高 瑞，袁 文，王新偉，楊立利，陳華江

·基礎(chǔ)研究·

綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在急性脊髓損傷大鼠中的遷移和分化

高 瑞，袁 文，王新偉，楊立利，陳華江

目的 觀察綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因大鼠來源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bonemesenchymal stem cells，BMSCs）在急性脊髓損傷大鼠脊髓組織中的遷移和分化情況。方法全骨髓貝壁培養(yǎng)法培養(yǎng)BMSCs，Allen法制作脊髓損傷大鼠模型，共30只大鼠。于造模1周后進行干預(yù)，隨機選取造模成功的24只大鼠并隨機分為脊髓損傷組、假移植組（生理鹽水注射）和細(xì)胞移植組（BMSCs注射），每組8只。于移植前、移植后7 d、14 d、21 d、28 d、35 d及42 d進行BBB（Basso，Beattie＆amp；Bresnahan locomotor rating scale）評分。HE染色、免疫熒光觀察脊髓損傷的組織修復(fù)和BMSCs的遷移分化情況。結(jié)果從第14天始，細(xì)胞移植組大鼠的BBB評分較脊髓損傷組和假移植組大鼠高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。HE染色顯示細(xì)胞移植組大鼠的脊髓結(jié)構(gòu)相對完整，液化和囊泡區(qū)縮小，炎性細(xì)胞減少。免疫熒光顯示BMSCs聚集于脊髓損傷處，且能分化為神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)前體細(xì)胞。結(jié)論BMSCs能向脊髓損傷部位遷移和聚集，并分化為相應(yīng)的神經(jīng)細(xì)胞促進脊髓功能恢復(fù)。

大鼠；綠色熒光蛋白質(zhì)類；骨髓；間質(zhì)干細(xì)胞；脊髓損傷；細(xì)胞運動；細(xì)胞分化

JSpinal Surg，2015，13（5）：299-302

脊髓損傷是目前脊柱外科治療的難點之一，隨著人們對脊髓損傷發(fā)生機制研究的不斷深入，細(xì)胞移植治療脊髓損傷逐漸成為可能［1］。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）具有自我更新和多向分化的特性，因其來源廣泛、擴增簡單及低免疫原性等優(yōu)點，已被廣泛應(yīng)用于再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域［2］。但實驗中常需預(yù)先對BMSCs進行標(biāo)記，以便對其移植后在體內(nèi)的遷移和分化進行示蹤研究。常規(guī)的體外細(xì)胞熒光標(biāo)記穩(wěn)定性較差，為此，本研究采用綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）轉(zhuǎn)基因大鼠的BMSCs治療急性脊髓損傷大鼠，觀察BMSCs在受損脊髓內(nèi)的遷移和分化情況。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及試劑

GFP轉(zhuǎn)基因大鼠5只，體重約150 g，無特定病原體級；SD大鼠30只，體重約300 g，無特定病原體級（第二軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心）。動物實驗經(jīng)第二軍醫(yī)大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，符合實驗動物福利的相關(guān)要求。

含10％胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)液（Gibco公司，美國）；1∶500 Tuj-1（微管蛋白β3，Invitrogen公司，美國）；1∶400膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP；Invitrogen公司，美國）；1∶400巢蛋白（Pharmingen公司，美國）；1∶1000 CY3山羊抗小鼠紅色熒光二抗（Invitrogen公司，美國）；1∶20000 Hoechst熒光染料33258（Sigma公司，美國）。

1.2 BMSCs的分離和培養(yǎng)

采用全骨髓貝壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)BMSCs，GFP轉(zhuǎn)基因大鼠麻醉后無菌條件下分離雙側(cè)股骨，剪掉骨髓端，注射器抽取骨髓至髓腔發(fā)白。將骨髓細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，800 r/min離心5 min（離心半徑為15 cm），棄上清，加入80 mL含10％胎牛血清的DMEM/F-12培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至90％融合時進行傳代，每周傳代1次，收獲傳代培養(yǎng)的第三代細(xì)胞。

