牛坤，胡逸博，毛健，鄒樹(shù)平，鄭裕國(guó)

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微粒添加對(duì)棘白菌素B發(fā)酵過(guò)程的影響

牛坤，胡逸博，毛健，鄒樹(shù)平，鄭裕國(guó)

浙江工業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江 杭州 310014

牛坤, 胡逸博, 毛健, 等. 微粒添加對(duì)棘白菌素B發(fā)酵過(guò)程的影響. 生物工程學(xué)報(bào), 2015, 31(7): 1082–1088.Niu K, Hu YB, Mao J, et al. Effect of microparticles on echinocandin B production by Aspergillus nidulans. Chin J Biotech, 2015, 31(7): 1082–1088.

阿尼芬凈是一種新型的抗真菌藥物，能夠抑制各種致病念珠菌在活體內(nèi)外的活性。棘白菌素B (Echinocandin B，ECB) 是合成阿尼芬凈的關(guān)鍵前體，其發(fā)酵單位的高低直接關(guān)系到阿尼芬凈的價(jià)格及市場(chǎng)前景。文中考察了構(gòu)巢曲霉在搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)ECB的過(guò)程中，添加滑石粉、Al2O3、玻璃珠等微粒對(duì)其發(fā)酵單位的影響。發(fā)現(xiàn)微粒的粒徑和添加濃度是菌體形態(tài)和ECB產(chǎn)量的關(guān)鍵影響因素，添加20 g/L滑石粉(d50= 14.2 μm) 和7顆玻璃珠 (d = 6 mm) 可使ECB發(fā)酵產(chǎn)量分別比對(duì)照提高33.2%和41.7%，達(dá)到1 262.9 mg/L和1 344.1 mg/L。結(jié)果表明微粒的添加可以顯著地改善絲狀微生物發(fā)酵過(guò)程中的菌絲形態(tài)，提高其產(chǎn)物的發(fā)酵產(chǎn)量，為絲狀微生物發(fā)酵過(guò)程的優(yōu)化提供了一種重要手段。

棘白菌素B，構(gòu)巢曲霉，微粒，發(fā)酵

棘白菌素類(lèi)抗生素是20世紀(jì)70年代發(fā)現(xiàn)的一組天然產(chǎn)物，具有類(lèi)似的環(huán)狀多肽核心和不同的脂肪酸側(cè)鏈，能夠非競(jìng)爭(zhēng)性地抑制真菌細(xì)胞壁β-1,3-葡聚糖合成酶的活性，從而達(dá)到抗真菌的目的[1-3]。FDA已批準(zhǔn)上市的這類(lèi)藥物包括卡泊芬凈(Caspofungin)、米卡芬凈 (Micafungin) 和阿尼芬凈 (Anidulafungin)，其中前兩者已在國(guó)內(nèi)上市，阿尼芬凈已在國(guó)內(nèi)臨床中[4-6]。

阿尼芬凈是由前體化合物棘白菌素B (Echinocandin B，ECB) 經(jīng)猶他游動(dòng)放線(xiàn)菌產(chǎn)生的?；缸饔妹撊?cè)鏈亞油?；缓笤贒MF中與活性中間體4"-戊氧基-[1,1',4',1"]三苯基-4-甲酸-2,4,5-三氯-苯基酯反應(yīng)制得，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1A所示[7]。目前，ECB的化學(xué)結(jié)構(gòu)已經(jīng)確定，它的六肽支架是由6個(gè)氨基酸組成，包括：4R,5R-二羥基-L-鳥(niǎo)氨酸、L-蘇氨酸、4R-羥基-L-脯氨酸、3S,4S-二羥基-L-高酪氨酸、L-蘇氨酸和3S-羥基-4S-甲基-L-脯氨酸 (圖1B)[8]。

