陳利，丁芳，劉勇，吳風瑞，丁彪，王榮，李文雍

1. 安徽大學生命科學學院，合肥 230039；2. 胚胎發(fā)育與生殖調(diào)節(jié)安徽省重點實驗室，阜陽 236041；3. 阜陽師范學院生物與食品工程學院，阜陽 236041

小鼠孤雌胚、體外培養(yǎng)胚與體內(nèi)胚H3K9乙酰化模式的比較

陳利1，丁芳1，劉勇2,3，吳風瑞2,3，丁彪2,3，王榮2,3，李文雍2

1. 安徽大學生命科學學院，合肥 230039；2. 胚胎發(fā)育與生殖調(diào)節(jié)安徽省重點實驗室，阜陽 236041；3. 阜陽師范學院生物與食品工程學院，阜陽 236041

孤雌胚胎的發(fā)育率比體內(nèi)體外生成胚胎的發(fā)育率要慢，為研究小鼠孤雌胚、體外培養(yǎng)胚 H3K9乙?；?H3K9ac)模式與體內(nèi)自然胚之間的差異、曲古抑菌素 A(Trichostatin，TSA)對孤雌胚 H3K9乙?；Ｊ降挠绊懠氨碛^遺傳模式對孤雌胚、體外培養(yǎng)胚發(fā)育的影響，文章采用間接免疫熒光法對小鼠植入前各時期孤雌胚、體外培養(yǎng)胚及體內(nèi)自然胚基因組組蛋白的H3K9乙酰化水平進行檢測。結(jié)果顯示，植入前各時期孤雌胚H3K9乙?；Ｊ脚c體內(nèi)組變化趨勢基本一致，但平均熒光強度較體內(nèi)組普遍偏高；經(jīng)TSA處理后孤雌胚 H3K9乙?；接兴岣?，原核期至8-細胞期差異顯著(P<0.05)。體外培養(yǎng)胚H3K9乙?；療晒鈴姸扰c體內(nèi)組變化趨勢也基本一致，但平均熒光強度較體內(nèi)組普遍偏低。以上結(jié)果表明，小鼠孤雌胚 H3K9乙?；礁哂隗w內(nèi)胚，使植入前胚胎發(fā)育過程中本應(yīng)沉默的基因啟動子發(fā)生超乙?；?，進而抑制胚胎發(fā)育，這可能是造成孤雌胚胎發(fā)育能力較差的重要原因之一；TSA處理可以部分彌補體外培養(yǎng)環(huán)境對胚胎發(fā)育帶來的傷害，但TSA提高孤雌胚的發(fā)育能力可能并不完全是通過改變H3K9乙?；絹韺崿F(xiàn)的。

表觀遺傳修飾；孤雌胚胎；H3K9乙?；磺乓志谹；小鼠

研究表明，受精后植入前胚胎的表觀遺傳修飾在個體發(fā)育進程中扮演著重要角色[1]。表觀遺傳修飾主要包括全基因組DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重塑等，這種修飾的研究主要集中于通過改變非基因序列進而影響調(diào)控基因表達水平變化的因素，難點之一是組蛋白修飾。組蛋白乙?；腿ヒ阴；鳛榻M蛋白修飾中的重要形式，可影響和改變?nèi)旧|(zhì)的結(jié)構(gòu)，而染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)又與生命活動密切相關(guān)，其在DNA復(fù)制、基因轉(zhuǎn)錄及細胞周期調(diào)控等方面起重要作用[2]。在基因轉(zhuǎn)錄水平上，組蛋白乙?；?Acetylation, ac)可促進基因轉(zhuǎn)錄，去乙?；?Deacetylation, dac)則抑制基因轉(zhuǎn)錄[3]。組蛋白乙酰化和去乙?；謩e由組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶(Histone acetyltransferase, HAT)和組蛋白去乙酰化酶(Histone deacetylase, HDAC)催化[4]，通過HAT與HDAC調(diào)控它們的動態(tài)平衡以控制染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)，進而影響基因表達，若兩種酶的功能發(fā)生紊亂或平衡失調(diào)將會影響個體后期的正常發(fā)育[5]，甚至可引發(fā)某些疾病的發(fā)生[6]。組蛋白H3賴氨酸殘基上K4、K9、K14、K16、K23、K27和K36等位點均可表現(xiàn)出乙?；揎?，而第9位點的乙酰化(H3K9ac)在激活轉(zhuǎn)錄基因位點中起重要作用，該位點可以通過募集或者激活相關(guān)染色體修飾的復(fù)合體而達到激發(fā)另一位點乙酰化修飾的目的；其異常表達會使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變, 進一步影響基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控[7]，同時H3K9ac表達異常與疾病發(fā)生也密切相關(guān)[8]。研究表明，H3K9ac大量存在于一些大的啟動子附近[9]。

