李洪艷，佟少明，燕秋

1. 遼寧師范大學生命科學學院，大連 116081；2. 大連醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，生物化學與分子生物學教研室，大連 116044

HaCaT 細胞中FUT4表達與其啟動子區(qū)甲基化的相關性分析

李洪艷1，佟少明1，燕秋2

1. 遼寧師范大學生命科學學院，大連 116081；2. 大連醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，生物化學與分子生物學教研室，大連 116044

巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶Ⅳ(Fucosyltransferase Ⅳ，F(xiàn)UT4)在正常細胞中表達量很低，但其低表達的調(diào)控機制以及是否受其啟動子甲基化調(diào)控并不十分清楚。文章采用Western blot、免疫熒光和Real-time PCR的方法檢測正常人永生化表皮細胞系HaCaT細胞FUT4的表達，觀察DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-aza-dC處理對FUT4表達的影響。應用甲基化特異性PCR方法分析HaCaT細胞中FUT4啟動子甲基化狀態(tài)。結(jié)果表明，HaCaT細胞中FUT4的表達水平明顯低于人表皮鱗癌細胞A431和SCC12。5 μmol/L的5-aza-dC處理72 h的HaCaT細胞，其FUT4 mRNA水平明顯升高，并且與未經(jīng)5-aza-dC處理的對照組相比，U引物擴增檢測到的產(chǎn)物量增加，M 引物擴增檢測到的產(chǎn)物量明顯減少。這些結(jié)果表明，HaCaT細胞中FUT4的低表達可能與其啟動子區(qū)CpG島甲基化有關。

巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶Ⅳ；低表達；甲基化；HaCaT細胞

細胞表面的糖蛋白或糖脂是細胞與細胞之間、細胞與細胞外基質(zhì)之間傳遞信號的紐帶，而糖蛋白和糖脂上的寡糖鏈是其行使功能的重要組成部分。其中，Lewis 寡糖如Lewis a (Lea)、sLewis a (sLea)、Lewis b (Leb)、Lewis X (LeX)、sLewis X (sLeX) 和Lewis Y (LeY)是寡糖中的一類，其共同特點是都含有巖藻糖分子 Fucose，因此這些寡糖又可稱為巖藻糖寡糖[1]。

巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶(Fucosyltransferase，F(xiàn)UT)負責催化巖藻糖寡糖的合成，迄今為止，共發(fā)現(xiàn) 11個FUT，分別命名為FUT1-FUT11。其中FUT4是合成LeY 寡糖的關鍵酶，它以[Fucα1→2Galβ1→4Glc-NAcβ1→R]為受體，以α-1,3糖苷鍵將巖藻糖基(Fucose)連接到 N-乙酰葡萄糖上形成[Fucα1→2Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAcβ1→R]，即 LeY寡糖分子。該寡糖存在于多種蛋白分子上，如表皮生長因子受體EGFR，從而完成蛋白分子之間、細胞之間的相互識別和作用。研究表明，F(xiàn)UT4和LeY在細胞生理及病理條件下的細胞信號轉(zhuǎn)導過程中都發(fā)揮著重要作用[2,3]。FUT4在上皮來源的癌中表達水平升高[4～8]。用FUT4的過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A431細胞，發(fā)現(xiàn)細胞中FUT4表達明顯增加，對細胞的生長具有促進作用；而用FUT4 RNA干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A431細胞，F(xiàn)UT4的表達明顯下調(diào)，細胞的增殖及移植瘤的生長均被抑制[1,9,10]。腫瘤組織中的LeY寡糖表達水平比正常組織中的表達水平明顯升高。不同的腫瘤以及腫瘤的不同分期，LeY的表達量也不同，因此LeY的表達水平成為腫瘤相關性的診斷、治療、預后的一種標志物[11,12]。用LeY的特異性抗體可以封閉表皮生長因子受體介導的信號轉(zhuǎn)導途徑，從而抑制癌細胞的增殖和腫瘤的生長[13,14]。