ECB是合成阿尼芬凈的關(guān)鍵前體化合物，其發(fā)酵單位的高低將直接影響阿尼芬凈的市場(chǎng)前景。根據(jù)文獻(xiàn)和專(zhuān)利報(bào)道，目前國(guó)內(nèi)外ECB均是利用微生物發(fā)酵法進(jìn)行制備，其中主要是以構(gòu)巢曲霉進(jìn)行發(fā)酵[9-12]。但是在該類(lèi)微生物發(fā)酵過(guò)程中會(huì)碰到一些難以克服的技術(shù)問(wèn)題，如發(fā)酵液粘度高、供氧不足以及傳質(zhì)受阻等，這些問(wèn)題都會(huì)導(dǎo)致菌種代謝合成產(chǎn)物的能力下降，因此ECB的發(fā)酵仍然處于實(shí)驗(yàn)室研究階段。要解決上述問(wèn)題，常用的方法有菌種誘變、培養(yǎng)基優(yōu)化、氣升式發(fā)酵罐培養(yǎng)、細(xì)胞固定化以及工藝操作條件調(diào)控 等[13-15]。近年來(lái)，研究學(xué)者提出了通過(guò)添加無(wú)機(jī)微粒來(lái)改變絲狀微生物菌體形態(tài)的新技術(shù)，發(fā)現(xiàn)無(wú)機(jī)微粒的應(yīng)用可以顯著影響絲狀微生物生長(zhǎng)過(guò)程中的菌體形態(tài)，并進(jìn)一步影響產(chǎn)物產(chǎn)量及酶的活性，目前應(yīng)用比較廣泛的無(wú)機(jī)微粒包括硅酸鹽、鈦酸鹽、滑石粉、Al2O3等[16-20]。

圖1 阿尼芬凈(A) 和ECB (B) 的化學(xué)結(jié)構(gòu)式[7-8]

本文以構(gòu)巢曲霉發(fā)酵合成ECB，希望通過(guò)添加不同種類(lèi)及不同濃度的微粒來(lái)改善菌體生長(zhǎng)形態(tài)，調(diào)控培養(yǎng)過(guò)程中的傳質(zhì)過(guò)程，最終提高ECB的發(fā)酵產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 菌種

構(gòu)巢曲霉ZJB09223，由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基。

種子培養(yǎng)基 (g/L)：葡萄糖10，甘油10，棉籽粉25，pH 6.8?7.0，121 ℃滅菌20 min。

初始發(fā)酵培養(yǎng)基 (g/L)：花生油20，甘油10，蛋白胨10，L-脯氨酸1，甘露醇90，豆粕粉40，K2HPO4?3H2O 8，MgSO4?7H2O 0.5，MnSO4?H2O 0.1，F(xiàn)eSO4?7H2O 0.05，CaCl20.3，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

1.3 主要儀器與設(shè)備

恒溫調(diào)速搖床 (上海杜科自動(dòng)化設(shè)備有限公司 DKY-1)；高效液相色譜 (日本SHIMADZU)；高壓蒸汽滅菌鍋 (日本SANYO，MLS-3780)；電子分析天平 (上海精密儀器儀表有限公司FA2004)；高速冷凍離心機(jī) (美國(guó)Bechman Coulter，X-22)；光學(xué)顯微鏡 (美國(guó)leica，DM3000)。

1.4 培養(yǎng)方法

1.4.1 斜面培養(yǎng)

將傳好種的斜面置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8?16 d，菌落表面呈現(xiàn)墨綠色后取出置于15?20 ℃繼續(xù)培養(yǎng)，一般5?20 d都可接種用于種子培養(yǎng)。

1.4.2 種子液培養(yǎng)

接種后的種子培養(yǎng)基在220 r/min、25 ℃條件下培養(yǎng)2 d。

1.4.3 發(fā)酵培養(yǎng)

按照10%接種量進(jìn)行接種，然后將接種后發(fā)酵培養(yǎng)基在220 r/min、25 ℃條件下培養(yǎng)12 d，第6天起定時(shí)取樣測(cè)定ECB產(chǎn)量。每個(gè)條件做3個(gè)平行樣，最終結(jié)果取平均值。

1.5 分析方法

生物量 (g/L) 的測(cè)定：采用稱(chēng)重法，取1 mL發(fā)酵液12 000 r/min離心10 min，棄上清，放入90 ℃烘箱烘干至恒重，計(jì)算得到生物量。