孤雌激活胚不僅可以作為核移植供體細胞的一種，也是胚胎干細胞中的一個重要來源[10]。孤雌胚胎干細胞(Pharthenotic embryonic stem cell, pESC)與正常胚胎干細胞一樣，具有自我更新和多向分化的潛能。與自然胚相比，孤雌激活胚組蛋白乙?；揎棾霈F(xiàn)異常。近年來，由于孤雌胚胎干細胞可以擺脫人胚胎干細胞面臨的各種倫理問題，正漸漸成為研究熱點[11]。而獲得高質(zhì)量的孤雌胚是成功分離、培養(yǎng)孤雌胚胎干細胞的前提。研究表明，體外培養(yǎng)小鼠原核胚會出現(xiàn)發(fā)育阻滯現(xiàn)象，以2～4細胞尤為顯著[12]。與體內(nèi)自然胚相比，體外培養(yǎng)胚的染色質(zhì)乙酰化水平表現(xiàn)異常，胚胎發(fā)育率也較低，可能是其培養(yǎng)體系不完善導致表觀遺傳修飾發(fā)生改變所致[13]。通過在培養(yǎng)體系中添加組蛋白去乙酰化酶抑制劑曲古抑菌素A(TSA)可使發(fā)育能力有所改變，本課題組在前期研究過程中也得到類似結(jié)果[14]。

鑒于此，本研究分析了孤雌胚和體外培養(yǎng)胚H3K9ac水平，比較TSA處理前后該位點乙酰化水平變化規(guī)律，探討了人為改變培養(yǎng)環(huán)境能否修正表觀遺傳修飾異常，本研究結(jié)果將為提高胚胎發(fā)育能力提供重要的實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

雌性昆明白小鼠(安徽醫(yī)科大學實驗動物中心)，4～5周齡，飼養(yǎng)溫度24±1℃，濕度50%～60%，光照14 h/d(8:00～22:00)，自由采食，飲水。小鼠適應(yīng)兩周后投入實驗。實驗分為 3組：體內(nèi)組、孤雌組和體外培養(yǎng)組。體內(nèi)組和體外培養(yǎng)組中每組共雌鼠18只，重復(fù)3次，每次6只，每只小鼠平均可以取30枚MⅡ期卵母細胞，從原核期至囊胚期，每個時期30枚左右的胚胎。孤雌組中(分3小組)共使用54只雌鼠。

1.2 方法

1.2.1 體內(nèi)組各時期胚胎的收集

6～8周齡雌鼠于當天17:00腹腔注射PMSG(孕馬血清激素，寧波第二激素廠)10 IU，48 h后注射HCG(人絨毛膜促性腺激素，寧波第二激素廠)10 IU后，與健康雄鼠 1:1合籠。次日早上檢查見栓，若見栓則假定該鼠受孕。于胚胎不同發(fā)育時期分別收集受精卵至囊胚的各期胚胎。

1.2.2 取體內(nèi)原核胚胎的體外培養(yǎng)組

從激素注射至取受精卵步驟與1.2.1相同。將受精卵置于無糖CZB微滴中于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，胚胎發(fā)育至4-細胞移入含糖CZB(即CZBG)中，繼續(xù)培養(yǎng)，于胚胎不同發(fā)育時期分別收集受精卵至囊胚的各期胚胎。

1.2. 3 孤雌激活組各時期胚胎的收集

激素注射步驟與1.2.1相同，不與雄鼠合籠。次日早上，在超凈臺中進行激活微滴(450 μL無鈣CZB+0.25 μL (Cytochalasin B, CB)(Sigma公司)，培養(yǎng)箱中平衡20～30 min；再加入50 μL的SrCl2)，培養(yǎng)箱中平衡2 h。脫頸處死雌鼠，取卵母細胞移入培養(yǎng)皿(Corning公司)中激活微滴中培養(yǎng)；6 h后觀察激活情況，記錄原核率后，移入無糖CZB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。1-細胞胚胎在激活后換液時收集，其他胚胎則繼續(xù)培養(yǎng)至各期胚胎再收集。