然而，F(xiàn)UT4在腫瘤細胞和正常細胞中差異表達的調(diào)控機理并不十分清楚，本實驗室前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)FUT4在人表皮鱗癌細胞A431和SCC12細胞中的表達水平與啟動子的不同甲基化水平有關[l5]。本研究旨在探討正常細胞中 FUT4的表達水平及其是否也受啟動子甲基化調(diào)控，為 FUT4在不同細胞中表達水平的差異性調(diào)控提供更多的實驗依據(jù)，同時為臨床上癌癥的診斷和治療提供新思路。

1 材料和方法

1.1 細胞

人永生化表皮細胞系HaCaT細胞和人表皮鱗癌細胞系A431細胞均購自美國ATCC細胞庫，人表皮鱗癌細胞系SCC12細胞由哈佛大學醫(yī)學院皮膚病學系Dr. James Rheinwald 惠贈。所有細胞均培養(yǎng)于添加10%的胎牛血清、100 U/mL青霉素、50 μg/mL鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基中(Gibibco公司)，培養(yǎng)條件5%CO2、37℃。

1.2 方法

1.2.1 Real-time PCR

應用Trizol 試劑(Invitrogen公司)提取HaCaT、A431和SCC12細胞的總RNA，具體操作如下：6孔板培養(yǎng)的細胞加入1 mL Trizol，反復吹打混勻3～5 min，將細胞裂解液收集到 1.5 mL離心管里，冰上放置10 min。每管加入氯仿0.2 mL，充分振蕩15 s，室溫下靜置3～5 min。4℃、10 000 r/min離心15 min，將上清移入另外的離心管中。加入0.5 mL的異丙醇(或與上清等體積的異丙醇)，-20℃放置30 min。4℃、10 000 r/min離心10 min。棄異丙醇，用DEPC處理過的水配制70%乙醇洗滌沉淀。4℃、10 000 r/min離心5 min，棄乙醇，沉淀在空氣中自然干燥，加入50 μL DEPC水溶解沉淀，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性。紫外分光光度計檢測RNA純度和含量，并將濃度調(diào)成1 μg/μL。

用DNA酶消化后按照M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶說明書進行常規(guī)反轉(zhuǎn)錄反應，獲得 cDNA，然后采用染料法進行 Real-time PCR，擴增FUT4基因。FUT4擴增引物為：5′-CTCAGGCCGTGCTTTTCCA-3′(Forward)和5′-GTAGTCCAACACGCGCAGAT-3′(Reverse)。GAPDH擴增引物為：5′-ATGGGGAAGGTGAAGGTCG-3′(Forward)和5′-GGGGTCATTGATGGCAACAATA-3′(Reverse) (TaKaRa公司)。反應條件：95℃預變性30 s；95℃變性5 s，60℃復性10 s，45個循環(huán)，選取15～20個循環(huán)處的數(shù)據(jù)進行分析。按照以上程序，進行 3次重復實驗?；虮磉_的定量分析采用比較CT值法，GAPDH作為內(nèi)參基因，用以校正每個樣品中總RNA量的偏差。將比較CT值法得到的數(shù)據(jù)繪制成柱形統(tǒng)計圖，根據(jù)柱形圖縱坐標的數(shù)值衡量 FUT4的相對表達量的高低及各樣本之間表達倍數(shù)關系。

1.2.2 5-aza-dC對細胞的處理

5-aza-dC (Sigma公司) 用冰醋酸配成0.5 mol/L的保存母液，-80℃保存。由于該藥極不穩(wěn)定，需現(xiàn)用現(xiàn)配，每個藥物處理周期前根據(jù)使用量取出適量母液稀釋成0.05 mol/L，并分裝成20 μL/管，-20℃保存。細胞鋪板 24 h后，用終濃度為 5 μmol/L 的5-aza-dC處理細胞，每24 h更換一次培養(yǎng)液，并向培養(yǎng)液中重新加入新鮮的5-aza-dC，藥物作用72 h后收取細胞，可用于提取總DNA，RNA或總蛋白。

1.2.3 甲基化特異性PCR(Methylated-specific PCR, MSP)

