唐宇，李麗莎,2，林峻,2

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TALENs技術(shù)的研究進(jìn)展及其應(yīng)用前景

唐宇1，李麗莎1,2，林峻1,2

1 福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建 福州 350108 2 福州大學(xué)應(yīng)用基因組學(xué)研究所，福建 福州 350108

唐宇, 李麗莎, 林峻. TALENs技術(shù)的研究進(jìn)展及其應(yīng)用前景. 生物工程學(xué)報(bào), 2015, 31(7): 1024–1038.Tang Y, Li LS, Lin J. Advances in transcription activator-like effectors - a review. Chin J Biotech, 2015, 31(7): 1024–1038.

轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶 (Transcription activator-like effector nucleases, TALENs)，是一種將最初發(fā)現(xiàn)于植物病原菌的TALEs蛋白 (Transcription activator-like effectors, TALEs) 同限制性核酸內(nèi)切酶的切割結(jié)構(gòu)域 (例如Ⅰ) 融合而成的人工酶。TALENs的特異性取決于數(shù)量可變的串聯(lián)重復(fù)單元，這也是TALEs特異性識(shí)別DNA的功能結(jié)構(gòu)單元。理論上，人工構(gòu)建的TALENs可以特異性識(shí)別任意DNA位點(diǎn)并使之?dāng)嗔?，進(jìn)行基因敲除、插入或修飾。TALENs技術(shù)發(fā)展至今已經(jīng)在多層次、多物種中獲得成功。本文總結(jié)了TALENs技術(shù)的研究進(jìn)展，及其與ZFNs、CRISPR/Cas等技術(shù)相較的優(yōu)劣之處。TALENs在工業(yè)微生物育種領(lǐng)域具有特殊的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)，其載體構(gòu)建便利、靶向精準(zhǔn)、編輯效率高，以及擁有良好的生物安全性，具備推廣應(yīng)用的前景。

轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶，基因組編輯，工業(yè)微生物

基因組的定點(diǎn)修飾，即針對(duì)性地對(duì)遺傳信息進(jìn)行改造，包括三種基本形式：敲除、插入和替換。實(shí)際上，“替換”過(guò)程也可以理解為先“敲除”內(nèi)源序列，再于同一位點(diǎn)上“插入”外源序列。發(fā)展自上世紀(jì)80年代的經(jīng)典基因打靶技術(shù) (Gene targeting)，通過(guò)同源重組 (Homologous recombination) 解決了上述的“敲除”和“插入”難題。經(jīng)典基因打靶技術(shù)在過(guò)去的30年里為生物技術(shù)的發(fā)展作出了貢獻(xiàn)，但也存在許多不足之處，包括：命中率低，隨機(jī)插入時(shí)有發(fā)生，打靶精確度有待提高；陽(yáng)性克隆篩選、驗(yàn)證工作量巨大、效率較低；打靶載體的設(shè)計(jì)和構(gòu)建較為繁瑣。

隨著全基因組測(cè)序技術(shù) (Whole-genome sequencing) 的發(fā)展以及個(gè)體化醫(yī)療需求的擴(kuò)大，在獲取海量基因信息的同時(shí)，如何分析并對(duì)這些信息加以利用，開(kāi)始成為基因組研究中亟待解決的重要課題。無(wú)論是功能性基因組研究或是臨床醫(yī)學(xué)應(yīng)用，基因組編輯技術(shù)都是極為重要的組成部分。理想的基因組編輯技術(shù)應(yīng)當(dāng)具有靶標(biāo)特異性、高效且經(jīng)濟(jì)[1]。而過(guò)去常用的經(jīng)典基因打靶技術(shù)效率低下且費(fèi)用高昂[2-3]。因此，人工核酸酶技術(shù)一經(jīng)出現(xiàn)便得到迅速發(fā)展。其原理是將非特異性核酸酶與DNA識(shí)別結(jié)構(gòu)域人工連接形成融合工具酶。鋅指核酸酶 (Zinc-finger nucleases, ZFNs) 便是這樣一類(lèi)工程酶。它由兩個(gè)不同結(jié)構(gòu)域組成：鋅指結(jié)構(gòu)域 (Zinc finger)，能夠識(shí)別DNA序列并與之結(jié)合；核酸內(nèi)切酶Ⅰ酶切結(jié)構(gòu)域，可以對(duì)DNA進(jìn)行切割。ZFNs技術(shù)能顯著提高基因組編輯效率，并成功應(yīng)用于多種生物[4-12]，基于這一技術(shù)開(kāi)發(fā)的HIV治療藥物已進(jìn)入二期臨床實(shí)驗(yàn)階段[13]。2009年，隨著重復(fù)可變雙殘基(repeat variant di-residues，RVDs) 與單核苷酸對(duì)應(yīng)關(guān)系的破解，轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALENs) 的研究應(yīng)用進(jìn)入高速發(fā)展階段，并有望成為替代ZFNs成為新的主流基因組編輯工具。TALENs技術(shù)實(shí)現(xiàn)了單個(gè)蛋白質(zhì)與單核苷酸的對(duì)應(yīng)，使得模塊化定制的轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物(transcription activator-like effector, TALE) 結(jié)構(gòu)域可以同任意目標(biāo)位點(diǎn)DNA序列識(shí)別結(jié)合，因此TALENs具有比ZFNs更易設(shè)計(jì)、組裝以及擁有更高的打靶效率。目前，TALENs已在植物、斑馬魚(yú)、青蛙、蝙蝠、豬以及人類(lèi)的體細(xì)胞和多能干細(xì)胞中得到成功應(yīng)用。

