劉娜娜(

三門(mén)峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院,河南省三門(mén)峽市，472000)

固定化漆酶在SBR處理造紙廢水中的應(yīng)用

劉娜娜(

三門(mén)峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院,河南省三門(mén)峽市，472000)

固定化漆酶投入反應(yīng)器處理造紙廢水，當(dāng)進(jìn)水COD為1265.87 mg/L，固定化酶組COD去除率為65.64%，對(duì)照組COD去除率為61.42%，COD去除率提高了6.87%。提高進(jìn)水負(fù)荷至1641.31 mg/L，固定化酶組COD去除率為58.76%，對(duì)照組COD去除率為47.94%，COD去除率提高了22.57%，說(shuō)明反應(yīng)器接入固定化漆酶后抗進(jìn)水負(fù)荷沖擊能力提高。當(dāng)進(jìn)水pH改變時(shí)，固定化酶組反應(yīng)器具有較高的COD去除率。說(shuō)明反應(yīng)器接入固定化漆酶后抗進(jìn)水pH沖擊能力提高。

固定化漆酶造紙廢水

近年來(lái)，漆酶在諸多領(lǐng)域的潛在應(yīng)用價(jià)值已引起了研究者的興趣，如環(huán)境污染物的脫毒、食品性質(zhì)的改良、造紙工業(yè)、環(huán)保工業(yè)等方面廣泛應(yīng)用。尤其重要的是漆酶具有降解木質(zhì)素的能力[1,2]，可用于紙漿中殘余木質(zhì)素的去除和造紙廢水的生物降解，對(duì)降低生產(chǎn)成本和減少環(huán)境污染有著重要意義[3]。

固定化漆酶是指將水溶性漆酶以物理或化學(xué)的方法固定在有機(jī)或無(wú)機(jī)的載體上，形成不溶于水的具有酶活性的酶衍生物。本文利用包埋法對(duì)漆酶進(jìn)行固定。包埋法是將漆酶物理包埋于高聚物網(wǎng)格內(nèi)或微囊內(nèi)的方法，一般反應(yīng)條件溫和，對(duì)酶自身的結(jié)構(gòu)改變很少，因此酶活性損失較小，固定化效率較高。包埋漆酶常用的材料有聚丙烯酰胺、海藻酸鈣、瓊脂糖凝膠等。

固定化漆酶延長(zhǎng)了漆酶的使用壽命，降低了漆酶的使用成本，提高了漆酶的穩(wěn)定性及其對(duì)環(huán)境的耐受性，讓漆酶在工業(yè)廢水處理等方面的應(yīng)用前景更為廣闊。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

云芝為本實(shí)驗(yàn)室保藏菌株。

1.1.2 廢水及活性污泥

造紙廢水取自河南省新鄉(xiāng)市某造紙廠。廢水成分復(fù)雜，含有COD、BOD、SS、木質(zhì)素、氯化物、硫化物和揮發(fā)酚等多種成分。廢水呈棕黑色濁狀，COD高達(dá)125062.8 mg/L，pH為7.0～8.0，廢水在使用前做適當(dāng)稀釋。

活性污泥取自河南省新鄉(xiāng)市某造紙廠污水處理站沉淀池，其工藝為水解酸化－好氧生物工藝。

1.1.3 培養(yǎng)基

（1）斜面培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(Potato dextrose agar，PDA)[4]。

（2）PDA培養(yǎng)液：同PDA培養(yǎng)基，只是不加瓊脂。

（3）云芝產(chǎn)酶液[5]：麥芽糖質(zhì)量濃度為1.8 g/L，酒石酸銨質(zhì)量濃度為0.84 g/L，大量元素體積分?jǐn)?shù)為100 ml/L，微量元素體積分?jǐn)?shù)為25 ml/L，VB1質(zhì)量為100μg，吐溫80質(zhì)量濃度為0.05%，pH為3.6。其中大量元素組成為(質(zhì)量濃度)：KH2PO420 g/L，MgSO4·7H2O 5.0 g/L，CaCl20.75 g/L。微量元素的組成為[6](質(zhì)量濃度)：NaCl 1.0 g/L，MgSO4·7H2O 3.0 g/ L，F(xiàn)eSO4·7H2O 100 mg/L，CoSO4·7H2O 100 mg/L，CaCl2100 mg/L，ZnSO4·7H2O 100 mg/L，CuSO4·5H2O 10 mg/L，KAl(SO4)100 mg/L，H3BO310 mg/L，NaMoO410 mg/L，次氮基三乙酸1.5 g/L。