采用苯酚法提取總DNA。具體操作如下：6孔板培養(yǎng)細胞至90%以上的融合度，胰酶消化并離心。細胞沉淀中加入0.5 mL DNA 提取緩沖液，同時加入RNase，在37℃水浴中保溫30 min。然后加入2 μL蛋白酶K，并在50℃下保溫2 h。加入等體積的飽和酚，充分震蕩混勻，10 000 r/min離心10 min。將上層水相轉(zhuǎn)入另一個 Ep管中，加等體積氯仿/異戊醇(24:1)，充分混勻后，10 000 r/min離心10 min。將上層水相轉(zhuǎn)入新的Ep管中，加入3 mol/L的NaAC 50 μL，2倍體積的無水乙醇，離心后沉淀用 70%乙醇離心洗滌一次，保留沉淀，自然干燥，加適量的無菌水或TE溶解。瓊脂糖電泳鑒定并用紫外分光光度計定量所提取的DNA，然后按照EZ DNA Methylation-Gold 試劑盒(ZYMO REASCHER公司)說明書操作，使非甲基化的CpG轉(zhuǎn)變成UpG，而甲基化的CpG不變。以試劑盒處理過的DNA為模板進行甲基化特異性PCR。M對引物：5′-CGGGTTGTTTTTATAATTCGATC-3′和5′-AATAACGTCGACTTCCTACCGT-3′(TaKaRa公司)。反應條件：94℃預變性5 min；然后94℃ 30 s，48℃ 1 min，72℃ 30 s，35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。U 對引物：5′-TGGGTTGTTTTTATAATTTGATTGT-3′和5′-AAAATAACATCAACTTCCTACCATT-3′(TaKaRa公司)。反應條件：94℃預變性5 min；然后94℃ 30 s，45℃ 1min，72℃ 30 s，35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 Western blot

6孔板培養(yǎng)的細胞，PBS清洗后，加入適量的蛋白變性裂解液，用細胞刮刀將細胞收集到1.5 mL離心管中，4℃冰箱放置2 h，期間在振蕩器上間歇震蕩3次。離心后，以BSA為標準品，考馬斯亮藍法定蛋白含量。根據(jù)蛋白定量結(jié)果，調(diào)整每個樣品的總蛋白上樣量，進行SDS-PAGE電泳，電泳后的凝膠按照常規(guī)方法轉(zhuǎn)移到 NC膜上。轉(zhuǎn)膜后，將膜放于 5 %脫脂奶粉中進行封閉，封閉后根據(jù)分子量大小將膜剪成上下兩部分，并分別與FUT4、β-actin單克隆或多克隆抗體(Proteintech公司)免疫雜交，經(jīng)過夜結(jié)合，次日PBS清洗多余一抗后，進行二抗結(jié)合，PBS清洗掉多余二抗后，采用ECL法顯示蛋白的表達[15]。

1.2.5 免疫熒光

在正常狀態(tài)下爬片培養(yǎng)的細胞，經(jīng) PBS漂洗、冰丙酮固定、破膜、正常羊血清封閉，加入 FUT4特異性一抗孵育液(Santa Cruz公司)，37℃孵育1 h 或4℃過夜。細胞經(jīng)PBS漂洗并加入羅丹明標記的熒光二抗，37℃孵育1 h，PBS漂洗，封片后，細胞在熒光顯微鏡下掃描并拍照，檢測 FUT4蛋白在細胞中表達情況[15]。

1.2.6 統(tǒng)計學分析

所有的實驗均重復3次，數(shù)據(jù)采用T檢驗進行分析，當 P＜0.05時具有顯著性差異，當 P＜0.01時具有極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 FUT4在人永生化表皮細胞系 HaCaT細胞中的表達

采用Western blot的方法(圖1A)對HaCaT細胞中 FUT4的表達水平進行了檢測。結(jié)果表明，與作為對照的人表皮鱗癌細胞系A431和SCC12細胞相比，F(xiàn)UT4在HaCaT細胞中的表達量較低。

免疫熒光方法(圖1B)顯示，F(xiàn)UT4主要定位在細胞漿內(nèi)，HaCaT細胞中熒光強度明顯較A431細胞和SCC12細胞中弱，同樣表明FUT4在HaCaT細胞中的表達水平較低。