近年來(lái)，基因組編輯技術(shù)得到了飛速發(fā)展，ZFNs、TALENs技術(shù)在不斷完善成熟，與此同時(shí)也有新的技術(shù)出現(xiàn)，例如成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列/CRISPR相關(guān)蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/ CRISPR-associated protein, CRISPR/Cas) 技術(shù)。在此篇綜述中，我們將著重介紹TALENs技術(shù)，并就其與ZFNs、CRISPR/Cas之間的差異做簡(jiǎn)要介紹。

1 TALENs：特異性識(shí)別與切割

TALEN是TALE結(jié)構(gòu)域與Ⅰ核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域組合而成的融合蛋白。因TALE有多種變體，所以也有多種TALEN。根據(jù)功能不同，TALENs的結(jié)構(gòu)分為T(mén)ALEs組成的DNA識(shí)別結(jié)合結(jié)構(gòu)域，以及Ⅰ核酸內(nèi)切酶功能域組成的酶促切割結(jié)構(gòu)域。

1.1 TALENs的識(shí)別結(jié)合結(jié)構(gòu)域

TALEs是一類(lèi)由植物病原菌黃單胞桿菌sp.產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，可以通過(guò)Ⅲ型分泌系統(tǒng)進(jìn)入宿主細(xì)胞，因此也被稱(chēng)為Ⅲ型效應(yīng)物[14]。一旦進(jìn)入宿主細(xì)胞，一些TALEs就會(huì)進(jìn)入細(xì)胞核，并與相對(duì)應(yīng)的DNA序列結(jié)合，轉(zhuǎn)錄并激活其表達(dá)。由于遺傳背景不同，一般情況下，激活某些基因會(huì)增加宿主對(duì)病原菌的增殖敏感度[15]，但某些情況下也會(huì)引起宿主的防御反應(yīng)[16]。

從結(jié)構(gòu)上來(lái)說(shuō)，TALEs蛋白的N端一般含有Ⅲ型分泌信號(hào)肽，C端則包含有一個(gè)功能性核定位信號(hào)(nuclear localization signal, NLS) 以及一個(gè)具有真核轉(zhuǎn)錄激活因子特征的高效轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(activation domain, AD)[17](圖1A)。兩者之間則是決定TALENs特異性的DNA識(shí)別結(jié)合結(jié)構(gòu)域，由若干 (13?29) 個(gè)重復(fù)氨基酸單元組成，每個(gè)重復(fù)氨基酸單元含有34個(gè)呈串聯(lián)排列的氨基酸[18]。每個(gè)重復(fù)單元的氨基酸序列幾乎一致，僅12、13號(hào)位點(diǎn)的氨基酸殘基是高度可變的[19]，并且是特異性識(shí)別核苷酸的關(guān)鍵部件 (圖1B)。因此，這兩個(gè)變化的特殊氨基酸殘基被合稱(chēng)為RVD。其中，第13位殘基負(fù)責(zé)識(shí)別特定核苷酸，而12位殘基則承擔(dān)了穩(wěn)定RVD結(jié)構(gòu)，并與DNA蛋白質(zhì)骨架結(jié)合的功 能[20]。相同的發(fā)現(xiàn)也在TALE-DNA結(jié)合模擬中被提及[21]。TALEs中串聯(lián)排列的RVDs與靶標(biāo)DNA序列的核苷酸近乎一一對(duì)應(yīng)。2009年，這一對(duì)應(yīng)關(guān)系被兩個(gè)研究團(tuán)隊(duì)分別獨(dú)立破解，并刊登在同一期雜志上。其中，Moscou和Bogdanove[22]通過(guò)計(jì)算機(jī)掃描比對(duì)RVDs與靶標(biāo)的啟動(dòng)子序列并分析其頻率，發(fā)現(xiàn)RVDs與它們靶標(biāo)位點(diǎn)的核苷酸直接對(duì)應(yīng)，且表現(xiàn)為一個(gè)RVD對(duì)應(yīng)一個(gè)核苷酸。這些對(duì)應(yīng)關(guān)系存在部分的簡(jiǎn)并性，但沒(méi)有明顯的上下游序列依賴(lài)(context dependence) 現(xiàn)象。例如在統(tǒng)計(jì)了383個(gè)RVD-核苷酸的對(duì)應(yīng)關(guān)系后，他們發(fā)現(xiàn)HD是出現(xiàn)最為頻繁的RVD并且與C存在很強(qiáng)的對(duì)應(yīng)關(guān)系。其次是識(shí)別T的NG和識(shí)別A的NI。再次則是識(shí)別G或是A的NN。另一個(gè)小組的Boch等[23]則通過(guò)實(shí)驗(yàn)分析TALEs與靶標(biāo)DNA分子的對(duì)應(yīng)關(guān)系進(jìn)而得出了與Moscou等類(lèi)似的結(jié)論。這些RVD-核苷酸的對(duì)應(yīng)關(guān)系被人們歸納出來(lái)并用于設(shè)計(jì)能識(shí)別特定DNA序列的TALEs[18,24-26]。