待測(cè)樣品預(yù)處理：取1 mL發(fā)酵液 12 000 r/mim離心8 min，棄上清；所得菌體加入1 mL甲醇，25 ℃振蕩萃取30 min， 12 000 r/min離心8 min，留上清液備用；殘留菌體中再加入1 mL甲醇進(jìn)行二次萃取，25 ℃振蕩搖勻30 min，12 000 r/min離心8 min，所得上清液與前一步上清液合并，12 000 r/min離心2min，上清液用0.45μm水膜過(guò)濾，進(jìn)行檢測(cè)。

產(chǎn)物的測(cè)定：產(chǎn)物ECB采用高效液相色譜(HPLC) 進(jìn)行檢測(cè)，色譜柱為ODS-C18柱 (大連伊力特4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈：甲醇：水 = 2：7：1，流速為1.0 mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為222 nm，進(jìn)樣量20 μL，柱溫40 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 微粒種類(lèi)對(duì)ECB發(fā)酵過(guò)程的影響

本實(shí)驗(yàn)選用了文獻(xiàn)報(bào)道較多的滑石粉、Al2O3以及玻璃珠作為無(wú)機(jī)微粒，考察了其對(duì)ECB發(fā)酵過(guò)程的影響。在發(fā)酵過(guò)程中，由于培養(yǎng)基中含有可作為微粒的豆粕粉 (d50= 8.8 μm)，為了消除其對(duì)結(jié)果的影響，本實(shí)驗(yàn)首先比較了采用蒸煮過(guò)濾后的豆粕粉濾液作為有機(jī)氮源與未過(guò)濾的豆粕粉培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵的結(jié)果 (圖2)，發(fā)現(xiàn)采用蒸煮過(guò)后的豆粕粉濾液作為氮源發(fā)酵時(shí)，其產(chǎn)量由原來(lái)的1 025.6 mg/L降為935.9 mg/L，下降了近10%，而下降的原因可能是由于氮源的損失造成的，也可能是由于作為微粒的豆粕粉顆粒被過(guò)濾除去造成的。

在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，以蒸煮過(guò)濾后的豆粕粉培養(yǎng)基作為對(duì)照，考察了在其中加入不同微粒后對(duì)發(fā)酵過(guò)程的影響。發(fā)現(xiàn)對(duì)照組菌體在發(fā)酵過(guò)程中會(huì)自我纏繞，呈較大直徑的球狀生長(zhǎng)，而添加滑石粉及玻璃珠后均可以改善發(fā)酵過(guò)程中微生物的菌絲形態(tài)，使ECB的發(fā)酵單位有所提高。當(dāng)添加20 g/L 600目(d50= 5.7 μm) 滑石粉時(shí)，ECB產(chǎn)量由935.9 mg/L提高到1 054.4 mg/L；當(dāng)加入3顆直徑為4 mm玻璃珠后，ECB產(chǎn)量提高到967.6 mg/L。而加入Al2O3后對(duì)ECB的產(chǎn)量反而有所抑制，推測(cè)可能是由于Al2O3粒徑過(guò)小 (d50= 4.7 μm) 引起的。

2.2 滑石粉粒徑及濃度對(duì)ECB發(fā)酵單位的影響

在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考察了滑石粉的粒徑及其添加濃度對(duì)ECB發(fā)酵單位的影響。圖3為添加10 g/L不同粒徑滑石粉的結(jié)果，表明當(dāng)滑石粉粒徑小于600目 (d50> 5.7 μm) 時(shí)，添加微粒可以提高ECB產(chǎn)量，而當(dāng)其粒徑大于800目 (d50< 4.6 μm) 時(shí)，ECB產(chǎn)量反而會(huì)下降，并且微粒的添加對(duì)菌體濃度影響較小。而當(dāng)添加粒徑大于800目的滑石粉時(shí)，雖然菌體濃度基本未受影響，但由于添加的粒徑較小，使得發(fā)酵過(guò)程中菌絲體包裹微粒后會(huì)在發(fā)酵液中形成致密的菌絲小球并充滿(mǎn)整個(gè)搖瓶，導(dǎo)致發(fā)酵液黏度增大，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣的傳遞效果下降，從而使產(chǎn)物ECB發(fā)酵產(chǎn)量降低，這與上述實(shí)驗(yàn)中添加Al2O3的結(jié)果是一致的。

圖2 微粒種類(lèi)對(duì)棘白菌素B發(fā)酵產(chǎn)量的影響

圖3 滑石粉粒徑對(duì)ECB發(fā)酵產(chǎn)量的影響.

