厲 倩，龍安雄，洪 茂，蔡雷鳴，謝 驪，顧繼安，譚龍益

(上海市第一人民醫(yī)院寶山分院檢驗科，上海200940)

子癇前期(preeclampsia，PE)是一種常見的孕婦多系統(tǒng)紊亂綜合征，是孕婦和胎兒發(fā)病率和病死率最高的疾病之一[1]。胎兒分娩和胎盤剝離是目前PE唯一的治愈手段，如早期對高危孕婦進行干預(yù)，對減少子癇的發(fā)生及減輕其危害具有一定的價值。到目前為止，PE的病因和病理學(xué)機制尚不清楚，且缺乏理想的預(yù)測和早期診斷指標(biāo)。2007年LIANG等[2]發(fā)現(xiàn)了胎盤特異性微小RNA(microRNA，miR)，隨后胎盤特異性miR被證實在孕期血漿/血清中穩(wěn)定存在，循環(huán)胎盤特異性miR可能是妊娠相關(guān)疾病的良好生物標(biāo)志物。本研究利用實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)檢測 PE患者和正常對照不同孕期血清中胎盤特異性miR-520g的表達(dá)量，探討血清miR-520g對孕婦PE是否具有一定的預(yù)測價值。

材料和方法

一、研究對象

本研究納入了2011年1月至2013年12月在上海市第一人民醫(yī)院寶山分院分娩的30例PE患者和30名無明確妊娠相關(guān)疾病產(chǎn)婦。PE的診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)第7版婦產(chǎn)科學(xué)[3]，即妊娠20周后收縮壓≥18.7 kPa和/或舒張壓≥12.0 kPa伴蛋白尿≥0.3 g/24 h，或隨機蛋白尿陽性。所有研究對象都是單胎妊娠，對照組和病例組的年齡、孕前體重指數(shù)(body mass index，BMI)沒有顯著差異，具體臨床特征見表1。30名正常妊娠者全部完成了孕早期(12～14周)、孕中期(20～24周)和孕晚期(28～32周)血液樣本的收集，30例PE患者收集孕早期血液樣本14例、孕中期血液樣本30例、孕晚期血液樣本30例。

表1 研究對象臨床特征

二、樣本采集、處理及保存

用分離膠真空采血管采集空腹血液樣本3～5 mL，靜置20 min后以1 200×g離心10 min。首次離心后收集上清并高速(12 000×g)離心10 min，轉(zhuǎn)移上清于無RNA酶的無菌Eppendorf管中，－80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

三、RNA抽提

利用miRNeasy Serum/Plasma kit(Qiagen)提取血漿/血清總 RNA，說明書具體步驟如下:在200μL血漿/血清中加入1 mL的Qiazol溶解液，充分混勻后室溫放置 5 min加入 3.5μL Cel miR-39(1.6×108/μL，Qiagen)作為內(nèi)參，加入200μL氯仿，充分混勻后室溫放置3 min，置低溫離心機(Sigma)內(nèi) 12 000×g離心 15 min，將550μL上層澄清萃取液轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL無菌Eppendorf管中，加入1.5 倍(825μL)的無水乙醇，充分混勻，分2次將混合液過洗脫柱，棄去濾過液，洗脫柱分別用700μL RWT、RPE緩沖液和80%乙醇溶液洗滌，末次洗滌后洗脫柱高速(12 000×g)離心5 min以干燥柱內(nèi)膜，最后加入14μL無RNA酶水洗脫總RNA。

四、cDNA第一鏈合成

利用miScriptⅡ逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Qiagen)合成cDNA第一鏈(加尾法)，具體如下:150μL PCR反應(yīng)管中加入2μL10×RT mix，2μL10×nucleics mix，8μL無RNA酶水，4μL 5×hispec Buffer和4μL總RNA，充分混勻并低速(1 200×g)離心1 min后置于擴增儀(Bioer)中，36℃1h，95℃5min。

五、熒光定量PCR

利用miScirpt SYBR green PCR試劑盒(Qiagen)和ABI7500擴增儀進行熒光實時定量。反應(yīng)體系如下:10μL 2×master mix，2μL 10×通用引物，2μL 10×特異性引物，4μL 無 RNA 酶水和2μL 100倍稀釋的cDNA模板。擴增條件如下:95 ℃變性15 min，94 ℃ 15 s、55 ℃ 30 s、70 ℃34 s，延伸階段采集熒光信號，共40個循環(huán)。內(nèi)參基因選擇RNA抽提過程中加入的Cel miR-39。Cel miR-39和miR-520g在2孔中進行擴增。每個標(biāo)本都做3個平行復(fù)孔，取Ct平均值。所有熒光定量PCR在96孔反應(yīng)板內(nèi)進行，單個標(biāo)本miR-520g的表達(dá)量用相對miR-39的Ct差值表示。差異表達(dá)的相對定量分析用2－ΔΔCt法。