1.2.4 TSA處理孤雌激活胚胎和體外培養(yǎng)胚胎

TSA 溶于二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO)，加入無糖CZB，終濃度為50 nmol/L，放置4 h后使用；體內(nèi)原核胚胎和激活后的原核胚移入含有TSA的無糖CZB中培養(yǎng)20 h后，再移入正常的無糖CZB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)；DMSO組則是將體外培養(yǎng)胚和孤雌激活胚胎置于0.05% DMSO的CZB培養(yǎng)基中培養(yǎng)20 h后，再移入正常的無糖CZB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.5 間接免疫熒光檢測各期各類胚胎 H3K9乙?；Ｊ?/p>

4%多聚甲醛固定各類胚胎，4℃過夜；0.1% PVA清洗胚胎，移至0.2% 的TritonX-100中，在培養(yǎng)箱(3111,Thermo)中通透1.5 h；1%BSA清洗胚胎，移至1%BSA溶液中，培養(yǎng)箱封閉1 h；接著將胚胎直接轉(zhuǎn)移至一抗H3K9ac抗體(Epigentek Group Inc公司)中(1%BSA溶液l:100稀釋的)，培養(yǎng)箱中孵育過夜；次日早上用0.1% Tween 20和0.01% Triton X-100清洗胚胎，用FITC標記的二抗羊抗兔IgG-FITC(北京博奧森生物科技有限公司)(1:100)避光染色，培養(yǎng)箱孵育3 h；取出胚胎，0.1% PVA清洗，10 μg/mL 的 DAPI染液染色，避光室溫 10 min；最后用0.1%PVA洗滌，固定在載玻片上，激光共聚焦顯微鏡(TCS-SP5, Leica)采集照片。

1.3 統(tǒng)計分析

采用Leica LAS AF Lite軟件對所得圖片進行轉(zhuǎn)換，Image Pro-Plus 6.0軟件對轉(zhuǎn)換后的圖片不同區(qū)域的熒光強度進行分析及數(shù)值轉(zhuǎn)換，GraphPad Prism 5軟件對所得數(shù)據(jù)分別作出對比柱狀圖、折線圖及熒光圖。用SPSS Statistics軟件ANOVA進行單因素方差分析， 當P<0.05時認為具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 TSA處理前后小鼠孤雌胚胎和體外培養(yǎng)胚胎發(fā)育能力的比較

孤雌組 TSA處理前后相比，囊胚率有所提高(72.23±1.236%與57.31±0.5328%)；體外培養(yǎng)組TSA處理前后相比，囊胚率也有所提高(89.70±0.529% 與79.26±1.058%)，二者均表現(xiàn)出差異顯著(P< 0.05)。孤雌胚的激活率為：正常組為 85.02%，TSA組為83.17%，DMSO組為89.01%。研究表明，該孤雌胚激活率處于正常發(fā)育水平，因此實驗結(jié)果是可信的[15](表1)。

表1 小鼠植入前孤雌胚胎和體外培養(yǎng)胚胎經(jīng)TSA處理前后2-、4-細胞和囊胚的發(fā)育率

2.2 植入前各時期孤雌激活胚胎、體外培養(yǎng)胚胎和體內(nèi)胚胎H3K9乙?；Ｊ?/p>

孤雌組、體外培養(yǎng)組與體內(nèi)組相比，孤雌組從原核期到囊胚階段熒光強度始終高于體內(nèi)組，體外培養(yǎng)組與體內(nèi)組僅在原核期熒光強度值差異顯著(P<0.05)。在體內(nèi)組(圖 1A)中，熒光強度總體趨勢是先降低后升高，原核期熒光強度最大(0.12±0.018)；僅在原核期與其它各期胚胎均表現(xiàn)出差異顯著(P<0.05)，而2-細胞、4-細胞、8-細胞、桑椹胚及囊胚各期之間差異均不顯著。體外培養(yǎng)組(圖 1B)熒光強度總體趨勢是先降低后升高，桑椹胚時期達到最大熒光強度(0.06 ±0.004)，桑椹胚與原核期、2-細胞、4-細胞、8-細胞差異顯著(P<0.05)，囊胚期與原核期及 4-細胞差異顯著(P<0.05)。孤雌組(圖 1C)中，原核期到 8-細胞時期熒光強度逐漸降低，桑椹胚期升高，這和體內(nèi)胚總體趨勢是一致的；原核期、2-細胞、4-細胞、8-細胞及囊胚期差異顯著(P<0.05)，而4-細胞、8-細胞與桑椹胚差異顯著(P<0.05)；結(jié)果表明(圖1D)，孤雌組和體外培養(yǎng)組胚胎與體內(nèi)組總體趨勢大致相同，但是植入前孤雌激活胚胎中 H3K9乙?；Ｊ胶腕w內(nèi)正常胚在 2-細胞和桑椹胚期存在著差異(P<0.05)，體外培養(yǎng)胚胎中H3K9乙?；Ｊ胶腕w內(nèi)正常胚在原核期存在著差異(P<0.05)(圖 2，綠色為組蛋白 H3K9乙酰化特異性表達位點，藍色為DAPI復(fù)染的細胞核位置)。

