陸吉學，王世珍,2，方柏山,2

?

生物分子機器——甲烷單加氧酶的研究進展

陸吉學1，王世珍1,2，方柏山1,2

1 廈門大學化學化工學院，福建 廈門 361005 2 廈門市合成生物技術(shù)重點實驗室，福建 廈門 361005

陸吉學, 王世珍, 方柏山. 生物分子機器——甲烷單加氧酶的研究進展. 生物工程學報, 2015, 31(7): 1015–1023.Lu JX, Wang SZ, Fang BS. Advances in biomolecular machine: methane monooxygenases. Chin J Biotech, 2015, 31(7): 1015–1023.

甲烷氧化菌中的甲烷單加氧酶能夠在生理條件下選擇性地以甲烷和氧氣為底物生成甲醇，麻省理工學院的Lippard教授稱它為“神奇的生物分子機器”。本文重點對生物分子機器甲烷單加氧酶的結(jié)構(gòu)、編碼基因及調(diào)控機制、催化反應機理等進行了綜述，此外也簡要介紹了甲烷單加氧酶的產(chǎn)生菌甲烷氧化菌的研究歷史及分類。生物分子機器甲烷單加氧酶可催化甲烷氧化成甲醇，不僅為甲醇的生產(chǎn)提供了一種新穎的生產(chǎn)方法，而且對生物分子機器的設(shè)計也有借鑒意義。

甲烷單加氧酶，生物分子機器，甲烷氧化菌，機理，甲烷

1959年，第29屆美國物理學會年會上美國著名物理學家理查德?費曼(Richard Feynman) 演講中首次提出人工分子機器的概念[1]。分子機器被定義為一種納米水平的裝置，它可以把化學能、電能和光能轉(zhuǎn)化成機械能，人體則可以看成納米分子機器的集合體[2]。而生物分子機器(Biological molecular machine) 被定義為能夠利用ATP水解釋放的化學能轉(zhuǎn)變?yōu)闄C械能的蛋白分子[1]。這種對生物分子機器的定義比較狹窄，實際上Balzani等認為分子機器可定義為把一些分散的分子聚集到一起，在外部驅(qū)動力的作用下，它的組成部分有相對位置的變化，表現(xiàn)出類似于機械一樣的運動的分子[2]。生物催化涉及到的小分子底物反應，通常由自然界中大分子的蛋白和蛋白復合物來催化完成[3]。甲烷單加氧酶是一種復雜的大分子蛋白復合物，它在催化甲烷生成甲醇的過程中伴隨著外部驅(qū)動力化學能的輸入，促使甲烷單加氧酶亞基之間或亞基中的氨基酸側(cè)鏈之間發(fā)生相對運動[3]，Lippard 教授把甲烷單加氧酶稱為神奇的生物分子機器[4]。

生物分子機器甲烷單加氧酶 (Methanemonooxygenases，MMO) 來自于甲烷氧化菌 (Methanotrophs)。這些細菌是甲基營養(yǎng)型革蘭氏陰性菌，特點是能以甲烷為唯一碳源和能源進行生長繁殖，甲烷氧化菌可用于生產(chǎn)蝦青素、單細胞蛋白、聚β-羥基丁酸等附加值高的產(chǎn)品；此外由于甲烷氧化菌特有的甲烷單加氧酶底物譜較廣使得甲烷氧化菌在重金屬、有機物污染的生物修復方面具有潛在的應用價值[5]，如甲烷單加氧酶在降解鹵代烴過程中起著關(guān)鍵作用[6]；甲烷單加氧酶也能夠在溫和條件下巧妙地催化具有極高鍵能的甲烷C–H鍵(104 kcal/mol) 氧化生成甲醇[7]；甲烷氧化菌和甲烷單加氧酶的這些特性使甲烷氧化菌和甲烷單加氧酶成為研究的熱點[8]。

