對數(shù)據(jù)進行實時觀測，上半部分是原始采樣得到的數(shù)據(jù)，下半部分是濾除高頻噪聲后得到的比較穩(wěn)定的數(shù)據(jù)，同時也可以在左下部分的窗口讀取實時的電壓值?；蛘邔⒉蓸拥玫降臄?shù)據(jù)寫入測量文件，進行進一步的處理和分析。

圖5 熒光強度檢測系統(tǒng)儀器面板Fig.5 Instrument panel of the fluorescence intensity detection system

3 熒光檢測實驗結(jié)果與討論

3.1 實驗方法

選用已消毒的大白鼠，實驗前禁食過夜但可自由飲水。實驗前腹腔注射20%的烏來糖1 mL麻醉，剪去大鼠右側(cè)腿部白毛，酒精消毒，找到股動脈分叉處，切開1 cm左右的小口露出股動脈。在自制支架上用繩索固定大鼠4只腿，調(diào)節(jié)光纖端口位置使與股動脈垂直并緊貼股動脈分叉處，然后固定。光源光纖端口平行對準大鼠腿部的另一側(cè)，固定后打開激光光源。用5 mL注射器抽取2 mL 20%DMSO生理鹽水配置的濃度為250μg/mL的CYPATE，通過大鼠尾靜脈注射給藥。給藥后立即開始記錄數(shù)據(jù)，每1 min記錄一次熒光強度數(shù)據(jù)，記錄到30 min時開始每5 min記錄保存一次數(shù)據(jù)。整個操作過程除進行靜脈注射其余全部在暗室中進行。

同樣選用已消毒的大白鼠進行系統(tǒng)的評估實驗。尾靜脈注射2 mL濃度為 250μg/mL的 CYPATE，給藥后分別于1，5，10，15，20，30，60，90 min 從眼眶取血 0.6 mL，4 000 rpm離心10 min后取血漿，置于2 mL EP管中于冰箱中保存。取完所有時間點后將每組裝有血漿的EP管并排放置在CCD照相機下進行成像。熒光成像圖如圖6，1～8分別表示給藥后1，5，10，15，20，30，60，90 min 得到的血漿熒光成像。

圖6 不同時間點的血漿在近紅外成像系統(tǒng)中的熒光成像圖Fig.6 Plasma at different time points ofthe near-infrared imaging fluorescence imaging system

3.2 實驗結(jié)果與討論

與將設計的熒光檢測系統(tǒng)在體監(jiān)測的結(jié)果，經(jīng)歸一化后，與經(jīng)過同樣方式數(shù)據(jù)處理的體外監(jiān)測結(jié)果進行比較，結(jié)果如圖7所示。

圖7 熒光檢測系統(tǒng)和近紅外成像系統(tǒng)檢測結(jié)果比較Fig.7 Comparison of the detection results of fluorescence detection system and near-infrared imaging system

對比結(jié)果可以看出，這兩種方法測得的時量曲線的下降幅度稍有不同，體外熒光檢測顯示靜脈注射CYPATE 5 min后曲線下降幅度要略微大于在體監(jiān)測得到的結(jié)果，這可能是由于血管中的CYPATE在5 min后向周圍組織擴散，而股動脈相對較細，在體監(jiān)測的接收光纖口不但接收了血管中的熒光強度，同時也接收了周邊組織中散射過來的熒光，結(jié)果導致在體監(jiān)測血管中的熒光強度要大于實際血流中的熒光強度，但是通過時量曲線的比較也可以看出這種影響的程度不大。

在持續(xù)工作的90 min內(nèi)，熒光檢測系統(tǒng)的檢測結(jié)果，與現(xiàn)有成像系統(tǒng)的結(jié)果的變化趨勢保持一致，證明本文設計的系統(tǒng)是有效的。60 min以后的曲線依然非常穩(wěn)定，表明系統(tǒng)能夠在較長時間內(nèi)保持穩(wěn)定的工作狀態(tài)，滿足在體熒光檢測的要求。

為了將本設計運用于更微弱的熒光檢測場合，還需要進一步改進檢測電路，改進光纖探頭的設計，提高檢測靈敏度。本系統(tǒng)為后續(xù)的研究提供了有利條件。本文研究的微創(chuàng)光纖探頭不僅可以作為熒光探測器，也可以作為激發(fā)信號的導入載體。因此，基于微創(chuàng)光纖探頭的內(nèi)窺式熒光檢測系統(tǒng)設計，對于在體醫(yī)療器械的研究和開發(fā)，具有重要的價值。

4 結(jié) 論

本文以光電倍增管為核心探測器，使用高速數(shù)據(jù)采集卡進行數(shù)據(jù)采集，采用虛擬儀器技術(shù)，以Labview為信息處理平臺，設計了基于微創(chuàng)光纖探頭的內(nèi)窺式熒光檢測系統(tǒng)。該系統(tǒng)可實時反映生物組織或離體組織的熒光強度變化。通過在體實驗驗證，以及現(xiàn)有的熒光成像系統(tǒng)體外實驗評估，可以初步認定，本文設計的熒光檢測系統(tǒng)對于生物組織的熒光檢測有著較高的靈敏度和精確度，并且能夠完成在體的連續(xù)測量。

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