進一步采用Real-time PCR方法(圖2)對HaCaT細胞中 FUT4的表達進行了定量分析。結(jié)果顯示A431和SCC12細胞中FUT4 mRNA的表達水平分別約是HaCaT細胞中的13倍和5倍。

2.2 5-aza-dC對HaCaT細胞中FUT4表達的影響

為了觀察DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-aza-dC是否會對HaCaT 細胞中FUT4的表達水平有影響，將細胞用5 μmol/L的5-aza-dC 處理72 h，檢測FUT4的表達變化。Real-time PCR結(jié)果表明，與未經(jīng)藥物處理組相比，5-aza-dC處理 HaCaT細胞后，F(xiàn)UT4 mRNA的表達明顯增加，并與 A431細胞中的表達水平相當(圖 2)。同樣的藥物處理也引起了 SCC12細胞中FUT4 mRNA表達明顯增加，而A431細胞中FUT4 mRNA表達基本不變。這一結(jié)果提示，HaCaT細胞中FUT4的表達水平和細胞中DNA甲基化水平可能有關。

2.3 5-aza-dC對HaCaT細胞中FUT4啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)的影響

圖1 FUT4在HaCaT細胞中的表達

圖2 5-aza-dC對HaCaT細胞中FUT4 mRNA表達的影響

為了進一步確定HaCaT 細胞中FUT4的表達是否直接受FUT4啟動子甲基化調(diào)控，利用軟件Meth-Primer(http//www.urogene.org//methprimer/indexl.html) 對FUT4啟動子區(qū)的CpG島進行了預測，結(jié)果表明在轉(zhuǎn)錄起始位點上游-29～-725 bp處存在兩個CpG島[15]，本文選擇-429～-671 bp處的CpG島，采用甲基化特異性PCR的方法對FUT4啟動子的甲基化狀態(tài)進行了分析。結(jié)果表明，5-aza-dC對HaCaT細胞處理前，使用M引物擴增檢測到大量產(chǎn)物，U引物擴增未檢測到產(chǎn)物。5 μmol/L的5-aza-dC處理HaCaT細胞72 h后，U引物擴增檢測到大量產(chǎn)物，M引物擴增未檢測到產(chǎn)物(圖3)。SCC12細胞加藥處理后也出現(xiàn)甲基化產(chǎn)物減少，非甲基化產(chǎn)物增加的趨勢，但沒有HaCaT細胞中的變化顯著。這一結(jié)果提示，F(xiàn)UT4在HaCaT細胞中的低表達與其啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)相關。

圖3 HaCaT細胞中FUT4啟動子甲基化狀態(tài)分析

3 討 論

細胞表面糖蛋白和糖脂上的巖藻糖寡糖LeY在精卵識別、胚胎著床及發(fā)育等生理過程和腫瘤等病理過程中起著非常重要的作用。FUT4是合成 LeY的關鍵酶，定位于高爾基體上。研究表明，F(xiàn)UT4 和LeY在相同組織來源的腫瘤細胞和正常細胞中以及不同組織來源的腫瘤細胞中其表達水平具有明顯差異，但調(diào)控這種表達差異的原因還不是很清楚。

Taniguchi等[16]研究表明，在急性髓性白血病和結(jié)腸癌細胞系中，F(xiàn)UT4轉(zhuǎn)錄本的長短不一樣，并確定了長短轉(zhuǎn)錄本的增強子。楊雪松等[17]報道，在乳腺癌細胞中 HSF1 和 Sp1兩個轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控了FUT4的表達，從而影響細胞的增殖。Withers等[18]則證明Elk-1是組織細胞淋巴瘤U937細胞中FUT4表達的關鍵轉(zhuǎn)錄因子，并且FUT4基因符合CpG島的定義。近年來，基因啟動子區(qū)CpG島甲基化狀態(tài)改變被認為是很多基因表達調(diào)控的重要手段[19～24]，也有研究證明巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因FUT3、FUT7的表達受其啟動子甲基化水平的調(diào)控[25,26]。在本實驗室前期的研究中發(fā)現(xiàn)并報道了增殖能力弱的人表皮鱗癌細胞系SCC12細胞比增殖能力強的A431細胞中 FUT4啟動子甲基化程度高，加入甲基化酶抑制劑5-aza-dC處理后，SCC12細胞中FUT4表達水平明顯提高，啟動子區(qū)甲基化水平顯著降低[15]。

