方健源，謝碧霞，羅 韜，胡淑芬，譚冬梅

(1.廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院檢驗科，廣東廣州511400;2.廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院血液科，廣東廣州511400)

隨著白血病治療方案的改進，白血病治療水平不斷提高，急性白血病(acute leukemia，AL)有了較高的緩解率，但仍有相當一部分患者復發(fā)。目前認為造成白血病復發(fā)的關(guān)鍵因素是白血病經(jīng)治療后體內(nèi)仍殘留少量的腫瘤細胞，即存在微小殘留病變(minimal residual disease，MRD)，這些腫瘤細胞的克隆增殖導致白血病復發(fā)。白血病細胞通常表達異常的表面抗原表型，即白血病相關(guān)表型[1]，具有異常光散射特性，因此能與正常造血成分相互區(qū)別。聯(lián)合利用多種單克隆抗體，多參數(shù)流式細胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)可以同時檢測細胞表面不同抗原表達的多參數(shù)熒光信號，進而識別完全緩解后混于正常造血細胞中的MRD。本研究收集AL患者的骨髓和外周血標本進行檢測分析，探討FCM檢測外周血白血病細胞在AL復發(fā)的臨床價值。

材料和方法

一、研究對象

選擇2012年1月至2013年12月廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院血液科收治的71例AL患者(不包括急性早幼粒細胞白血病患者)，其中急性髓細胞白血病(acute myeloid leukemia，AML)44例、急性淋巴細胞白血病(acute lymphocytic leukemia，ALL)27例，于達完全緩解時及鞏固化療期間監(jiān)測。診斷符合FAB及2008年世界衛(wèi)生組織的診斷標準[2]。

二、方法

1.多參數(shù)FCM 采集外周血乙二胺四乙酸二鉀抗凝，利用四色熒光(4種熒光素分別為異硫氰酸熒光素、藻紅蛋白、別藻青蛋白、多甲藻葉綠素蛋白)直接免疫標記法進行免疫分型檢測。在每支檢測試管中加1×106有核細胞。根據(jù)每例患者的白血病特點選擇單克隆抗體組合(試劑均為美國BD公司產(chǎn)品)，按照試劑說明書進行操作。至少收集10萬個可供分析的有核細胞，用流式細胞儀(美國BD公司)收集細胞，每支試管用配套的CellQuest軟件分析細胞標志。根據(jù)原始細胞上抗原是否跨系表達、表達不同步(不同階段的抗原同時表達)、表達過強、表達過弱、丟失等判定是否為MRD，MRD≥0.01% 為陽性，否則為陰性。

2.骨髓細胞形態(tài)學檢測 骨髓液涂片6～8張，經(jīng)吉姆薩-瑞士染色后，在日本OLYMPAS顯微鏡油鏡下分類200個細胞，根據(jù)形態(tài)進行不同階段的分類計數(shù)。根據(jù)張之南等[3]主編的《血液病診斷及療效標準》(第3版)判斷療效是否為復發(fā)。

三、治療方案

AML(非M3)的誘導化療方案采用柔紅霉素加阿糖胞苷、去甲氧柔紅霉素加阿糖胞苷或米托蒽醌加阿糖胞苷方案。骨髓達完全緩解后采用原方案鞏固強化治療2個療程，然后分別用中或大劑量阿糖胞苷治療，完成4個療程休息2個月，用柔紅霉素加阿糖胞苷和米托蒽醌加阿糖胞苷方案交替治療2個療程，每療程間隔3個月，此后停止化療，定期隨訪。ALL治療:誘導緩解為VDCP方案(長春新堿 2 mg，第 1、8、15、22 天;柔紅霉素45 mg/m2，第1天至第3天，第15天至第16天;環(huán)磷酰胺1 000 mg/m2，第1、15天;潑尼松每天1 mg/kg，14 d)，完全緩解后進入鞏固強化治療。

71例AL患者在誘導化療結(jié)束獲得完全緩解后開始隨訪，至復發(fā)隨訪結(jié)束，未復發(fā)隨訪至今，隨訪時間1～24個月，中位數(shù)16個月。

四、統(tǒng)計學方法

應用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計數(shù)資料以百分率(%)表示，組間比較用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、FCM檢測AL患者外周血MRD

以FAB分型骨髓形態(tài)學作為判斷復發(fā)的金標準;部分患者定期接受多次檢查，外周血MRD結(jié)果以首次結(jié)果為準。FCM檢測外周血MRD對提示AML和ALL復發(fā)的敏感性和特異性見表1。

表1 FCM檢測外周血MRD對提示AL復發(fā)的敏感性和特異性 [例(%)]

二、外周血 MRD陰性組與陽性組復發(fā)率比較

12例外周血MRD陰性組中有3例(25.0%)患者復發(fā)，59例外周血MRD陽性組中有44例(74.6%)復發(fā)，MRD陽性組復發(fā)率明顯高于MRD陰性組(P＜0.05)。外周血MRD陰性組與陽性組在24個月隨訪期間的復發(fā)率比較見圖1。