圖1 小鼠植入前孤雌胚、體外培養(yǎng)胚和體內(nèi)胚組內(nèi)及組間H3K9ac水平的半定量分析

2.3 植入前各時期孤雌激活胚胎H3K9乙酰化模式

孤雌DMSO組與孤雌組相比，兩組總體趨勢一致，從原核期至囊胚期階段，兩組乙酰化水平相當，藥物DMSO對孤雌胚影響不大，因此TSA處理孤雌胚是有意義的。在孤雌組中，熒光強度大致呈先降低后升高的趨勢。結(jié)果表明，孤雌DMSO組與孤雌組總體趨勢相同，植入前各時期孤雌激活胚胎中H3K9乙?；Ｊ胶凸麓平M之間不存在著差異(P>0.05)。孤雌 TSA組與孤雌組相比，H3K9乙?；潭瓤傮w趨勢大致相同，但在原核期、4-細胞、8-細胞階段TSA組H3K9乙酰化的程度高于孤雌組，差異顯著(P>0.05)，尤其是原核期(0.19±0.025與0.10±0.013)和8-細胞(0.10±0.012與0.06±0.005)階段。在孤雌TSA組中，熒光強度總體趨勢是先降低后升高，原核期達到最大熒光強度(0.19±0.025)。孤雌TSA組與孤雌 DMSO組相比，在原核期、4-細胞、8-細胞階段TSA組H3K9乙酰化的程度高于DMSO組，差異顯著(P>0.05)，2-細胞期低于 DMSO組，到桑椹胚、囊胚階段H3K9乙?；某潭葍山M相當，差異不顯著(P<0.05)。在孤雌DMSO組中，由原核期到 8-細胞時期熒光強度呈降低趨勢，桑椹胚期升高。結(jié)果表明，雖然孤雌TSA組與孤雌DMSO組總體趨勢大致相同，但是植入前原核期、2-細胞、4-細胞、8-細胞時期TSA組的胚胎中H3K9乙?；Ｊ胶虳MSO組之間存在著差異(P<0.05)(圖3，圖4)。

圖2 小鼠體內(nèi)胚、體外培養(yǎng)胚和孤雌胚各時期H3K9ac模式

圖3 小鼠體內(nèi)孤雌胚、DMSO處理孤雌胚和TSA處理孤雌胚各時期H3K9ac模式

圖4 TSA處理后小鼠植入前各期孤雌胚胎H3K9ac水平相對熒光強度半定量分析

3 討 論

本文主要研究了小鼠孤雌胚、體外培養(yǎng)胚的H3K9ac模式與體內(nèi)正常胚之間的差異，及TSA對孤雌胚 H3K9ac模式的影響。對上述胚胎及體內(nèi)胚的 H3K9ac模式進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)的熒光強度總體趨勢是先降低后升高，原核期熒光強度最大(0.12±0.018)。這可能是由于母源基因在基因表達中處于優(yōu)勢地位所致。研究表明[16,17]，HDAC家族中的HDAC1在正常胚胎的2-細胞時期開始表達，4-細胞時期表達也較活躍，因而組蛋白去乙?；介_始漸升，而組蛋白去乙酰化又抑制基因轉(zhuǎn)錄，可以推測正常胚在 2-細胞、4-細胞時期組蛋白乙酰化程度可能處于較低水平。越來越多的研究表明[18]，在正常胚胎 4-細胞、8-細胞時期的細胞核中，可以檢測到 HDAC1的表達，表明小鼠在植入前各時期體內(nèi)胚的 H3K9ac模式是先降低后升高，與本文的研究結(jié)果一致。由于孤雌胚 H3K9ac的趨勢和體內(nèi)胚總體趨勢基本一致，所以本文推測孤雌胚胎的H3K9ac模式也可能遵循此趨勢。本課題組前期研究表明，孤雌胚的H3K27ac模式亦是如此[19]。通過實驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)TSA處理的孤雌胚，其H3K9乙?；傮w水平有所升高，與孤雌正常胚相比，在原核期至8-細胞階段表現(xiàn)出差異顯著(P<0.05)。由于孤雌胚H3K9ac水平高于體內(nèi)胚，使植入前胚胎發(fā)育過程中應(yīng)沉默的基因啟動子發(fā)生超乙?；?，進而抑制胚胎發(fā)育；而經(jīng)TSA處理的孤雌胚，其H3K9乙?；惶岣叩揭粋€更高的水平，理論上這不利于孤雌胚的正常發(fā)育，然而實驗結(jié)果表明其發(fā)育率有所提高，表明TSA提高孤雌胚的發(fā)育能力可能并不完全是通過改變H3K9乙?；絹韺崿F(xiàn)的(圖3，圖4)。體外培養(yǎng)組的總體趨勢和體內(nèi)組一致，僅在原核期兩組之間差異顯著(P<0.05)，造成此結(jié)果的原因可能是由于體外組比體內(nèi)組的原核胚在培養(yǎng)液中多放置了5 h后才固定，這期間不可控的體外培養(yǎng)環(huán)境可能對胚胎正常發(fā)育造成了一定的影響。