但 FUT4在正常細胞中的表達水平如何，是不是其表達也受啟動子甲基化調(diào)控呢？本研究采用正常的人永生化表皮細胞系HaCaT細胞以及人表皮鱗癌細胞系A431和SCC12細胞對其進行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)UT4在HaCaT、SCC12和A431細胞中的表達水平依次升高。這一結(jié)果提示，在正常的細胞中FUT4處于基礎表達水平，當細胞惡性轉(zhuǎn)變以后，F(xiàn)UT4的表達明顯增加。研究表明，F(xiàn)UT4的表達水平與細胞的增殖、遷移能力相關[1,4,27]，少量的FUT4表達可以滿足正常細胞正常生理活動的需要，而當細胞惡性生長后，就需要大量的 FUT4的表達，產(chǎn)生大量的LeY巖藻糖寡糖，從而加強細胞之間的識別，激活相關信號轉(zhuǎn)導途徑，促進腫瘤細胞的惡性發(fā)展。

為了證明HaCaT細胞中FUT4的低表達是否與甲基化有關，本研究用 5 μmol/L的 5-aza-dC處理HaCaT細胞72 h后，檢測了基因表達水平及啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)的變化，結(jié)果表明，HaCaT細胞中FUT4 mRNA的表達水平顯著升高，說明HaCaT細胞中 FUT4的表達和細胞中的甲基化水平相關，但不能確定5-aza-dC作用后FUT4表達的變化是受其自身啟動子甲基化狀態(tài)的直接調(diào)控還是由于其他類似轉(zhuǎn)錄因子的基因表達變化從而間接引起的。通過軟件對FUT4啟動子區(qū)的CpG島進行了預測，并選取其中的一個CpG島進一步研究其甲基化情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)UT4表達升高的同時，該CpG島的甲基化程度顯著降低，這一結(jié)果暗示，F(xiàn)UT4的表達可能是和其自身啟動子的甲基化程度相關。

一般認為，基因的啟動子區(qū)甲基化抑制基因的表達，一方面是由于直接影響了轉(zhuǎn)錄因子與DNA的結(jié)合，另一方面是由于啟動子甲基化以后會與甲基化結(jié)合蛋白(Methyl-CpG binding proteins)結(jié)合，進一步招募去已?；?HDAC)，共抑制蛋白(mSin3A)，使染色質(zhì)處于凝縮狀態(tài)，致使RNA聚合酶、轉(zhuǎn)錄因子等不能結(jié)合到DNA上，從而轉(zhuǎn)錄被抑制。Zhu等[28]研究報道，p21Cip1基因的轉(zhuǎn)錄因子 Sp1/Sp3識別區(qū)周圍序列的甲基化可以直接減少該轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，從而影響基因轉(zhuǎn)錄。Zhang等[29]則發(fā)現(xiàn)甲基化酶抑制劑5-aza-dC處理癌細胞后，LHR基因的表達水平升高，并不是因為轉(zhuǎn)錄因子的活性或與啟動子區(qū)的結(jié)合數(shù)量發(fā)生變化，而是因為促進了去乙?；笍秃衔颒DAC1/HDAC2/mSin3A從LHR啟動子區(qū)解離，提高了乙?；?，從而促進基因表達。在本研究中，與A431和SCC12兩種惡性細胞相比，HaCaT細胞可能由于不需要太多FUT4的表達，因此FUT4啟動子區(qū) CpG島需要處于更高程度的甲基化狀態(tài)，啟動子的高度甲基化致使轉(zhuǎn)錄因子不能與啟動子區(qū)結(jié)合，進而大量減少 FUT4基因的轉(zhuǎn)錄，使 FUT4的表達維持在基礎水平，滿足細胞的正常生長需要。但 FUT4啟動子區(qū)從甲基化到去甲基化，基因從低表達到高表達，其啟動子區(qū)上所結(jié)合的蛋白究竟發(fā)生了怎樣的轉(zhuǎn)變還有待于進一步研究。