圖1 云芝產(chǎn)漆酶曲線

1.1.4 化學(xué)試劑

2，2＇-連氮基-雙(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸) (簡(jiǎn)稱(chēng)ABTS、Sigma公司)、海藻酸鈉、氯化鈣等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 固定化漆酶方法

取斜面保藏云芝轉(zhuǎn)接入滅菌PDA平板培養(yǎng)6 d，挑取均勻菌絲接入裝有250 mL滅菌產(chǎn)酶液的500 mL三角瓶中，于28℃，110 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)，每天測(cè)定漆酶活性，繪制產(chǎn)酶曲線。

云芝產(chǎn)漆酶曲線如圖1所示，在培養(yǎng)前期(前3 d內(nèi))菌絲體快速萌發(fā)。至第5 d，培養(yǎng)液中菌絲球數(shù)量明顯增多，體積由小變大，邊緣呈絨毛狀，菌體生長(zhǎng)達(dá)到高峰。到第9 d酶活力為706 U/L，達(dá)到高峰，菌體一直處于穩(wěn)定生長(zhǎng)階段，隨后酶活力逐漸下降，菌絲球密度最大。

將培養(yǎng)9 d的云芝產(chǎn)酶液用8層紗布過(guò)濾，濾液即為漆酶粗酶液，將粗酶液與2%的海藻酸鈉混合均勻，用注射器滴入4%的CaCl2中，立刻形成光滑微球，置于4℃冰箱過(guò)夜鈣化，用蒸餾水沖洗3次，可放冰箱保存。

1.2.2 漆酶活性測(cè)定方法[7]

漆酶(游離酶)酶活測(cè)定方法：

室溫下，0.5 mmol/L的2，2＇-連氮基-雙(3-乙基苯并噻吡咯啉-6磺酸)(簡(jiǎn)稱(chēng)ABTS)1 mL，加入1 mL稀釋酶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，測(cè)定420 nm處最初3 min內(nèi)反應(yīng)液吸光值的變化量。以酶液事先滅活后的反應(yīng)混合液為對(duì)照，酶活定義為：反應(yīng)體系中每分鐘引起0.001個(gè)吸光值增加所需的酶量為一個(gè)酶活單位。已知ABTS氧化產(chǎn)物在420 nm處的摩爾消光系數(shù)ε為3.6×104M-1·cm-1。

固定化漆酶酶活測(cè)定方法：

0.5 mmol/L的ABTS 2 mL，加入16個(gè)固定化小球(等效1mL酶液)，測(cè)定420 nm處3 min內(nèi)吸光值變化，初始吸光值設(shè)為0。

2 結(jié)果與分析

將固定化云芝漆酶200 mL投入SBR反應(yīng)器中，為實(shí)驗(yàn)組。并另設(shè)條件相同的反應(yīng)器為對(duì)照組。

反應(yīng)器在26℃恒溫下運(yùn)行，周期為8.5 h，進(jìn)水10 min，曝氣反應(yīng)7 h，沉降30 min，出水和閑置50 min。

2.1 投加固定化漆酶對(duì)反應(yīng)器處理能力及污泥性質(zhì)的影響

反應(yīng)器中投入固定化云芝漆酶，運(yùn)行10周期，測(cè)定固定化漆酶組與對(duì)照組出水COD、出水SS、MLSS、MLVSS、SV30、SVI，考察固定化云芝漆酶在反應(yīng)器處理造紙廢水中的應(yīng)用。

進(jìn)水COD為1265.87 mg/L，運(yùn)行10周期，對(duì)照組平均出水COD為488.39 mg/L，投加固定化漆酶反應(yīng)器的平均出水COD為435.27 mg/L，各周期COD去除率如圖2所示。

固定化漆酶組比對(duì)照組COD去除率高，前者均值為65.64%，后者均值為61.42%，提高了6.87%。表明固定化漆酶的加入提高了SBR的COD去除率。因?yàn)樵旒垙U水的主要污染物是木質(zhì)素，漆酶具有降解木質(zhì)素的能力，可用于木質(zhì)素的去除和造紙廢水的生物降解。固定化漆酶的加入有利于將木質(zhì)素大分子降解為易被降解的小分子物質(zhì)，這些易被降解的小分子物質(zhì)可被活性污泥降解，從而提高了反應(yīng)器對(duì)造紙廢水的降解能力。

