史芳芳

(新疆兵團(tuán)第十二師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，新疆烏魯木齊 830088)

利用內(nèi)標(biāo)為基礎(chǔ)的RT-PCR技術(shù)檢測(cè)草莓皺縮病毒(SCV)和草莓鑲脈病毒(SVBV)

史芳芳

(新疆兵團(tuán)第十二師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，新疆烏魯木齊 830088)

[目的]通過(guò)對(duì)反應(yīng)條件和參數(shù)的摸索與優(yōu)化，建立多重RT-PCR檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)2種病毒的同時(shí)高效快速檢測(cè)。[方法] 通過(guò)CTAB法與試劑盒提取RNA，以?xún)?yōu)質(zhì)的總RNA為模板，進(jìn)行梯度PCR，結(jié)合擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的檢測(cè)體系，建立多重RT-PCR檢測(cè)方法。[結(jié)果] 建立了優(yōu)化的SCV和SVBV的多重RT-PCR檢測(cè)體系，可以對(duì)草莓田間植株進(jìn)行快速穩(wěn)定的病毒檢測(cè)。[結(jié)論]該研究為草莓病毒檢測(cè)提供一種方便、高效的分子生物學(xué)方法，為草莓無(wú)病毒苗的實(shí)際生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。

草莓病毒; 內(nèi)標(biāo); 多重RT-PCR; 病毒檢測(cè)

草莓種苗普遍感染病毒是草莓生產(chǎn)中的瓶頸問(wèn)題，由于可侵染草莓的病毒經(jīng)常復(fù)合侵染，因此草莓病毒病的田間癥狀表現(xiàn)極其復(fù)雜[1]。不同病毒病在草莓上可表現(xiàn)出相似的癥狀，而同種病毒病在不同條件下的癥狀也會(huì)出現(xiàn)很大差異，這給病害的田間診斷帶來(lái)了極大的困難[2]。因此，建立快速、準(zhǔn)確的草莓病毒檢測(cè)技術(shù)具有重要的實(shí)際意義。目前新疆關(guān)于草莓病毒病的研究極少，對(duì)病毒種類(lèi)、分布、發(fā)生程度及生物學(xué)特性等基礎(chǔ)研究極為薄弱，病毒檢測(cè)體系不健全，缺乏先進(jìn)的種苗及種苗生產(chǎn)環(huán)節(jié)有效的病毒檢測(cè)技術(shù)手段，脫毒種苗質(zhì)量難以保證，退化嚴(yán)重，使用時(shí)間短，效益不高。有的生產(chǎn)單位未經(jīng)檢測(cè)就盲目從內(nèi)地調(diào)種，劣質(zhì)種苗不僅破壞了脫毒種苗的聲譽(yù)，損害了農(nóng)民的利益，還造成了一些病原菌的廣泛傳播和地區(qū)性的檢疫病害傳入[3]。因此，在已有試驗(yàn)技術(shù)的基礎(chǔ)上，通過(guò)進(jìn)一步改進(jìn)試驗(yàn)方法，優(yōu)化體系，建立起一套靈敏度高、準(zhǔn)確性好、操作簡(jiǎn)便的病毒檢測(cè)技術(shù)[4]。筆者針對(duì)草莓皺縮病毒(SCV)和草莓鑲脈病毒(SVBV)2種病毒，以單一RT-PCR為基礎(chǔ)，通過(guò)對(duì)反應(yīng)條件和參數(shù)的摸索與優(yōu)化，建立多重RT-PCR檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)2種病毒的同時(shí)高效快速檢測(cè)，為草莓病毒檢測(cè)提供一種方便、高效的分子生物學(xué)方法，為草莓無(wú)病毒苗的實(shí)際生產(chǎn)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料草莓試材為新疆兵團(tuán)十二師三坪農(nóng)場(chǎng)種植的露地草莓品種達(dá)賽萊克特，此品種為該單位從外地引進(jìn)，種苗未經(jīng)檢測(cè)種植于大田，采集疑似感染皺縮病毒的6株草莓植株葉片，進(jìn)行病毒檢測(cè)。取約50 mg幼葉為試驗(yàn)材料。

1.2 試驗(yàn)試劑RNA試劑提取盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaqDNA聚合酶、dNTPs、DNA分子量MarkerD2000均購(gòu)于上海生物工程有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1特異性擴(kuò)增與參照引物設(shè)計(jì)。根據(jù)GenBank中SMoV( Genbank Accession No.AJ311875，AJ311876)、SMYEV( Genbank Accession No.D12517)、SCV( Genbank Accession No.AY005146.1)、SVBV( Genbank Accession No.NC001725)的基因組序列和文獻(xiàn)分別設(shè)計(jì)和合成針對(duì)SMoV、SMYEV、SCV和SVBV 的引物( 表1)[5]。

為了驗(yàn)證擴(kuò)增的陰性條帶的真?zhèn)涡裕貌葺?dòng)蛋白基因Actin( GenBank Accession No.AB116565)作為內(nèi)部體系參照[6]。所用引物均由上海生物工程公司合成。引物序列見(jiàn)表1。