值得注意的是，SCC12細胞經(jīng)5-aza-dC作用72 h后，F(xiàn)UT4 mRNA的表達量雖然有所提高，但并沒有達到A431細胞中的表達水平。分析原因有以下幾種可能：第一，F(xiàn)UT4的表達很有可能還受其他因素的影響，如轉(zhuǎn)錄因子的活性和結(jié)合數(shù)量以及組蛋白的乙酰化狀態(tài)等，多種方式參與的調(diào)控也見于其他基因的研究中[29]。相關文獻也表明，在不同的細胞中，細胞的不同狀態(tài)下，對 FUT4的表達起主要調(diào)控作用的機制可能不同[16～18]。本文所選取的細胞是正常細胞和惡性程度不同的癌細胞，這種細胞之間的差異性很可能會形成相同的基因卻存在不同的表達調(diào)控機制。第二，5-aza-dC是一種甲基化酶抑制劑，根據(jù)預實驗并參考文獻的報道，本文采用終濃度為5 μmol/L、作用時間72 h。由于細胞之間存在差異性，可能這個使用濃度和作用時間對SCC12細胞來講并不是最佳條件，因而藥物作用后雖然出現(xiàn) FUT4啟動子去甲基化，基因表達水平升高的趨勢，但并沒有達到完全去甲基化，基因的表達水平也沒有達到最高。

本研究一方面為 FUT4在不同細胞中的表達調(diào)控機制提供了參考依據(jù)；另一方面，由于所選擇的研究細胞是正常細胞和惡性程度不同的鱗癌細胞，在這些細胞中 FUT4的表達具有隨著惡性程度的升高而表達量增加，甲基化程度降低的趨勢。FUT4基因在臨床病人的樣本中如果也具有同樣的甲基化調(diào)控趨勢，那么檢測 FUT4啟動子的甲基化狀態(tài)將有望成為臨床上鱗癌的診斷及惡性程度分級的輔助手段，同時也為抗癌藥物的研發(fā)提供新思路。

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(責任編委: 方向東)

Correlation between FUT4 expression and its promoter methylation in HaCaT cells

Hongyan Li1, Shaoming Tong1, Qiu Yan2
1. College of Life Science, Liaoning Normal University, Dalian 116081, China; 2. Department of Biochemistry and Molecular Biology, Dalian Medical University, Dalian 116044, China

The expression level of fucosyltransferase Ⅳ (FUT4) is low in normal cells. The mechanism underlying regulation of FUT4 expression in normal cells remains elusive. In this study, Western blot, immunofluorescence and real-time PCR were used to analyze FUT4 expression in the immortalized human keratinocytes cells HaCaT. Methylated-specific PCR was used to investigate methylation status of FUT4 promoter. The results showed that the FUT4 expression level was significantly lower in HaCaT cells than squamous carcinoma cells A431 and SCC12. FUT4 mRNA expression was increased in HaCaT cells treated by 5-aza-dC (5 μmol/L), an inhibitor of DNA methyltransferase. Furthermore, using the primers to amplify the methylated fragment yielded PCR products and noproducts were yielded by the primers to amplify the unmethylated fragment in HaCaT cells. Unmethylated PCR products were obtained in HaCaT cells treated by 5-aza-dC, while methylated PCR products were not detected. These results suggest that the lower expression of FUT4 in HaCaT cells may be correlated with the methylation of CpG island in FUT4 promoter.

FUT4; low expression; DNA methylation; HaCaT cells

2014-07-09;

2014-08-19

李洪艷，博士，副教授，研究方向：腫瘤糖生物學，表觀遺傳學。Tel: 0411-85827090；E-mail: L-hongyan@163.com

燕秋，博士，教授，研究方向：糖生物學。E-mail: yanqiu63@126.com

10.16288/j.yczz.2015.01.007

時間： 2014-9-19 13:35:30

URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20140919.1335.001.html