1.2 TALENs的酶促切割結(jié)構(gòu)域

近年來(lái)，許多研究中應(yīng)用了人工設(shè)計(jì)的核酸酶來(lái)進(jìn)行基因組編輯[27]。這些編輯工具通常是由可定制的DNA識(shí)別結(jié)合域與非特異性的核酸內(nèi)切酶融合而成[28](如ZFNs，也如TALENs)。ZFNs與TALENs通常連接的是Ⅰ核酸內(nèi)切酶。Ⅰ是最初分離于細(xì)菌海床黃桿菌的一類(lèi)ⅡS型核酸酶[29]。在有底物DNA存在時(shí)用胰蛋白酶水解可以得到41 kDa的N端DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域與 25 kDa的C端DNA酶切結(jié)構(gòu)域[30]。通常，Ⅱ型限制性?xún)?nèi)切酶的切割位點(diǎn)與其結(jié)合位點(diǎn)相同或鄰近，ⅡS型核酸內(nèi)切酶則在距離結(jié)合位點(diǎn)固定距離處切割DNA雙鏈。對(duì)于Ⅰ核酸酶，其DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域識(shí)別結(jié)合一段非回文序列5′-GGATG-3′/5′- CATCC-3′，然后酶切結(jié)構(gòu)域在結(jié)合位點(diǎn)下游距離9個(gè)和13個(gè)核苷酸的位點(diǎn)非特異性地切割DNA雙鏈[30-31]。Ⅰ單體并不具有活性，只有當(dāng)它與靶標(biāo)DNA結(jié)合并且形成二聚體，在二價(jià)金屬離子輔助下才具有酶切活性[32]。根據(jù)此特性，人們?cè)O(shè)想通過(guò)使兩分子Ⅰ分別在兩個(gè)相鄰識(shí)別位點(diǎn)結(jié)合，形成具有核酸酶功能的非同源二聚體，切割兩位點(diǎn)之間的DNA雙鏈[28,33-34]。

圖1 TALE組成及RVD結(jié)構(gòu)[17]

2 TALENs的設(shè)計(jì)與構(gòu)建

2010年6月，Christian等[24]首次報(bào)道了人工構(gòu)建TALENs技術(shù)。他們將AvrBs3和PthXoI中天然存在的TALEs序列與I融合形成融合蛋白后對(duì)目標(biāo)DNA進(jìn)行打靶，并對(duì)結(jié)合位點(diǎn)間距不同的TALEN打靶效率進(jìn)行比較，分析TALEN二聚體最佳的打靶位點(diǎn)距離。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，AvrBs3和PthXoI的最佳打靶位點(diǎn)間距分別是21 bp和24 bp，并且它們同時(shí)在15 bp處有相對(duì)較大的活性。TAL結(jié)構(gòu)域和Ⅰ結(jié)構(gòu)域之間的連接區(qū) (Linkers) 序列長(zhǎng)度對(duì)于TALEN的活性影響巨大，而兩個(gè)TALEN結(jié)合位點(diǎn)的間隔區(qū) (Spacers) 序列長(zhǎng)度則與Ⅰ二聚體的形成效率息息相關(guān)。2011年，Li等用來(lái)自AvrXa7和PthX01中天然存在的TALE重復(fù)序列進(jìn)行了類(lèi)似的實(shí)驗(yàn)，并比較了將Ⅰ結(jié)構(gòu)域連接到TALE結(jié)構(gòu)域N端和C端構(gòu)成的TALEN融合蛋白的活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ⅰ連接到TALE的C端時(shí)效率更高[18]。對(duì)于TALEs的活性影響，盡管不同TALEs對(duì)N端、C端的依賴(lài)程度不同，但對(duì)于絕大多數(shù)TALEs來(lái)說(shuō)，N端對(duì)于TALE與DNA的相互作用會(huì)更為重要[35]。

植物中的天然TALEs的結(jié)合序列都是從一個(gè)T (與TALE的N端的0位重復(fù)單元相對(duì)應(yīng)) 開(kāi)始的[22]。盡管這個(gè)T堿基同RVD沒(méi)有關(guān)聯(lián)，但卻能參與引起本氏煙草中的hax3的激活反應(yīng)[23]。雖然Sun等[36]使用以A、C或G起始的TALENs也能識(shí)別并敲除導(dǎo)致鐮刀型貧血病的人類(lèi)血紅蛋白 (HBB) 基因。但這個(gè)T堿基一般情況下仍是TALE活性所必需的[37]。Scholze等[38]的研究顯示至少有4個(gè)因素會(huì)影響重復(fù)單元與DNA的識(shí)別結(jié)合：?jiǎn)?dòng)基因表達(dá)的最小重復(fù)單元數(shù)量；重復(fù)單元與DNA錯(cuò)配引起的副作用；不同重復(fù)單元特異性不同；位點(diǎn)依賴(lài)和上下游序列依賴(lài)型錯(cuò)配。

而Jankele和Svoboda則從特殊重復(fù)單元類(lèi)型和TALE-DNA結(jié)合模式中推測(cè)出來(lái)一些合理設(shè)計(jì)、組裝TALE重復(fù)結(jié)構(gòu)域的要求[39]：

1) 選擇帶有5′-T0堿基的中央重復(fù)結(jié)構(gòu)域(central repeat domain，CRD) 識(shí)別序列。在無(wú)法滿足時(shí)，可以選用專(zhuān)一性較低的5′-N0來(lái)進(jìn)行調(diào)整[40]。

2) 對(duì)待選的靶位點(diǎn)的唯一性進(jìn)行驗(yàn)證 (例如，該序列沒(méi)有因存在高度重復(fù)片段而產(chǎn)生的多態(tài)性)。

3) 盡管一般情況下重復(fù)單元的最適長(zhǎng)度會(huì)因不同個(gè)體的同源序列變化而存在區(qū)別[20,41-43]，但組裝TALENs時(shí)最好不少于14個(gè)重復(fù)單元，而TALE轉(zhuǎn)錄激活因子則需要18?20個(gè)的重復(fù)單元。