1 甲烷單加氧酶產(chǎn)生菌

甲烷氧化菌是生物分子機器甲烷單加氧酶的產(chǎn)生菌。荷蘭微生物學家S?hngen于1906年首先發(fā)現(xiàn)了一株可以利用甲烷的細菌，后被命名為甲烷芽胞桿菌[9]。Whittenbury等通過對100多株甲烷氧化菌的研究，初步建立了甲烷氧化菌的分類方案，并根據(jù)形態(tài)學、細胞質(zhì)內(nèi)膜等的精細結(jié)構(gòu)、細菌休眠期的形式等把甲烷氧化菌分成甲基彎曲菌屬甲基孢囊菌屬甲基單胞菌屬甲基桿菌屬甲基球菌屬5個屬[10]。這種分類法提供了甲烷氧化菌的分類框架，它與目前被廣泛接受的分類法很相似。Bowman等利用 16S rRNA系統(tǒng)分析法解決了許多菌種命名的難題[11]?，F(xiàn)在主要根據(jù)碳源同化路徑、細胞質(zhì)內(nèi)膜的顯微結(jié)構(gòu)、脂肪酸碳鏈長度、系統(tǒng)發(fā)育、DNA mol% G+C含量和細菌休眠期形式等把甲烷氧化菌分為Ⅰ型、Ⅱ型和X型[11-12]。Ⅰ型甲烷氧化菌屬于變形桿菌綱γ亞綱，此類甲烷氧化菌的特征是：細胞質(zhì)內(nèi)的膜貫穿細胞形成多氣泡碟片狀束；碳的同化路徑是磷酸核糖路徑；特征性脂肪酸的碳鏈長度為14C和16C[11-14]。II型甲烷氧化菌屬于變形桿菌綱的α亞綱，其特征為：細胞質(zhì)內(nèi)的膜成對齊的線型排布在細胞的外圍；利用絲氨酸路徑同化碳源；特征性脂肪酸的碳鏈長度為18C[11-16]。X型甲烷氧化菌包括和甲基暖菌屬，此類甲烷氧化菌兼有Ⅰ型、Ⅱ型甲烷氧化菌的特性，甲醛的主要代謝途徑是RuMP路徑且有Serine路徑，此類型細菌耐熱性較強[13-14]。

2 甲烷單加氧酶生物分子機器

甲烷的C–H鍵能高，性質(zhì)穩(wěn)定，工業(yè)生產(chǎn)甲烷的條件非常苛刻，反應溫度和壓力甚至分別高達900 ℃和1.1×107Pa[17]。甲烷氧化菌特有的甲烷單加氧酶則能在溫和條件下無污染地實現(xiàn)甲烷到甲醇的轉(zhuǎn)化，并在一系列脫氫酶的作用下生成二氧化碳和水。Lippard教授曾在雜志上發(fā)表過數(shù)篇有關(guān)MMO研究方面的文章，在他的主頁介紹中稱MMO為“Anamazing biomolecular machine” (神奇的生物分子機器)[4]。MMO是甲烷氧化菌的特征酶，可分為2種類型：細胞質(zhì)內(nèi)可溶性甲烷單加氧酶(Soluble methane monooxygenase，sMMO) 和膜結(jié)合的顆粒狀甲烷單加氧酶(Particulate methane monooxygenase, pMMO)，這2類酶都能夠催化甲烷生成甲醇，sMMO可利用的底物范圍較廣泛可以氧化包括芳香族類的化合物，pMMO底物專一性較強，只能氧化短碳鏈化合物[18]。

2.1 可溶性甲烷單加氧酶

sMMO底物范圍寬，不僅能夠氧化甲烷，還可以氧化短鏈烷烴、烯烴及芳香族化合物[19]。sMMO組成復雜，由羥化酶(MMOH)、蛋白B (MMOB) 和還原酶(MMOR) 3個部分蛋白組成。其中MMOH分子量為251 kDa，以α、β、γ三個亞基構(gòu)成的二聚體(αβγ)2形式存在。羥化酶的α亞基具有μ-氧橋雙鐵活性中心。蛋白B分子量為16 kDa，可以調(diào)解sMMO的催化反應，它在MMOH的雙鐵活性中心催化底物羥基化時具有耦合電子的作用；MMOR分子量為 39 kDa，含有雙鐵-雙硫[2Fe-2S]簇和一個輔酶FAD，此部分酶具有還原作用，還原力的來源由NAD(P)H提供[3,17]。