表1為不同濃度的滑石粉 (325目，d50= 14.2 μm) 對(duì)ECB發(fā)酵過(guò)程的影響，發(fā)現(xiàn)ECB的產(chǎn)量隨滑石粉添加濃度的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，添加20 g/L滑石粉可以使ECB的產(chǎn)量提高33.2%至1 262.9 mg/L；而添加30 g/L 600目滑石粉 (d50= 5.7 μm) 時(shí)可以使ECB產(chǎn)量達(dá)到最高值1 144.7 mg/L (結(jié)果未列出)。由結(jié)果可知，在添加粒徑較小的微粒時(shí)，其添加濃度應(yīng)適度增加，才能達(dá)到最佳的優(yōu)化效果，而這與文獻(xiàn)中的報(bào)道是相反的，推測(cè)可能是由于發(fā)酵菌種的不同引起的[20]。

同時(shí)在培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)添加滑石粉時(shí)可以顯著改善發(fā)酵過(guò)程中菌絲體的狀態(tài)，使菌體形成以微粒為核心的菌絲團(tuán)，且培養(yǎng)基中菌絲球的直徑與對(duì)照相比明顯減小 (圖4)，從而提高了發(fā)酵液的傳質(zhì)效果和溶氧量，使ECB產(chǎn)量明顯增加。而當(dāng)添加的滑石粉濃度過(guò)高時(shí)，發(fā)酵液內(nèi)微粒與菌絲球之間相互碰撞、摩擦的幾率大大提高，因此可能會(huì)切斷菌絲體，使菌體以分散狀菌絲的形態(tài)生長(zhǎng)，增加了發(fā)酵液粘度，最終導(dǎo)致ECB發(fā)酵產(chǎn)量降低 (圖4，40 g/L)。

表1 滑石粉濃度對(duì)ECB發(fā)酵產(chǎn)量的影響

圖4 滑石粉濃度對(duì)微生物菌絲體形態(tài)的影響

2.3 玻璃珠的數(shù)目對(duì)ECB發(fā)酵單位的影響

表2為添加不同數(shù)量的玻璃珠對(duì)ECB發(fā)酵產(chǎn)量的影響，由結(jié)果可以看出添加玻璃珠也可以促使ECB發(fā)酵單位提高。當(dāng)玻璃珠直徑為 4 mm、添加個(gè)數(shù)為5顆和7顆時(shí)，發(fā)酵液中ECB含量分別為1 117.4 mg/L和1 160.9 mg/L，分別比對(duì)照組分別提高了17.7%和22.4%。當(dāng)玻璃珠直徑為6 mm、添加個(gè)數(shù)為5顆和7顆時(shí)，ECB產(chǎn)量會(huì)大幅提高，最高產(chǎn)量達(dá)到1 344.1 mg/L，比對(duì)照提高了41.7%。

觀(guān)察發(fā)酵液狀態(tài)可以看出，當(dāng)培養(yǎng)基中添加適當(dāng)濃度的玻璃珠時(shí)，玻璃珠產(chǎn)生的剪切力會(huì)切斷菌絲，使菌絲球直徑減小 (圖5B、5C)，氧氣分子和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)傳遞效果增強(qiáng)，ECB發(fā)酵產(chǎn)量提高，而當(dāng)過(guò)量添加玻璃珠時(shí) (9顆)，玻璃珠與菌絲體之間的碰撞和摩擦作用占主導(dǎo)地位，過(guò)高的剪切力會(huì)使培養(yǎng)基發(fā)生剪切稀化現(xiàn)象，從而導(dǎo)致了菌絲體的斷裂，培養(yǎng)基粘度降低，ECB產(chǎn)量下降 (圖5D)。