表1 SMoV、SMYEV、SVBV、SCV和Actin檢測(cè)所用引物

1.3.2核酸提取。

1.3.2.1利用改進(jìn)的CTAB法提取草莓葉片總核酸[7]。取少許幼嫩葉片，放入1.5 ml離心管中，加入石英砂用研磨杵研磨均勻，直至全部研磨至粉末，加入500 μl 65 ℃預(yù)熱的CTAB溶液(用前加入2%的巰基乙醇)，將裝有CTAB和樣品的EP管放入65 ℃水浴，約20 min。冷卻后，加入500 μl酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，混勻，12 000 r/min，離心15 min，吸上清，裝入一新的EP管。加入500 ul氯仿∶異戊醇(24∶1)，12 000 r/min，離心15 min，吸上清，轉(zhuǎn)入一新的離心管中。加入1/10體積的NaAc(3 mol/L)，1 ml -20 ℃預(yù)冷的無(wú)水乙醇，反復(fù)顛倒數(shù)次，混勻后置于-20 ℃(-80 ℃，30 min)3～4 h，12 000 r/min，10 min，棄上清。向離心管中加入75%的乙醇洗滌2～3次，置于吸水紙上倒置晾干。加入DEPC H2O(30 μl)溶解。

1.3.2.2試劑盒提取總RNA?？俁NA的提取參見(jiàn)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.3反轉(zhuǎn)錄。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

1.3.4梯度PCR擴(kuò)增內(nèi)參。以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，進(jìn)行單一PCR擴(kuò)增。PCR體系：10×PCR緩沖液4 μl，MgCl21.2 μl，dNTPs 0.4 μl，引物ActinF/ActinR 1 μl，Taq酶0.5 μl，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物0.5 μl，補(bǔ)足雙蒸水至20 μl。

反應(yīng)程序：預(yù)變性94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，50～55 ℃ 40 s，68 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

1.3.5多重RT-PCR。

1.3.5.1雙重RT-PCR擴(kuò)增SCV。擴(kuò)增體系：10×PCR緩沖液4 μl，MgCl21.2 μl，dNTPs 0.4 μl，引物ActinF/ActinR 0.5 μl，SCVF/SCVR 0.5 μl，Taq酶0.5 μl，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物0.5 μl，補(bǔ)足雙蒸水至20 μl。

反應(yīng)程序：預(yù)變性94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s,55 ℃ 40 s,68 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

1.3.5.2三重RT-PCR擴(kuò)增其他3個(gè)病毒。擴(kuò)增體系：10×PCR緩沖液4 μl，MgCl21.2 μl，dNTPs 0.4 μl，引物SMoVF/SMoVR 0.72 μl，SVBVF/SVBVR 1 μl，SMYEVF/SMYEVF 0.6 μl，Taq酶0.5 μl，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物0.5 μl，補(bǔ)足雙蒸水至20 μl。

反應(yīng)程序：預(yù)變性94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s,55 ℃ 40 s,68 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

2 結(jié)果與分析

2.1 總核酸分離和電泳檢測(cè)采用試劑盒提取總核酸，包括總DNA和總RNA。從瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果可以看出(圖1)，DNA條帶及RNA的28S、18S和5S條帶均能看到，這說(shuō)明總RNA沒(méi)有發(fā)生降解，完整性較好。

2.2 內(nèi)標(biāo)RT-PCR以ActinF/ActinR為引物，采取草莓品種反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板，梯度PCR擴(kuò)增，篩選出53°為最佳退火溫度，擴(kuò)增出預(yù)期295 bp大小的特異片段(圖2)，說(shuō)明Actin基因存在于草莓中，該基因適合作為草莓RNA病毒檢測(cè)的內(nèi)標(biāo)。以此基因?yàn)閮?nèi)標(biāo)，一方面可以排除假陰性結(jié)果的干擾，另一方面可以進(jìn)一步檢測(cè)RNA質(zhì)量，提高了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.3 多重RT-PCR以ActinF/ActinR、SCVF/SCVR兩對(duì)引物首先擴(kuò)增疑似皺縮病毒，擴(kuò)增條件同Actin基因，2個(gè)植株擴(kuò)增出大小為345 bp的特異片段(圖3)，說(shuō)明檢測(cè)出SCV病毒，此前預(yù)估帶有此病毒的推測(cè)是正確的。

同時(shí)，以另外3種病毒引物繼續(xù)擴(kuò)增cDNA，確定植株是否還有其他病毒侵染，結(jié)果檢測(cè)出片段大小278 bp的條帶，說(shuō)明存在鑲脈病毒侵染(圖4)，因此疑似植株可確定為皺縮病毒和鑲脈病毒復(fù)合侵染，與皺縮病毒通常與草莓鑲脈病毒(SVBV)復(fù)合侵染的說(shuō)法一致。