4) 應(yīng)該含有至少4個(gè)位置均衡的高效RVDs (例如，HD>C, NG>T 或者NN>G/A)，特別是在CRD的末端，高效的RVDs可以起到穩(wěn)定TALE-DNA結(jié)合的作用[44-45]。

5) 避免出現(xiàn)3個(gè)相同RVDs連續(xù)延伸的情況，特別是NG。研究顯示即使只有3個(gè)NG連接成串也會(huì)導(dǎo)致TALE蛋白折疊畸形。

6) 如果需要區(qū)別對(duì)待A、G，則最好使用NH而非NN去識(shí)別G[46]。

7) 使用NI特異性識(shí)別A時(shí)需要搭配使用足夠高效的RVDs[46]。

8) 使用含有整個(gè)N端區(qū)域 (N-terminal region，NTR) (約150個(gè)氨基酸) 以及C端到效應(yīng)子距離合適并經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的TALE骨架。目前，在多種生物中使用最為頻繁的骨架是Miller 等[25]建立的。當(dāng)然，Mussolino等[35]和Zhang等[47]建立的骨架也是可靠并被廣泛使用的。

9) 最后，可以通過(guò)越來(lái)越可靠的在線工具來(lái)進(jìn)行TALEN設(shè)計(jì)與脫靶分析。

針對(duì)由于高度重復(fù)與高度特異性而導(dǎo)致的TALENs組裝困難，研究者開(kāi)發(fā)出多種方案用以克服這些困難，從而快速、高效地組裝TALENs。Zhang等[47]發(fā)明了一種逐層連接策略。其原理是先組裝3個(gè)四聚體然后再根據(jù)每個(gè)四聚體兩端的獨(dú)特粘性末端組裝為線性串聯(lián)復(fù)合物。Weber等[48]通過(guò)Golden Gate克隆技術(shù)來(lái)合成TALEs。這一克隆技術(shù)需要ⅡS型核酸酶并包含兩個(gè)連續(xù)步驟：分別是基于BsaⅠ序列的重復(fù)單元預(yù)裝配以及基于BpiⅠ序列的預(yù)裝配模塊的合成反應(yīng)。而Cermak等[49]則通過(guò)設(shè)計(jì)了一種不依賴(lài)于PCR的策略使得TALEs的實(shí)用性和靈活性都得到了很大擴(kuò)展。2012年，Li等[50]描述了一種通過(guò)Ⅱ型限制酶進(jìn)行快速、高效地構(gòu)建TALE轉(zhuǎn)錄激活因子 (TALE transcription factors, TALE-TFs) 和TALENs骨架的一步限制酶連續(xù)連接反應(yīng)。而Sanjana等[51]改良了TALE-TFs用于人類(lèi)基因的激活調(diào)控和TALENs用于調(diào)整基因的敲除或插入。還有一種固相高通量自動(dòng)連接(fast ligation-based automatable solid-phase high-throughput, FLASH) 技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)TALENs的大規(guī)模組裝[52]。這一方法是通過(guò)液相操作裝置操作載有預(yù)組裝四聚體的磁珠進(jìn)行連續(xù)連接來(lái)構(gòu)建TALENs的。而B(niǎo)riggs等[53]設(shè)計(jì)了一種稱(chēng)為迭代帽組裝(ative capped assembly, ICA) 的方法，通過(guò)連續(xù)連接重復(fù)單體從而相當(dāng)成功且快速地構(gòu)建定制TALENs。這一方法與FLASH的不同之處在于它是基于固相支撐的，可以使最終產(chǎn)物達(dá)到21個(gè)單體的概率大大增加。近期，Schmid-Burgk等[54]設(shè)計(jì)了一種非連接酶依賴(lài)型克隆(ligation-independent cloning, LIC) 技術(shù)。他們構(gòu)建了一個(gè)五聚體TALE重復(fù)片段文庫(kù)用以合成TALEs。這一方法使得TALENs的構(gòu)建更加簡(jiǎn)單快速、高通量以及自動(dòng)化。盡管脫靶的影響仍是制約TALENs技術(shù)廣泛應(yīng)用的主要問(wèn)題[35,55]，但隨著技術(shù)的發(fā)展[45]，在可以預(yù)見(jiàn)的將來(lái)，減小因非特異性切割而帶來(lái)的細(xì)胞毒性、減小上下游序列依賴(lài)現(xiàn)象[56]、增大TALEs的識(shí)別特異性將會(huì)使得TALENs的應(yīng)用更為廣泛和實(shí)用。