表2 玻璃珠的添加對(duì)ECB發(fā)酵產(chǎn)量的影響

圖5 玻璃珠(d = 4 mm)數(shù)量對(duì)微生物菌絲體形態(tài)的影響

3 討論

目前，ECB主要通過(guò)曲霉菌屬發(fā)酵法制備，但由于絲狀微生物發(fā)酵過(guò)程中會(huì)以菌絲球或分散狀菌絲的形態(tài)生長(zhǎng)，從而導(dǎo)致發(fā)酵液粘度增加，溶氧量急劇下降，發(fā)酵水平降低。而通過(guò)添加無(wú)機(jī)微粒來(lái)改善菌體生長(zhǎng)形態(tài)，調(diào)控培養(yǎng)過(guò)程中的傳質(zhì)過(guò)程是近幾年來(lái)發(fā)展的新技術(shù)，該技術(shù)的應(yīng)用可以?xún)?yōu)化絲狀微生物的發(fā)酵過(guò)程，進(jìn)而提高關(guān)鍵酶活性及發(fā)酵產(chǎn)物的產(chǎn)量。

本文初步考察了滑石粉、Al2O3以及玻璃珠對(duì)構(gòu)巢曲霉發(fā)酵過(guò)程中ECB產(chǎn)量的影響，研究表明在搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)ECB的培養(yǎng)基中，微粒的添加可以改善發(fā)酵過(guò)程中菌絲的生長(zhǎng)形態(tài)，提高氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的傳遞效率，增加ECB的發(fā)酵產(chǎn)量。微粒的濃度和粒徑是影響該過(guò)程的主要因素，隨著微粒濃度的提高，其對(duì)菌絲體產(chǎn)生的剪切力也不斷提高，使菌絲球直徑減小，氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的傳遞效果得以改善；而當(dāng)剪切力過(guò)高時(shí)，會(huì)使菌絲體大量斷裂，微生物的生長(zhǎng)形態(tài)由菌絲球狀變?yōu)榉稚罹z，同時(shí)ECB產(chǎn)量降低。研究表明微粒的粒徑對(duì)ECB的發(fā)酵產(chǎn)量也有較大影響，添加適當(dāng)粒徑的微粒可以使菌體包裹微粒形成粒徑較小的菌絲球，提高傳質(zhì)效果；而粒徑過(guò)小則無(wú)法產(chǎn)生此作用。因此，在實(shí)際發(fā)酵過(guò)程中應(yīng)根據(jù)不同的發(fā)酵菌株選擇不同的微粒濃度及粒徑，以提高發(fā)酵效果。該技術(shù)的應(yīng)用為絲狀微生物發(fā)酵過(guò)程的優(yōu)化提供了一定的思路與借鑒，為解決絲狀微生物發(fā)酵過(guò)程遇到的高粘度、低溶氧等問(wèn)題提供了重要的方法，然而現(xiàn)今主要研究工作多集中于國(guó)外，國(guó)內(nèi)對(duì)此研究尚無(wú)報(bào)道，后續(xù)還需要在新型微粒發(fā)掘、影響機(jī)制考察等方面開(kāi)展進(jìn)一步的研究工作。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Effect of microparticles on echinocandin B production by

Kun Niu, Yibo Hu, Jian Mao, Shuping Zou, and Yuguo Zheng

,,310014,,

Anidulafungin is an effective antifungal medicine, which can inhibit activities of candidaand. Echinocandin B (ECB) is the key precursor of Anidulafungin, thus the price and market prospect of Anidulafungin is directly due to the fermentation titer of ECB. In this study,was used for ECB fermentation, and the influence of adding microparticles on ECB fermentation was studied, such as talcum powder, Al2O3, and glass beads. The particle size and concentration were the key factors for mycelium morphology and ECB production, and ECB production could reach 1 262.9 mg/L and 1 344.1 mg/L by adding talcum powder of 20 g/L (d50= 14.2 μm) and 7 glass beads (6 mm), an increase by 33.2% and 41.7%, respectively. The results indicated that the mycelium morphology of filamentous microorganisms and the product yield of fermentation could be improved by adding microparticles remarkably, and it provide an important method for the fermentative optimization of filamentous microorganisms.

Echinocandin B,, microparticles, fermentation

Novemeber 24, 2014;

January 4, 2015

National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2011CB710800).

Yuguo Zheng. Tel/Fax: +86-571-88320630; E-mail: zhengyg@zjut.edu.cn

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃 (973計(jì)劃) (No.2011CB710800) 資助。