三、高低外周血MRD水平復發(fā)率比較

59例AL患者外周血MRD定量值按高MRD水平(≥10－2)和低 MRD水平(＜10－2)分成 2組，高MRD水平組38例，低MRD水平組21例。2組復發(fā)例數(shù)分別是37例(97.4%)和10例(47.6%)。高MRD水平組復發(fā)率明顯高于低MRD水平組(P ＜0.05)。

圖1 外周血MRD陰性組與陽性組復發(fā)率比較

討 論

多參數(shù)FCM的免疫分型對MRD的檢測已成為研究AL的基本手段，并為AL的診斷、治療及預后判斷提供重要依據(jù)。趙利東等[4]研究提出誘導治療能殺死大量的白血病細胞，但尚未徹底清除，少數(shù)患者初次誘導緩解時MRD值持續(xù)陽性直至復發(fā)。是否達到完全緩解以及緩解的程度是影響患者預后的重要參數(shù)之一。臨床上對AL治療效果的評價主要通過骨髓細胞形態(tài)學檢查，其具有一定的局限性，骨髓穿刺取材只能反映一部分的骨髓情況。采用骨髓細胞形態(tài)學診斷標準一般在體內(nèi)白血病細胞數(shù)超過1%時方能檢測到，而體內(nèi)MRD的持續(xù)存在會導致患者最終白血病的復發(fā)。從患者角度出發(fā)，反復骨髓穿刺難以接受，而外周血取材方便，采集外周血無疑更合適。為此，我們針對AL患者的骨髓和外周血標本進行檢測分析，探討FCM檢測外周血白血病細胞在AL復發(fā)的臨床價值。

我們用FCM檢測了71例AL患者的外周血MRD，發(fā)現(xiàn)外周血MRD與患者的預后有明顯的相關(guān)性。FCM檢測AL患者的外周血MRD對提示AL復發(fā)具有較高的敏感性，AML組與ALL組的敏感性分別為96.6%和88.9%。MAURILLO等[5]將外周血作為 MRD的檢測對象，結(jié)果顯示外周血MRD同樣與AML患者的長期預后相關(guān)，提示外周血循環(huán)原始細胞的存在可能與骨髓中的白血病細胞的持續(xù)存在有關(guān)。本研究中有15例外周血MRD陽性但骨髓形態(tài)學檢查未達到復發(fā)的程度，這就提示此部分患者需要進一步追蹤觀察，以便采取下一步治療方案。MRD是一個強烈提示緩解和復發(fā)的預后因素。臨床應用MRD檢測可有效指導完全緩解后的治療，根據(jù)MRD的水平進行預后分級及選擇相應的化療方案等。若MRD持續(xù)陰性，可停止治療;若MRD持續(xù)陽性，應給予患者更強的化療，或考慮骨髓移植。朱勇梅等[6]對骨髓和外周血中MRD水平比較發(fā)現(xiàn)，兩者會因檢測時間、疾病亞型和治療方案的不同而有所不同，但存在一定的比例關(guān)系。BUCCISANO等[7]認為外周血的檢測同骨髓一樣有意義，如果同時檢測外周血及骨髓，可能提高檢出率。如果鞏固化療后外周血的MRD水平高于0.015%，復發(fā)概率增加。外周血白血病細胞水平可間接反映骨髓情況，用于治療監(jiān)測。COUSTAN-SMITH 等[8]研究結(jié)果顯示，在 T-ALL骨髓與外周血MRD有很好的一致性，外周血可以用于檢測MRD;而在B-ALL，骨髓MRD檢出率高于外周血，但用外周血檢測MRD可以提供強大的預后信息。

本研究中12例外周血MRD陰性組復發(fā)率為25.0%，59例外周血 MRD陽性組復發(fā)率為74.6%，MRD陽性組復發(fā)率明顯高于MRD陰性組，結(jié)果與文獻[9]相近。國外研究提出，在鞏固治療后用FCM檢測患者的MRD，結(jié)果發(fā)現(xiàn)每一個危險層的MRD陽性患者與陰性患者在無病生存率和總生存率上都有顯著差異。MRD陽性患者總的復發(fā)率為74%，而MRD陰性患者的復發(fā)率僅為 27%[10]。PAWINSKA等[11]認為誘導緩解末 MRD≥10－4的患者需要在治療過程中嚴密監(jiān)測MRD的變化，以便及時采取有效的治療措施。

本研究表明，高MRD水平組復發(fā)率明顯高于低 MRD水平組。張芳等[12]研究結(jié)果表明，F(xiàn)CM檢測的MRD水平與復發(fā)明顯相關(guān)。童春容等[13]提出，大多數(shù)AL為中等危險性患者，而且即使是一些低危險性AL患者化療后也會復發(fā)，尤其是成年白血病患者，化療后的復發(fā)率仍較高。因此需要更多的預后及檢測療效的指標，幫助指導更加個體化的治療。

綜上所述，F(xiàn)CM檢測外周血白血病細胞能很好地提示復發(fā)，且外周血取材方便，創(chuàng)傷性相對較輕，對診斷AL復發(fā)及指導個體化治療有重要意義。

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