1.3 脊髓損傷大鼠模型的制作

將體重300 g的無特定病原體級SD大鼠用1％的戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉后，俯臥位固定。備皮消毒后，背部正中切口，約3 cm，暴露T8～11棘突及兩側(cè)椎板。剪刀在T9，10雙側(cè)椎板做縱形切口，咬骨鉗去除T9，10棘突及椎板，暴露T9，10脊髓。用改良Allen法制作脊髓損傷大鼠模型，采用10 g的重量自25 mm高度自由落下［3］。觀察到大鼠雙下肢呈遲緩性癱瘓、尾巴痙攣性擺動后，常規(guī)縫合。造模后每日2次擠壓膀朧排尿，阿莫西林（500 mg/L）喂食1周預(yù)防感染。

1.4 實驗動物分組及BMSCs移植

30只SD大鼠進行脊髓損傷造模，共28只大鼠造模成功。于造模1周后隨機選取其中24只，并隨機分為脊髓損傷組、假移植組（生理鹽水注射）和細(xì)胞移植組（BMSCs注射），每組8只。BMSCs移植和生理鹽水注射于造模1周后實施，實施前對所有的大鼠進行BBB（Basso，Beattie＆amp；Bresnahan locomotor rating scale）評分［4］。1％的戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉后，暴露T9，10脊髓，將5μL PBS緩沖液加入5×105的BMSCs進行稀釋，分別用微量注射器在損傷區(qū)頭尾兩端各2 mm處進行注射，注射的劑量各為2.5μL，注射的速度為1μL/min。然后用1μL PBS將針頭中剩余的細(xì)胞繼續(xù)推注完畢，注射完畢后針頭在脊髓組織里停留2 min，以防止細(xì)胞從注射點滲出。假移植組采用相同劑量的生理鹽水于脊髓損傷處頭尾兩端2 mm處進行注射。上述過程操作完畢后，縫合傷口，每日2次膀朧擠壓排尿，阿莫西林（500 mg/L）喂食1周預(yù)防感染。

1.4 BBB評分及病理檢測

于移植前、移植后7 d，14 d，21 d，28 d，35 d及42 d將大鼠放入空曠可以自由活動的場所，BBB評分進行觀察，由2名操作者獨立進行實施，計算均值。

移植后42 d處死大鼠，取出脊髓病理，取材自損傷中心向頭尾兩端各延長1 cm（≥2 cm脊髓組織）。4％多聚甲醛固定，石蠟包埋后，連續(xù)橫斷面50μm切片，每只大鼠切片3～5張。取部分切片HE染色，另取部分切片行免疫熒光檢測。一抗包括1∶500的Tuj-1，1∶400的GFAP和1∶400的巢蛋白。二抗為1∶1 000的CY3山羊抗小鼠紅色熒光二抗。再用1∶20 000的Hoechst熒光染料33258染色30 min標(biāo)記細(xì)胞核。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 16.0軟件對數(shù)據(jù)進行處理，所得數(shù)據(jù)用ˉx±s進行表示。3組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 BBB評分

實驗過程中無大鼠死亡，移植前3組大鼠的BBB評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），在實施干預(yù)后7 d，各組的評分差異仍無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。從第14天始，細(xì)胞移植組BBB評分明顯較脊髓損傷組和假移植組高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。而各時間點脊髓損傷組和假手術(shù)組的BBB評分差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。3組大鼠各時間點BBB評分詳見表1。

表1 3組大鼠BBB評分的比較Tab.1 BBB scale results of 3 groups

2.2 HE染色

病理切片HE染色顯示，脊髓損傷組及假手術(shù)組鏡下表現(xiàn)類似，大鼠的脊髓損傷部位可見組織結(jié)構(gòu)受到破壞、液化和囊泡區(qū)形成、炎性細(xì)胞浸潤（見圖1a）。而細(xì)胞移植組大鼠脊髓損傷部位可見細(xì)胞排列相對緊密，脊髓結(jié)構(gòu)相對完整，液化和囊泡區(qū)縮小，炎性細(xì)胞減少（見圖1b）。