固定化漆酶組平均出水SS為154 mg/L，對(duì)照組平均出水SS為120 mg/L，固定化漆酶組比對(duì)照組出水SS增加28.33%，說(shuō)明固定化酶顆粒不能有效地對(duì)廢水中的懸浮顆粒進(jìn)行吸附。

由表1可知：SBR系統(tǒng)中引入固定化漆酶后，固定化漆酶組比對(duì)照組MLSS、MLVSS有所增加。說(shuō)明固定化漆酶的投加不影響活性污泥的生長(zhǎng)；SV30，SVI仍然較小，說(shuō)明固定化漆酶的介入對(duì)原有活性污泥體系沒(méi)有不良影響，污泥沒(méi)有發(fā)生污泥膨脹，仍具有良好的沉降性能。但SV30，SVI均有顯著增加，可能是固定化漆酶引入反應(yīng)器運(yùn)行一段時(shí)間后，固定化材料海藻酸鈉顆粒有所破碎且海藻酸鈉顆粒比重較小，使得固定化酶反應(yīng)器SV30，SVI均有顯著增加。

2.2 投加固定化漆酶對(duì)反應(yīng)器抗進(jìn)水負(fù)荷能力的影響

進(jìn)水負(fù)荷由1265.87 mg/L提高至1641.31 mg/L，運(yùn)行7周期，測(cè)定固定化漆酶組與對(duì)照組的MLSS、MLVSS、出水SS、SV30、SVI、出水COD，計(jì)算COD去除率。考察固定化云芝漆酶在高進(jìn)水負(fù)荷條件下在SBR中的應(yīng)用。

固定化漆酶組平均出水COD為676.80 mg/L，平均COD去除率為58.76%，對(duì)照組平均出水COD為854.49 mg/L，平均COD去除率為47.94%。固定化漆酶組比對(duì)照組COD去除率提高22.57%。如圖3所示。說(shuō)明反應(yīng)器接入固定化漆酶后抵抗進(jìn)水負(fù)荷的沖擊能力提高。這主要是因?yàn)楣潭ɑ崦冈谳^高木質(zhì)素濃度下，也能有效地降解木質(zhì)素，將木質(zhì)素大分子降解為小分子物質(zhì)，提高活性污泥在高進(jìn)水負(fù)荷條件下的廢水處理能力。

固定化漆酶組平均出水SS為234 mg/L，對(duì)照組平均出水SS為243 mg/L，出水SS較大，說(shuō)明高進(jìn)水負(fù)荷不利于固定化漆酶組和對(duì)照組出水水質(zhì)的提高，固定化漆酶反應(yīng)器中固定化酶顆粒不能有效地對(duì)廢水中的懸浮顆粒進(jìn)行吸附，而對(duì)照組在高進(jìn)水負(fù)荷下廢水中懸浮顆粒增多，不利于出水SS的去除。

運(yùn)行7個(gè)周期，測(cè)定每個(gè)周期活性污泥的各項(xiàng)指標(biāo)，結(jié)果如表2。SBR系統(tǒng)中引入固定化漆酶后，固定化漆酶組比對(duì)照組MLSS、MLVSS有所增加。說(shuō)明在較高進(jìn)水負(fù)荷條件下，固定化酶的介入對(duì)活性污泥生長(zhǎng)影響不大，污泥仍然正常生長(zhǎng)；SV30，SVI仍然較小，說(shuō)明污泥沒(méi)有發(fā)生污泥膨脹，仍具有良好的沉降性能。但SV30，SVI均有顯著增加，可能是固定化漆酶引入反應(yīng)器運(yùn)行一段時(shí)間后，固定化材料海藻酸鈉顆粒有所破碎且海藻酸鈉顆粒比重較小，使得固定化酶反應(yīng)器SV30，SVI均有顯著增加。