3 TALENs的應(yīng)用

隨著TALENs組裝技術(shù)的進(jìn)步，TALENs技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域、多個(gè)物種。包括：線蟲(chóng)[57]、斑馬魚(yú)[58-60]、鼠[55,61]、蠶[62]、哺乳動(dòng)物[25]、蟋蟀[63]、果蠅[64]、人類(lèi)[25,36,65-67]以及多能干細(xì)胞[68-69]。2011年，Sander等[58]利用Miller等[25]發(fā)明的方法構(gòu)建了TALENs，并獲得了和突變的斑馬魚(yú)體細(xì)胞，其突變效率為11%?33%。Huang等[70]則利用一種單元組裝法構(gòu)建的TALENs對(duì)和兩個(gè)基因成功打靶并獲得了可以穩(wěn)定遺傳的斑馬魚(yú)突變體。而到了2012年，Bedell等[71]借助于TALENs切割DNA后產(chǎn)生的雙鏈斷裂 (Double strand break, DSB)，把短的單鏈DNA (Single-stranded DNA，ssDNA，包含loxP序列) 精確地重組到斑馬魚(yú)的基因組中。這一突破性研究為條件基因打靶奠定了必要的技術(shù)基礎(chǔ)。而Reyon等[52]使用FLASH系統(tǒng)組裝了48個(gè)TALENs并通過(guò)基于增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein, eGFP) 的熒光結(jié)果去檢測(cè)這些蛋白質(zhì)的活性，為T(mén)ALENs活性檢測(cè)提供了直觀方法。除了應(yīng)用TALENs進(jìn)行基礎(chǔ)研究，TALENs也被用于治療性應(yīng)用，包括鐮刀型貧血病的治療[36]、慢性病毒感染[72]以及神經(jīng)性家族遺傳病[73]以及其他疾病的治療、預(yù)防與矯正[74-79]。此外，Kim等[80]使用TALENs技術(shù)成功獲得了具有表面抗原H-2K (k) 和潮霉素抗性蛋白的突變體，然后分別使用磁分離和潮霉素抗性培養(yǎng)處理進(jìn)行細(xì)胞分離。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TALENs技術(shù)可以有效地富集突變體。這也意味著TALEN技術(shù)可以更廣泛地應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究，使核酸重組效率得到很大提高。

隨著TALEs技術(shù)的研究深入與應(yīng)用開(kāi)展，許多研究者給出了適當(dāng)?shù)慕ㄗh。Zhang等[1]認(rèn)為無(wú)論是在TALEs的基礎(chǔ)研究還是臨床應(yīng)用中，許多因素都應(yīng)該審慎地進(jìn)行考慮。這些因素包括但不限于：RVDs的特異性與效率、連接區(qū) (Linkers) 和間隔區(qū) (Spacers) 的長(zhǎng)度。此外，TALEs的上下游序列依賴(lài)現(xiàn)象與細(xì)胞毒性也都需要進(jìn)行細(xì)致的驗(yàn)證，特別需要注意的是對(duì)慢性病毒感染進(jìn)行治療時(shí)應(yīng)考慮到可能會(huì)對(duì)宿主的基因組造成影響[72]。另外，由于天然TALEs僅在植物病原體中發(fā)現(xiàn)，因此臨床治療中很有可能發(fā)生免疫應(yīng)答反應(yīng)。

4 TALENs與ZFNs、CRISPR/Cas

隨著時(shí)間的推移、研究的深入，出現(xiàn)了多種各具特點(diǎn)的基因組編輯技術(shù)。

TALENs是以替代ZFNs為目標(biāo)迅速發(fā)展起來(lái)的新基因組編輯技術(shù)，并且研究、應(yīng)用中同ZFNs存在許多相似之處。鋅指結(jié)構(gòu)域是目前真核生物中最常見(jiàn)的DNA結(jié)合序列，也是人類(lèi)基因組中最常使用的編碼蛋白。單個(gè)鋅指模塊大約由30個(gè)氨基酸組成保守的ββα結(jié)構(gòu)，其中α表面的幾個(gè)氨基酸會(huì)與DNA大溝中的三個(gè)堿基對(duì)相連[81]。而不同的鋅指模塊對(duì)DNA的結(jié)合特異性也存在程度差異。因此，鋅指模塊使得DNA結(jié)合蛋白的定制化成為可能。其后，人工鋅指蛋白的出現(xiàn)，使得鋅指蛋白可以識(shí)別結(jié)合9?18個(gè)堿基對(duì)的DNA序列。而18個(gè)堿基對(duì)的識(shí)別能力則意味著能在680億個(gè)堿基中形成特異性，是第一個(gè)能對(duì)人類(lèi)基因組的特定序列進(jìn)行特異性結(jié)合的技術(shù)[82-83]。很多研究顯示，在相同基因打靶時(shí)TALENs和ZFNs表現(xiàn)出了不相上下的打靶效率[52,55,58,68]。而Mussolino等[35]比較了CCR5特異的TALENs與已經(jīng)驗(yàn)證過(guò)的ZFNs之間的細(xì)胞毒性與特異性。其結(jié)果顯示，TALENs引起了約1%的錯(cuò)誤突變，而ZFNs的錯(cuò)誤誘變比率則高達(dá)11%。此外，經(jīng)過(guò)TALENs處理的細(xì)胞存活率是經(jīng)過(guò)ZFNs處理細(xì)胞的兩倍。

CRISPR序列最早于1987年由Ishino等[84]發(fā)現(xiàn)，Jansen等[85]將其正式命名。隨后，在許多細(xì)菌和古細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了CRISPR序列和CRISPR相關(guān) (CRISPR-associated, Cas) 基 因[86]。目前已發(fā)現(xiàn)的CRISPR/Cas系統(tǒng)可以根據(jù)Cas基因核心元件的不同分為3種類(lèi)型，Ⅰ型、Ⅲ型系統(tǒng)需要多個(gè)Cas蛋白形成復(fù)合體才能切割DNA雙鏈，而Ⅱ型系統(tǒng)則只需要一個(gè)Cas9蛋白即可[87]。CRISPR/Cas系統(tǒng)是細(xì)菌和古細(xì)菌的一種免疫機(jī)制，目前基因組編輯中應(yīng)用的多為Ⅱ型系統(tǒng)，通過(guò)Cas9蛋白俘獲外源DNA片段并整合進(jìn)宿主基因組轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生前體CRISPR-RNA (pre-crRNA)、反式激活crRNA (trans-activating crRNA, tracrRNA) 并與形成的向?qū)NA (guide RNA, gRNA) 組合成Cas9核酸酶復(fù)合體[88]。在crRNA中的20 bp向?qū)蛄?guide sequence) 以及與向?qū)蛄薪Y(jié)合的靶向DNA 5′端的3個(gè)堿基(protospacer-adjacent motif, PAM)[89-90]介導(dǎo)下，Cas9核酸酶復(fù)合體可以對(duì)外源DNA引入DSBs使之降解，從而抵御噬菌體等外來(lái)侵入者，進(jìn)行自我保護(hù)[91-92]。CRISPR/Cas系統(tǒng)與TALENs、ZFNs不同之處在于，其識(shí)別特異性是由RNA而非蛋白質(zhì)決定，因而設(shè)計(jì)、組裝更為簡(jiǎn)便[88,93]。一些研究顯示CRISPR/Cas整體情況下的酶切活性比TALENs更為高效[88,94]。此外，CRISPR/Cas系統(tǒng)可以同時(shí)對(duì)靶向基因組的多個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行切割或修 飾[95-97]，可以促進(jìn)多位點(diǎn)突變疾病的治療。