六、統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件包進行統(tǒng)計學(xué)分析。組間miR-520g的比較用Mann-Whitney U檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。miR-520g在各組的表達(dá)量用箱圖來表示。

結(jié) 果

一、正常妊娠組孕早、中、晚期血清miR-520g表達(dá)量的變化

在正常妊娠組，血清miR-520g的表達(dá)量隨著孕程進展有逐步升高的趨勢，見圖1，孕中期(孕20～24周)、孕晚期(孕28～32周)的 miR-520g表達(dá)量顯著高于孕早期(孕12～14周)，孕晚期miR-520g表達(dá)量高于孕中期，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)。

圖1 正常妊娠組不同孕周血清miR-520g表達(dá)量

二、PE患者早、中、晚期血清miR-520g表達(dá)量

PE患者孕早期miR-520g表達(dá)量顯著高于正常妊娠照組，而孕中期和孕晚期miR-520g的表達(dá)量在兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見圖 2。

圖2 PE患者與正常妊娠者不同孕周血清miR-520g相對表達(dá)量的比較

討 論

miR是一類全長為19～25個核糖核苷酸的非編碼調(diào)控單鏈小分子RNA，由一段具有發(fā)卡環(huán)結(jié)構(gòu)的單鏈RNA前體剪切后生成，通過與目標(biāo)mRNA分子的3'-端非編碼區(qū)域(3'-UTR)互補配對使目標(biāo)mRNA分子的翻譯受到抑制，從而在轉(zhuǎn)錄后對靶基因的表達(dá)水平進行調(diào)控。生物信息分析顯示只占了人類基因組1%～3%的miR調(diào)控著高達(dá)30%的人類基因。在不同組織及不同發(fā)育階段，不同miR的表達(dá)水平有顯著差異。近年的研究表明miR在細(xì)胞增殖、分化、凋亡，腫瘤形成，心血管疾病等生理和病理過程中都有非常重要的作用[4]。自 2008年MITCHELL等[5]在人血清/血漿中穩(wěn)定檢測到腫瘤來源的miR以來，循環(huán)miR作為生物標(biāo)記物受到越來越多的關(guān)注。

PE是一種常見的妊娠相關(guān)疾病，是孕婦和胎兒發(fā)病率和病死率最高的疾病之一[1]。主要表現(xiàn)為在懷孕20周后出現(xiàn)高血壓和蛋白尿，部分患者出現(xiàn)水腫、頭痛，嚴(yán)重者發(fā)生子癇、肝腎功能和凝血障礙、成人呼吸窘迫綜合征和胎兒發(fā)育障礙等，發(fā)生過子癇的孕婦其后患高血壓、心血管疾病的風(fēng)險也大大增加。胎兒分娩和胎盤剝離是目前唯一的治愈手段，但早期對高危孕婦進行干預(yù)，對減少子癇的發(fā)生及減輕其危害具有一定價值。血清可溶性血管內(nèi)皮生長因子受體1(soluble vascular endothelial growth factor receptor-1，sFlt-1)、胎盤生長因子(placental growth factor，PLGF)水平等可能在PE的預(yù)測中有一定價值[6]，但目前尚無有效、可靠和經(jīng)濟的預(yù)測方法。近年來多項研究指出PE胎盤中存在異常表達(dá)的miR，如 miR-210、miR-1、miR-181a、miR-584 等，這些異常表達(dá)的miR可能通過調(diào)節(jié)相應(yīng)的靶基因，調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移和血管的重塑，從而在PE的病理過程中發(fā)揮重要作用[7-9]。這些在胎盤中異常表達(dá)的miR部分被證實在血清/血漿中也有異常表達(dá)[10]，但胎盤和循環(huán) miR的結(jié)果并不總是一致，有時甚至相反，不同的妊娠時期血清中的miR也處于動態(tài)變化中，本研究結(jié)果也顯示miR-520g表達(dá)量在正常妊娠過程中隨孕周逐步升高。