2.3 免疫熒光染色

免疫熒光顯示，GFP標(biāo)記的BMSCs聚集于脊髓損傷處，且沿?fù)p傷區(qū)分布，證實移植的BMSCs能向損傷區(qū)募集和遷移（見圖2a）。當(dāng)和紅色熒光標(biāo)記的Tuj-1共定位后顯示GFP標(biāo)記的BMSCs在體內(nèi)能向神經(jīng)元分化（見圖2b）。當(dāng)和紅色熒光標(biāo)記的GFAP共定位后顯示GFP標(biāo)記的BMSCs在體內(nèi)能向神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞分化（見圖2c）。同樣，和紅色熒光標(biāo)記的巢蛋白共定位后顯示GFP標(biāo)記的BMSCs在體內(nèi)能向神經(jīng)前體細(xì)胞分化（見圖2d）。

圖1 大鼠脊髓病理HE染色Fig.1 HE-stained sections

圖2 免疫熒光染色Fig.2 Immunofluorescent staining

3 討 論

脊髓損傷后急性期脊髓出現(xiàn)水腫、缺血、出血，產(chǎn)生氧自由基、脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、細(xì)胞毒性反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、脫髓鞘和神經(jīng)細(xì)胞壞死等。亞急性期會出現(xiàn)巨噬細(xì)胞浸潤、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞激活，癱痕形成和神經(jīng)血管化。慢性期會出現(xiàn)神經(jīng)元變性、凋亡，癱痕形成和空泡形成［5］。了解上述脊髓損傷后病理變化對其治療至關(guān)重要，為了達(dá)到更好的治療效果，移植的細(xì)胞必須能抑制損傷區(qū)的炎癥反應(yīng)、阻止神經(jīng)細(xì)胞的壞死。更重要的是能促進神經(jīng)元的再生和軸突的延伸［6］。目前BMSCs促進神經(jīng)功能恢復(fù)可能通過以下幾方面起作用：分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子增強神經(jīng)細(xì)胞的再生能力，提供支架或底物引導(dǎo)軸突再生，分化為神經(jīng)細(xì)胞替換壞死的細(xì)胞［7］。有學(xué)者認(rèn)為移植的BMSCs發(fā)揮的脊髓保護功能主要是通過分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子這種間接的途徑來實現(xiàn)的，因為很難對移植BMSCs進行在體跟蹤和功能評價［8］。

由于缺乏特異性的免疫組化標(biāo)記，干細(xì)胞移植治療脊髓損傷的免疫組化共定位難以實施。目前較多的是通過免疫熒光共定位來在體跟蹤移植的干細(xì)胞［9］。體外最有代表性的標(biāo)記方法是5-溴脫氧尿嘧陡核苷（5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU），但其缺點是隨著時間的延長會出現(xiàn)標(biāo)記強度減弱或標(biāo)記丟失，出現(xiàn)靈敏度下降。而當(dāng)采用基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞時，存在操作復(fù)雜和無法保證高轉(zhuǎn)染率的問題［10］。所以，本研究采用來源于GFP大鼠的干細(xì)胞，其優(yōu)點是能永久性穩(wěn)定的表達(dá)GFP，且不產(chǎn)生GFP進入其他組織細(xì)胞，更有利于長期觀察干細(xì)胞在體內(nèi)的遷移和分化。

本研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs移植治療可以阻止脊髓損傷加重，HE染色發(fā)現(xiàn)存活的神經(jīng)細(xì)胞增多，壞死和囊泡區(qū)縮小。低倍鏡下免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)移植的干細(xì)胞能較好地遷移和聚集于脊髓損傷部位。在移植2周以后，細(xì)胞移植組大鼠的BBB評分優(yōu)于脊髓損傷組和假移植組，提示干細(xì)胞移植能有效促進脊髓神經(jīng)功能的恢復(fù)。免疫熒光共定位證實移植的BMSCs能在損傷區(qū)分化為神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)前體細(xì)胞。本研究中還觀察到分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的比例要明顯高于神經(jīng)前體細(xì)胞，這可能是因為神經(jīng)前體細(xì)胞是一種中間狀態(tài)的細(xì)胞。通過免疫熒光還發(fā)現(xiàn)，囊泡區(qū)并無BMSCs的聚集和填充，表明BMSCs在囊泡區(qū)無法有效存活，證實脊髓損傷后損傷區(qū)的微環(huán)境對移植細(xì)胞的存活有很大影響。