但是，基于研究時(shí)間尚短及其結(jié)構(gòu)特性，CRISPR/Cas系統(tǒng)不可避免也存在許多不足：由于堿基識(shí)別個(gè)數(shù)的差異、PAM序列的不嚴(yán)格互補(bǔ)[88,97-99]，CRISPR/Cas系統(tǒng)存在非特異性切割現(xiàn)象[98,100-101]，甚至產(chǎn)生較高的脫靶率[102-103]，特異性遠(yuǎn)低于TALENs；而基于不同物種的遺傳背景不同，可能需要針對(duì)性地構(gòu)建Cas基因啟動(dòng)子及其表達(dá)載體[88,96,104-105]；CRISPR/Cas系統(tǒng)在對(duì)不同物種以及同一物種的不同基因進(jìn)行定點(diǎn)編輯時(shí)，效率存在有較大的差異[106-107]。

比較以上3種技術(shù) (表1)，ZFNs技術(shù)積累最為豐富，但存在脫靶率高、細(xì)胞毒性大；TALENs技術(shù)與ZFNs有很大相似性，可以借鑒ZFNs的研究基礎(chǔ)，但比ZFNs更有優(yōu)勢(shì)；CRISPR/Cas技術(shù)最為前沿、前景更為廣闊，但受限于發(fā)展時(shí)間較短、微生物應(yīng)用基礎(chǔ)薄弱。

表1 TALENs、ZFNs和CRISPR/Cas的對(duì)比[1]

TALENs: transcription activator-like effectors; ZFNs: zinc-finger nucleases; CRISPR/Cas: clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein; C2H2: 2-cysteine and 2-histidine, RVD: repeat variable diresidues crRNA; CRISPR-RNA; PAM: protospacer-adjacent motif.

5 本實(shí)驗(yàn)室工作內(nèi)容和經(jīng)驗(yàn)

在“國(guó)家自然科學(xué)基金”等項(xiàng)目的資助下，本實(shí)驗(yàn)室在絲狀真菌的基因組編輯領(lǐng)域已經(jīng)積累有一定的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。

首先，在方法選擇上，縱觀ZFNs、TALENs、CRISPR/Cas這三大技術(shù)，ZFNs由于前文所述的種種自身限制或缺陷，目前的研究一般不會(huì)優(yōu)先考慮使用ZFNs。

而TALENs和CRISPR/Cas相比，CRISPR/Cas技術(shù)來(lái)勢(shì)洶洶，從2013年第一篇應(yīng)用報(bào)道刊登于雜志起，已有數(shù)百篇相關(guān)研究報(bào)道發(fā)表于國(guó)際頂級(jí)學(xué)術(shù)期刊，其特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)在于操作非常簡(jiǎn)單，只需表達(dá)Cas酶，依靠crRNA就可以靶向編輯目的DNA序列，不需要繁瑣的元件拼接過(guò)程，省時(shí)省事。

因此，在研究的早期階段，我們優(yōu)先選擇CRISPR/Cas開(kāi)展絲狀真菌的基因組編輯研究。但是，由于CRISPR/Cas的技術(shù)缺陷所造成的問(wèn)題也接踵而來(lái)：

第一，CRISPR/Cas系統(tǒng)依賴(lài)gRNA來(lái)識(shí)別目的DNA，因此，對(duì)gRNA的序列有著嚴(yán)格的要求，在其他物種中，gRNA一般放置在已知的、背景非常清楚的啟動(dòng)子和終止子之間，例如，在人類(lèi)細(xì)胞中，一般采用U6啟動(dòng)子和終止子，這樣，才能保證gRNA在特定的堿基位置起始轉(zhuǎn)錄，并在特定的堿基位置終止轉(zhuǎn)錄。但是，絲狀真菌種類(lèi)繁多，對(duì)其遺傳背景的研究資料較少，尤其是對(duì)啟動(dòng)子和終止子的研究很少，已知的啟動(dòng)子和終止子一般用于蛋白表達(dá)，雖然可以轉(zhuǎn)錄出mRNA，但是精確定位某個(gè)啟動(dòng)子起始轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)或者某個(gè)終止子終止轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)的報(bào)道幾乎沒(méi)有。這樣，就很難獲得具有準(zhǔn)確5′及3′邊界的gRNA，在無(wú)法保證gRNA序列準(zhǔn)確的情況下，精確的基因組編輯無(wú)從談起。而且，眾所周知，絲狀真菌常常產(chǎn)生大量的RNA酶，而gRNA容易受到真菌內(nèi)源RNA酶的攻擊，一旦gRNA序列有所缺失，即使只缺失1個(gè)堿基，也可能會(huì)徹底喪失功能。