在PE胎盤異常表達(dá)的miR中有一類胎盤特異性miR，他們在胎盤以外的其它組織中表達(dá)很少甚至沒有，而在胎盤中表達(dá)豐度較高。胎盤特異性 miR多來自 19號染色體，如 miR-517a、519d、520g、520h 等[2]。由于不受其它組織疾病的影響，胎盤特異性miR表達(dá)譜可能在妊娠相關(guān)疾病的預(yù)測、診斷中有重要價值。本研究檢測了30例單胎妊娠的健康孕婦不同孕期血清中miR-520g的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)循環(huán)miR-520g在正常妊娠組的表達(dá)量隨孕周逐步上升，這可能與胎盤組織的逐漸增大相關(guān)，與HROMADNIKOVA等[11]報道的關(guān)于miR-516、miR-517等胎盤特異性miR的結(jié)果一致。我們進一步檢測了30例單胎妊娠的PE患者不同孕期血清miR-520g的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)PE患者孕早期的miR-520g表達(dá)量異常上調(diào)，而孕中、晚期的miR-520g表達(dá)量與正常妊娠組無明顯差異，這可能與孕早期胎盤螺旋動脈重塑過程有關(guān)。胎盤淺著床和子宮螺旋動脈重塑不良被認(rèn)為是PE發(fā)生的重要病理機制，螺旋動脈重塑主要發(fā)生在孕12～20周。生物信息分析發(fā)現(xiàn)胎盤特異性 miR-520g的靶基因中有 ephrin b2(EFNB2)及其受體ephrin receptor b4(EPHB4)，而EFNB2/EPHB4被認(rèn)為在血管形成、胎盤發(fā)育及螺旋動脈重塑過程中都具有重要作用[12]，但miR-520g與EFNB2/EPHB4的關(guān)系有待進一步實驗來證實。

本研究首次報道了正常妊娠及PE患者不同孕期血清胎盤特異性miR-520g的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)孕早期miR-520g可能對PE的早期預(yù)測有一定的價值。miR-520g如何參與PE的發(fā)生和發(fā)展、血清miR-520g表達(dá)量與PE嚴(yán)重程度的相關(guān)性等值得更深入的研究來進一步論證，這將有助于PE病理機制的闡明和防治。

[1]YOUNG BC，LEVINE RJ，KARUMANCHI SA.Pathogenesis of preeclampsia[J].Annu Rev Pathol，2010，5:173-192.

[2]LIANG Y，RIDZON D，WONG L，etal.Characterization of microRNA expression profiles in normal human tissues[J].BMC Genomics，2007，8:166.

[3]樂杰.婦產(chǎn)科學(xué)[M].7版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2009:92-101.

[4]BARTEL DP.MicroRNAs:genomics，biogenesis，mechanism，and function [J].Cell，2004，116(2):281-297.

[5]MITCHELL PS，PARKIN RK，KROH EM，et al.Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection[J].Proc Natl Acad Sci USA，2008，105(30):10513-10518.

[6]袁小松，張一鳴，蔣雅琴，等.血清可溶性血管內(nèi)皮生長因子受體1/胎盤生長因子比值作為預(yù)測子癇前期患病風(fēng)險的價值[J].檢驗醫(yī)學(xué)，2010，25(10):784-786.

[7]PINELES BL，ROMERO R，MONTENEGRO D，et al.Distinct subsets of microRNAs are expressed differentially in the human placentas of patients with preeclampsia[J].Am J Obstet Gynecol，2007，196(3):261.e1-261.e6.

[8]ZHU XM，HAN T，SARGENT IL，et al.Differential expression profile of microRNAs in human placentas from preeclamptic pregnancies vs normal pregnancies[J].Am J Obstet Gynecol，2009，200(6):661.e1-661.e7.

[9]ENQUOBAHRIE DA，ABETEW DF，SORENSEN TK，etal. PlacentalmicroRNA expression in pregnancies complicated by preeclampsia[J].Am J Obstet Gynecol，2011，204(2):178.e12-178.e21.

[10]YANG Q，LU J，WANG S，et al.Application of next-generation sequencing technology to profile the circulating microRNAs in the serum of preeclampsia versus normal pregnant women[J].Clin Chim Acta，2011，412(23-24):2167-2173.

[11]HROMADNIKOVA I，KOTLABOVA K，DOUCHA J，et al. Absolute and relative quantification of placenta-specific micrornas in maternal circulation with placental insufficiency-related complications[J].J Mol Diagn，2012，14(2):160-167.

[12]MOSCH B，REISSENWEBER B，NEUBER C，et al.Eph receptors and ephrin ligands:important players in angiogenesis and tumor angiogenesis [J].J Oncol，2010，2010:135285.