2.3 投加固定化漆酶對(duì)反應(yīng)器進(jìn)水pH緩沖能力的影響

通過(guò)加酸、加堿來(lái)調(diào)節(jié)進(jìn)水pH，測(cè)定在不同進(jìn)水pH條件下，固定化云芝漆酶在反應(yīng)器中的應(yīng)用。在不同進(jìn)水pH條件下COD去除率如表3所示。結(jié)果表明：無(wú)論是固定化漆酶反應(yīng)器還是對(duì)照反應(yīng)器，進(jìn)水pH的變化都會(huì)影響廢水的COD去除率。但這種影響對(duì)固定化漆酶反應(yīng)器和對(duì)照反應(yīng)器的影響存在差異。對(duì)于固定化漆酶反應(yīng)器，進(jìn)水pH向酸性變化，COD去除率有一定增加，進(jìn)水pH向堿性變化，COD去除率有一定下降。當(dāng)pH降低至6.0時(shí)，COD去除率增加了2.50%，當(dāng)pH增加至8.0時(shí)，COD去除率下降了2.87%。對(duì)于對(duì)照組，進(jìn)水pH為中性時(shí)COD去除率最高，進(jìn)水pH向酸性或堿性變化，COD去除率都有一定下降，向酸性變化時(shí)的影響更大。當(dāng)pH降低至6.0時(shí)，對(duì)照組的COD去除率下降了6.56%，當(dāng)pH增加至8.0時(shí)，對(duì)照組的COD去除率降低了2.43%。數(shù)據(jù)表明固定化漆酶組比對(duì)照組抗酸堿變化的緩沖能力強(qiáng)，對(duì)酸性方向變化的緩沖能力更強(qiáng)，COD去除率提高。這可能是因?yàn)楣潭ɑ浦テ崦傅淖罴裵H范圍偏酸性，在進(jìn)水pH偏酸的條件下，固定化云芝漆酶對(duì)木質(zhì)素的降解能力更強(qiáng)。

2.4 反應(yīng)器運(yùn)行對(duì)固定化漆酶的影響

固定化漆酶投入反應(yīng)器，運(yùn)行5周期，測(cè)定固定化漆酶的酶活及顆粒性能。考察固定化漆酶的使用穩(wěn)定性。結(jié)果如表4所示。

固定化漆酶在反應(yīng)器中的酶活損失率較小，但由于反應(yīng)器的攪拌作用，固定化顆粒性能會(huì)受到影響，固定化漆酶顆粒彈性差且易碎，在下階段實(shí)驗(yàn)中應(yīng)進(jìn)一步提高固定化顆粒的機(jī)械性能。由于酶易受各種因素(如機(jī)械外力、鹽濃度、pH及有機(jī)溶劑等)的干擾而變性失活，且酶的價(jià)格高，使得固定化漆酶在廢水處理中的應(yīng)用還存在一定的局限性。利用現(xiàn)代生物技術(shù)，通過(guò)有效地分離、純化、基因表達(dá)與重組技術(shù)，大量生產(chǎn)便宜的酶，通過(guò)使用新型的酶固定化技術(shù)，提高酶的使用穩(wěn)定性和重復(fù)利用率，從而進(jìn)一步降低固定化漆酶的使用成本，延長(zhǎng)其使用壽命，提高漆酶的穩(wěn)定性及其對(duì)環(huán)境的耐受性，使漆酶在工業(yè)廢水處理方面的應(yīng)用前景更為廣闊。

表1 活性污泥參數(shù)（進(jìn)水COD為1265.87mg/L）

圖2 COD去除率（進(jìn)水COD為1265.87mg/L）

圖3 提高負(fù)荷后COD去除率（進(jìn)水COD為1641.31mg/L）

表2 提高負(fù)荷后活性污泥參數(shù)（進(jìn)水COD為1641.31mg/L）

表3 不同進(jìn)水pH條件下COD去除率（進(jìn)水COD為1265.87mg/L）

表4 反應(yīng)器運(yùn)行中固定化漆酶的酶活損失率及顆粒性能

3 結(jié)論

在SBR反應(yīng)器中投加200 mL的以海藻酸鈉固定的云芝漆酶，提高了對(duì)造紙廢水的處理能力。進(jìn)水COD為1265.87 mg/L時(shí)，固定化云芝漆酶組COD去除率比對(duì)照組提高了6.87%。提高進(jìn)水負(fù)荷至1641.31 mg/L，固定化云芝漆酶組比對(duì)照組COD去除率提高22.57%，SBR抵抗進(jìn)水負(fù)荷的沖擊能力提高。并且在不同進(jìn)水pH條件下，反應(yīng)器具有更強(qiáng)的抗pH沖擊能力。固定化漆酶在反應(yīng)器中的酶活損失率較小，但由于反應(yīng)器的攪拌，固定化顆粒性能會(huì)受到影響。

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2015－2－14