本研究結(jié)果表明，植入前小鼠各時期體外培養(yǎng)胚胎 H3K9ac模式與體內(nèi)胚差異不顯著，但孤雌激活胚 H3K9ac模式與體內(nèi)胚胎存在著差異，這可能是造成孤雌胚發(fā)育能力較差的原因之一。TSA處理在一定程度上提高了胚胎發(fā)育率，但可能并不完全是通過改變 H3K9乙?；絹韺崿F(xiàn)的，進一步地深入開展相關(guān)研究將對糾正小鼠孤雌胚胎異常的乙?；Ｊ揭约疤岣吖麓婆甙l(fā)育能力具有重要的意義。

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(責任編委: 吳強)

Comparative analysis of H3K9 acetylation level in parthenogenetic, and in vitro and in vivo developed mouse embryos

Li Chen1, Fang Ding1, Yong Liu2,3, Fengrui Wu2,3, Biao Ding2,3, Rong Wang2,3, Wenyong Li2
1. College of Life Science, Anhui University, Hefei 230039, China; 2. Key Laboratory of Embryo Development and Reproductive Regulation of Anhui Province, Fuyang 236041, China; 3. College of Life Science, Fuyang Normal University, Fuyang 236041, China

The developmental rate of parthenogenetic embryos is slower than that of embryos generated in vitro and in vivo. To detect the effects of epigenetic modification on embryo development, we compared the H3K9 acetylation level in these three types of embryos as well as parthenogenetic embryos treated with a histone deacetylase in-hibitor trichostatin (TSA) by indirect immunofluorescence. Our results showed that fluctuations in the level of acetylated H3K9 detected during embryo development are similar among different types of mouse embryos. However, the level of H3K9 acetylation in parthenogenetic embryos is significantly higher while the level in embryos generated in vitro is lower when compared with that in embryos derived from in vivo. Treatment of parthenogenetic embryos with TSA increases the developmental rate but further elevates the level of H3K9 acetylation, especially from pronuclear to 8-cell stages. These results suggest that the promoters of genes that should be silenced during pre-implantation embryo development may be hyperacetylated in parthenogenetic embryos which inhibit normal embryo development. However, the positive effect of TSA on embryo development is not through altering the H3K9 acetylation level.

epigenetic modification; parthenogenetic embryos; H3K9 acetylation; trichostatin A (TSA); mouse

2014-06-18;

2014-10-01

國家自然科學基金項目(編號：31372273，31201789)，安徽省省級學科建設(shè)重大項目(編號：皖教秘科[2014]28號)，安徽大學學術(shù)創(chuàng)新研究項目(編號：yqh100130)，安徽省教育廳自然科學基金項目(編號：KJ2013A202)和安徽省自然科學基金項目(編號：1408085MC44, 1408085QC65)資助

陳利，碩士研究生，專業(yè)方向：發(fā)育分子生物學。E-mail：chenli3096@163.com

李文雍，教授，碩士生導師，研究方向：胚胎發(fā)育分子生物學。E-mail: liwenyong@aliyun.com

10.16288/j.yczz.2015.01.011

時間： 2014-11-24 17:57:46

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20141124.1757.002.html