圖1 總核酸提取

圖2 6個(gè)植株內(nèi)參Actin 擴(kuò)增

注：M.marker，A1、A2.Actin擴(kuò)增條帶，S1、S2.SCV擴(kuò)增條帶。圖3 Actin/SCV引物擴(kuò)增

注：M. marker， 1、2.SVBV擴(kuò)增條帶。圖4 其他3引物擴(kuò)增

3 討論

(1)與改進(jìn)CTAB法提取RNA 相比，該研究采用試劑盒提取，方法簡(jiǎn)單，只需30 min，提取效果也比改進(jìn)的CTAB法好，而且改進(jìn)的CTAB法提取配制試劑復(fù)雜，準(zhǔn)備工作耗時(shí)長(zhǎng)，對(duì)所用耗材及試劑要求均必須去除RNA酶污染，提取時(shí)間需要12 h，提取過(guò)程也較繁瑣，一批次提取樣品，提取效果均一性不好，有些樣品提取條帶完整，有些則效果較差，這說(shuō)明提取過(guò)程稍不注意，則會(huì)有RNA酶污染，影響了提取效果[8]。

(2)植物病毒檢測(cè)體系中引入內(nèi)標(biāo)可增加試驗(yàn)的可靠性，減少假陰性的出現(xiàn)。該研究設(shè)計(jì)了NADH脫氫酶基因?yàn)閮?nèi)參，合成引物后，經(jīng)過(guò)多次條件摸索，始終擴(kuò)增不出內(nèi)參條帶，之后換成Actin內(nèi)參引物，經(jīng)過(guò)梯度PCR擴(kuò)增，一次便成功擴(kuò)增出條帶，該研究最終選擇此基因作為內(nèi)參，擴(kuò)增效果較好，健康植株與帶毒試材均可良好地?cái)U(kuò)增，說(shuō)明此內(nèi)標(biāo)相對(duì)穩(wěn)定[9]。

(3)多重PCR擴(kuò)增受諸多因素影響，該研究首先以疑似病毒引物和內(nèi)參引物作雙重PCR擴(kuò)增，確保了樣本RNA質(zhì)量的可靠性，同時(shí)驗(yàn)證了疑似病毒的檢測(cè)結(jié)果，2次試驗(yàn)再進(jìn)行三引物PCR擴(kuò)增，以排除其他病毒的侵染，2次試驗(yàn)便可確保試驗(yàn)的準(zhǔn)確無(wú)誤，避免了單一引物擴(kuò)增的繁瑣性，因此，經(jīng)過(guò)多重RT-PCR擴(kuò)增可縮短試驗(yàn)時(shí)間，減少試劑的損耗，達(dá)到了省時(shí)省力的功效。同時(shí)，該研究在試驗(yàn)過(guò)程中嘗試了采用一步法RT-PCR進(jìn)行擴(kuò)增，此方法可節(jié)省更多的時(shí)間和試驗(yàn)步驟，但此方法中間過(guò)程不易控制，且重復(fù)性不好，因此沒(méi)有得到較好的試驗(yàn)結(jié)果，最終還是選擇兩步法PCR更能保證試驗(yàn)的準(zhǔn)確性[10]。

[1] 王國(guó)平.我國(guó)草莓病毒種類(lèi)鑒定研究初報(bào)[J].中國(guó)果樹(shù)，1988(2)：32-34.

[2] 肖君澤，黃益鴻，姜放軍，等.草莓病毒病及其脫毒與檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2010，22(8)：88-90.

[3] 常琳琳，張志宏.草莓病毒的簡(jiǎn)單、快速PCR檢測(cè)[M]//中國(guó)園藝學(xué)會(huì)草莓分會(huì)，北京市農(nóng)林科學(xué)院.草莓研究進(jìn)展(三).北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2009：83-88.

[4] 楊洪一，張志宏，李麗麗，等.利用多重RT-PCR技術(shù)檢測(cè)草莓病毒的研究[J].植物病理學(xué)報(bào)，2007，37(5)：549-552.

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[10] 陳曉軍，王敬東，馬洪愛(ài)，等.利用RT- PCR 對(duì)脫毒草莓苗病毒檢測(cè)研究[J].北方園藝，2010(23)：146-148.

Detection of SCV and SVBV with Multiplex RT-PCR Based on Internal Control

SHI Fang-fang

(The Center of Popularization of Agricultural Technology of the 12th Division of Xinjiang Production and Construction Corps, Urumchi,Xinjiang 830088)

[Objective] Through optimization of reaction conditions and parameters, multiple RT-PCR detection method was established in order to realize efficient and rapid detection of two kinds of virus. [Method] By CTAB method and the kit, RNA was extracted. Using high-quality total RNA as a template, gradient PCR was done, Combining with internal amplification target detection system, a multiplex RT-PCR detection system of SCV and SVBV was established. [Result] A multiplex RT-PCR detection system of SCV and SVBV was established, and could make fast and stable virus detection in field grown strawberries. [Couclusion] The study provided a convenient and efficient molecular biology method for strawberry virus detection, and provided technical support for actual production of strawberry virus-free seedling.

Strawberry virus; Internal control; Multiplex RT-PCR; Virus detection

新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)科技支疆計(jì)劃項(xiàng)目(2013AB006)。

史芳芳(1977-)，女，新疆烏魯木齊人，助理研究員，碩士，從事植物組織培養(yǎng)及農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣工作。

2015-08-07

S 41-33

A

0517-6611(2015)28-020-02