第二，前文已述，CRISPR/Cas系統(tǒng)需要目標(biāo)DNA分子上的PAM序列介導(dǎo)，例如，釀膿鏈球菌來(lái)源的Cas9酶，其PAM序列是NGG；腦膜炎雙球菌來(lái)源的Cas9酶，其PAM序列是NNNNGATT。這就意味著，CRISPR/Cas系統(tǒng)只能在有PAM的位置處進(jìn)行DNA編輯，這就限制了其應(yīng)用，如果我們想編輯的某個(gè)位點(diǎn)，沒(méi)有PAM，那么就無(wú)法使用CRISPR/Cas系統(tǒng)，而這一情況在某些絲狀真菌中較常遇到。

鑒于上述種種因素，我們?cè)诤笃谘芯恐校瑑?yōu)先選擇了TALENs系統(tǒng)。

TALENs系統(tǒng)只需要能夠表達(dá)出TALEN酶蛋白分子即可，因此，絲狀真菌中已知的啟動(dòng)子和終止子均可使用，另外，TALENs可以直接和目標(biāo)DNA分子發(fā)生相互作用，不需要任何其他中介，不受序列特異性限制，因此靶向性更強(qiáng)。

其次，在實(shí)驗(yàn)樣品的選擇上，由于很多絲狀真菌的菌體是多倍體，甚至有些菌體內(nèi)有多個(gè)細(xì)胞核，造成了絲狀真菌的遺傳穩(wěn)定性較差。如果基因打靶只作用于一條染色體上，或者只作用于其中一個(gè)細(xì)胞核上，那么，菌體增殖分裂的后代中，仍然會(huì)有野生型的細(xì)胞存在。這也是很多傳統(tǒng)育種技術(shù)改造的菌株，在多次傳代后出現(xiàn)菌株衰退的原因之一。在研究中我們發(fā)現(xiàn)，很多絲狀真菌能產(chǎn)生單倍體的孢子，而這些通常被認(rèn)為是休眠狀態(tài)的孢子，也可以實(shí)現(xiàn)外源DNA的轉(zhuǎn)化。若能在孢子中的單倍體上成功進(jìn)行基因組編輯，那么，其子代就能有非常好的遺傳穩(wěn)定性，避免了后期繁瑣的菌株篩選和復(fù)壯步驟。

6 TALENs 技術(shù)在工業(yè)微生物領(lǐng)域應(yīng)用前景展望

人類(lèi)文明步入21世紀(jì)后，工業(yè)生物技術(shù)已經(jīng)在世界范圍內(nèi)掀起了生物技術(shù)革命的第三次浪潮，為解決可持續(xù)發(fā)展中的重大問(wèn)題，諸如能源危機(jī)、自然資源短缺、環(huán)境污染、醫(yī)藥產(chǎn)品與食品的生產(chǎn)等等做出了巨大貢獻(xiàn)。在國(guó)家《“十二五”生物技術(shù)發(fā)展規(guī)劃》中，工業(yè)生物技術(shù)亦被列為“前瞻性基礎(chǔ)研究”的發(fā)展重點(diǎn)。選育和構(gòu)建優(yōu)良的工業(yè)微生物菌種，是工業(yè)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)化的前提條件，因此，“工業(yè)微生物育種技術(shù)”成為制約工業(yè)生物技術(shù)發(fā)展的關(guān)鍵技術(shù)。

絲狀真菌 (也俗稱(chēng)霉菌)，廣泛應(yīng)用于發(fā)酵工業(yè)，在酶制劑、飼料、食品等領(lǐng)域有著重要用途，常見(jiàn)的有木霉、根霉、曲霉等等。絲狀真菌與其他常見(jiàn)的工業(yè)微生物 (諸如酵母菌、細(xì)菌) 相比，絲狀真菌的DNA轉(zhuǎn)化非常困難，而且，在某些絲狀真菌中，轉(zhuǎn)化入細(xì)胞的外源DNA很容易隨機(jī)整合到宿主的基因組上，此外，還有一些絲狀真菌在同一個(gè)細(xì)胞中有多個(gè)細(xì)胞核，每個(gè)細(xì)胞核中的染色體又是多倍體，造成遺傳穩(wěn)定性極差等。上述原因，造成了絲狀真菌基因工程的研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于其他物種。

相比于傳統(tǒng)的基因打靶技術(shù)，TALENs 是革命性的，它集成了“精確”、“高效”、“簡(jiǎn)便”這三大優(yōu)勢(shì)，其發(fā)展與普及必是大勢(shì)所趨，雜志社更將其評(píng)為“Method of the Year 2011”。TALENs 可以根據(jù)任意的目標(biāo)DNA 序列設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。TALENs在工業(yè)微生物中可以有如下的應(yīng)用：1) 在需要高表達(dá)生物活性物質(zhì)的菌株中，TALENs可以靶向到目標(biāo)啟動(dòng)子或者調(diào)控區(qū)，提高目標(biāo)產(chǎn)物的表達(dá)量；2) 在表達(dá)蛋白質(zhì)的菌株中，TALENs可以敲除菌體內(nèi)源蛋白酶的基因，降低表達(dá)產(chǎn)物被蛋白酶降解的風(fēng)險(xiǎn)；3) 在具有反饋抑制現(xiàn)象的菌株中，TALENs可以敲除導(dǎo)致抑制現(xiàn)象的基因，解除反饋抑制；4) 在抗生素生產(chǎn)菌株中，發(fā)酵產(chǎn)物中除了目標(biāo)抗生素，常常還會(huì)有一些副產(chǎn)物，而這些副產(chǎn)物一般都具有毒性，且難以被純化，TALENs技術(shù)的出現(xiàn)，可以快速敲除與副產(chǎn)物合成有關(guān)的基因，提高發(fā)酵產(chǎn)物中抗生素的純度；5) TALENs技術(shù)還可以敲除一些菌體中冗余的、非必需的基因，這些基因常常會(huì)拖累菌體的生長(zhǎng)速度，敲除后，可以有效地增加菌體生物量，加快發(fā)酵生產(chǎn)進(jìn)度，節(jié)約發(fā)酵過(guò)程中所耗費(fèi)的水電和人力資源等。