國內(nèi)外也有相類似的研究。Ozdemir等［11］用BMSCs治療脊髓損傷的小鼠，采用GFP聯(lián)合熒光素酶對移植的BMSCs進行體內(nèi)追蹤，發(fā)現(xiàn)脊髓組織中GFP聯(lián)合熒光素酶的細(xì)胞可以表達(dá)巢蛋白及微管相關(guān)蛋白，提示移植的BMSCs參與了脊髓損傷后的神經(jīng)細(xì)胞再生。Yin等［12］采用BMSCs治療大鼠脊髓損傷，發(fā)現(xiàn)BMSCs移植后其軸突再生的標(biāo)記物GAP-43 和MAP-2顯著上調(diào)，同時細(xì)胞自噬的標(biāo)記物MAP1-LC3B和Beclin 1則顯著下調(diào)，提示BMSCs移植能有效阻止脊髓的缺血再灌注損傷及促進神經(jīng)細(xì)胞再生。

本實驗利用GFP轉(zhuǎn)基因大鼠的BMSCs，進行體內(nèi)示蹤和免疫熒光共定位，揭示了外源性的BMSCs能有效聚集于脊髓損傷部位并分化為相應(yīng)的神經(jīng)細(xì)胞，為BMSCs治療脊髓損傷提供了形態(tài)學(xué)證據(jù)。但還需進一步研究確定BMSCs向各種神經(jīng)細(xì)胞分化的比例以及如何更有效的幫助BMSCs穿越脊髓損傷區(qū)和正常神經(jīng)元形成有效的突觸聯(lián)接。

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M igration and differentiation of bone mesenchymal stem cells from green fluorescent protein transgenic rats w ith spinal cord injury

GAO Rui，YUAN Wen，WANG Xin-wei，YANG Li-li，CHEN Hua-jiang.Department of spine surgery，Changzheng Hospital，Second Military Medical University，Shanghai200003，China

Objective To investigatemigration and differentiation of bone mesenchymal stem cells（BMSCs）from green fluorescent protein（GFP）transgenic rats with spinal cord injury.MethodsBMSCs were harvested by whole bone marrow adherent culturemethod，and spinal cord injury model was established by Allen'smethod in 30 rats.One week after model building，24 rats were randomly divided into 3 groups：the spinal cord injury group，sham group and BMSCs group.Basso，Beattie＆amp；Bresnahan locomotor rating scale（BBB）scalewas evaluated before intervention，7 d，14 d，21 d，28 d，35 d，and 42 d after intervention.The injured spinal cords were obtained at 42 d for pathology test.ResultsBBB scale in BMSCs group was higher than spinal cord injury group and sham group from 14 d after the intervention.HE stain also showed smaller liquify area and less vesicles.Immunofluorescence showed the transplanted BMSCs can migrate to the injury area，and can differentiate into neuron，glia cells and neural progenitor cells.ConclusionBMSCs can migrate to the injury area in spinal cord injury，and differentiate into nerve cells to promote spinal cord repairing.

Rats；Green fluorescent proteins；Bone marrow；Mesenchymal stem cells；Spinal cord injuries；Cell movement；Cell differentiation

R329.28

A

1672-2957（2015）05-0299-04

】

10.3969/j.issn.1672-2957.2015.05.010

2014-06-06）

（本文編輯 張建芬）

上海市自然科學(xué)基金項目（12ZR1454500）

高瑞（1984—），博士，主治醫(yī)師

200003上海，第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長征醫(yī)院骨科

袁文 yuanwenspine@163.com