在工業(yè)微生物領(lǐng)域，制作出能夠應(yīng)用于人類(lèi)生活的產(chǎn)品才是最終目的。很多絲狀真菌的發(fā)酵產(chǎn)物，常常作為人類(lèi)的食品或者藥品，在日益重視食品安全和醫(yī)藥安全的今天，TALENs具有比傳統(tǒng)技術(shù)方法和CRISPR/Cas系統(tǒng)都高的靶向精確性，用TALENs改造的基因重組菌株，無(wú)疑具有更高的生物安全性。

7 結(jié)語(yǔ)

可定制的核酸酶使得研究人員能夠快捷、有效地敲除、敲入目的基因。ZFNs技術(shù)使人們對(duì)于基因與功能的關(guān)系研究進(jìn)入新的局面，而更為優(yōu)秀的TALENs的出現(xiàn)，則為這一進(jìn)程注入新的活力。TALENs的核心部件TALEs不僅可以同限制性核酸酶結(jié)合成為可定制的高特異性核酸酶，還能同轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域、表達(dá)結(jié)構(gòu)域、染色質(zhì)修飾結(jié)構(gòu)域以及熒光蛋白結(jié)合，從而形成種類(lèi)繁多，功能各異的融合蛋白。這些基于TALEs的新技術(shù)都具有極大的開(kāi)發(fā)前景與實(shí)用價(jià)值，但是最吸引人的還是能夠任意改造基因組的TALENs。此外，RVD與堿基的一一對(duì)應(yīng)關(guān)系是目前基因組編輯領(lǐng)域最為簡(jiǎn)單的蛋白質(zhì)-DNA互作機(jī)制，在保證準(zhǔn)確性的前提下能極大地優(yōu)化基因打靶的過(guò)程與效率。

雖然TALENs技術(shù)已經(jīng)成功應(yīng)用于多種生物與領(lǐng)域，但仍存在一些尚未明晰的疑問(wèn)，比如天然TALEs的結(jié)合位點(diǎn)前總有一個(gè)T；TALEs的末尾RVD是半個(gè)；RVDs的特異性機(jī)理；TALEs的重復(fù)數(shù)與結(jié)合效率之間的關(guān)系；TALENs的活性影響因素；TALENs是否會(huì)引起免疫反應(yīng)等。

值得注意的是，CRISPR/Cas技術(shù)面世后，得到了極大的關(guān)注。鑒于CRISPR/Cas的便利性，有一種主流觀點(diǎn)認(rèn)為，TALENs和ZFNs技術(shù)已經(jīng)過(guò)時(shí)。但是該觀點(diǎn)有待商榷，畢竟，在一些特殊的應(yīng)用場(chǎng)合或領(lǐng)域，TALENs或ZFNs仍然有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，例如前文所述的絲狀真菌基因改造領(lǐng)域，就是一個(gè)比較典型的例子。因此，這就要求科技工作者具體問(wèn)題具體分析，辯證地根據(jù)事物的客觀屬性，有針對(duì)性地選擇合適的方法技術(shù)。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Advances in transcription activator-like effectors - a review

Yu Tang1, Lisha Li1,2, and Jun Lin1,2

1,,350108,,2,,350108,,

As a protein originally found in plant pathogenic bacteria, transcription activator-like effectors (TALEs) can be fused with the cleaving domain of restriction endonuclease (For exampleⅠ) to form artificial nucleases named TALENs. These proteins are dependent on variable numbers of tandem Repeats of TALEs to recognize and bind DNA sequences. Each of these repeats consists of a set of approximately 34 amino acids, composed of about 32 conserved amino acids and 2 highly variable amino acids called repeat variant di-residues (RVDs). RVDs distinguish one TALE from another and can make TALEs have a simple cipher for the one-to-one recognition for proteins and DNA bases. Based on this, in theory, artificially constructed TALENs could recognize and break DNA sites specifically and arbitrarily to perform gene knockout, insertion or modification. We reviewed the development of this technology in multi-level and multi species, and its advantages and disadvantages compared with ZFNs and CRISPR/Cas technology. We also address its special advantages in industrial microbe breeding, vector construction, targeting precision, high efficiency of editing and biological safety.

TALENs, genome editing, industrial microorganism

December 3, 2014;

January 19, 2015

National Natural Science Foundation of China (No. 31301537), National College Students′ innovation and entrepreneurship training programs (No. 201410386023), Science Development Foundation of Fuzhou University (No. 2013-XY-17).

Jun Lin. Tel: +86-591-22866273; E-mail: jun@fzu.edu.cn

2015-02-27

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20150227.1107.001.html

國(guó)家自然科學(xué)基金(No. 31301537)，國(guó)家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃(No. 201410386023)，福州大學(xué)科技發(fā)展基金 (No. 2013-XY-17) 資助。