sMMO的基因簇大小為5.5 kb，其排列順序是，它們分別編碼羥化酶的α亞基、羥化酶的β亞基、調(diào)控蛋白B、羥化酶的γ亞基、MMOD 蛋白和還原酶C[19-20]?；蛴址Q基因，它編碼未知功能的MMOD蛋白，Lippard等發(fā)現(xiàn)MMOD蛋白可以緊密地結(jié)合于sMMO上，可能起著傳感器的作用，從而調(diào)節(jié)sMMO的酶活性[21]。Csaki等通過研究莢膜甲基球菌(Bath) sMMO基因，發(fā)現(xiàn)sMMO的轉(zhuǎn)錄依賴位于基因區(qū)的5′位置的σN啟動子，相對pMMO基因來說，sMMO基因的表達需要在低濃度銅離子條件，其機理不能簡單地認為是受銅離子濃度的影響，可能是基因的啟動子需要銅離子作為激活劑[22]。實際上關(guān)于sMMO的調(diào)控存在2種假設(shè)(圖1)：負控調(diào)節(jié)假設(shè)，游離態(tài)抑制劑R具有抑制作用，但在低Cu2+條件下，可結(jié)合Cu2+的調(diào)控子(CBR) 不能結(jié)合Cu2+，因此不能與抑制劑R結(jié)合，不能形成Cu-CBR-A復合物，R起抑制作用，的轉(zhuǎn)錄受到抑制；正控調(diào)節(jié)假設(shè)，游離態(tài)激活劑A具有激活作用，但在高濃度Cu2+條件下，CBR結(jié)合Cu2+，并與A形成Cu-CBR-A復合物，A沒有激活作用，不能轉(zhuǎn)錄[17,23]。

圖1 Methylosinus trichosporium OB3b中pMMO和sMMO的調(diào)控模型[23]

sMMO催化甲烷氧化的過程如圖2所示。sMMO在靜息態(tài)Hox時，羥化酶MMOH的雙鐵中心以Fe2Ⅲ形式存在，在此狀態(tài)下不能鍵合氧氣分子，在還原酶MMOR和蛋白B的存在下，通過NAD(P)H，提供2個電子使之變成還原態(tài)Hred才能與O2結(jié)合，形成O中間態(tài)，然后轉(zhuǎn)變成P*中間態(tài)，并迅速地衰變?yōu)镼態(tài)，雙鐵中心以Fe2IV形式存在，在此狀態(tài)下參與CH4的氧化[3,24-27]。甲烷氧化時關(guān)于C–H鍵的斷裂機制有3種假設(shè)：C–H鍵均裂，形成自由基；C–H鍵異裂，生成碳負離子中間體，碳負離子為了保持穩(wěn)定，它需要結(jié)合到雙鐵中心的一個鐵原子上；C–H鍵斷裂是CH4和Fe–O通過協(xié)同反應的斷裂機理斷裂[17]。至今難以確切判定這3種假設(shè)中哪個是C–H鍵斷裂的機理，也有可能是多種鍵斷裂方式并存。Huang等通過密度泛函理論 (Density functional theory) 進行sMMO羥基化甲烷反應機理的研究，并建立了5個雙鐵模型催化反應機理，發(fā)現(xiàn)4個協(xié)同的雙鐵模型是甲烷羥基化反應最有效的模型，此模型涉及到自由基和非自由基中間體反應機理[28]。Lippard等研究了MMOB在sMMO催化甲烷氧化的作用機制，揭示了MMOB的調(diào)控原理：MMOB通過其Asp36-Leu129氨基酸殘基，錨定在2個MMOH的由α2β2形成的峽谷區(qū)，MMOB的長N-末端尾巴鏈接在MMOH的α亞基上，形成MMOH-MMOB復合體，MMOB的Tyr8和Ser111氨基酸殘在空間上誘導MMOH的E α-螺旋的側(cè)鏈移近雙鐵活性中心，引起了MMOH構(gòu)象的改變，因此可以控制質(zhì)子、甲烷和氧氣接近活性位點[3,27]。MMO這種精巧細致的多亞基協(xié)同催化機制，給我們對體內(nèi)外生物分子機器的構(gòu)建提供了重要的借鑒意義。

2.2 顆粒性甲烷單加氧酶

顆粒性甲烷單加氧酶(pMMO) 是一種含銅原子的膜結(jié)合蛋白[29-30]。pMMO除了能氧化甲烷外，還可以氧化C2–C5的C-2位置的C–H鍵生成相應的醇或氧化相應的烯烴生成環(huán)氧乙烷[31]。pMMO存在于絕大多數(shù)甲烷氧化菌中，其編碼基因在高銅離子濃度下轉(zhuǎn)錄。關(guān)于pMMO的首次報道是在20世紀70年代中期，相對sMMO來說pMMO底物范圍窄，只能氧化碳鏈長度小于5C的烷烴和烯烴，關(guān)于它的研究相對較少，原因是pMMO酶活性比較低且暴露在空氣中極不穩(wěn)定[17,23]。pMMO由羥化酶(pMMOH) 和還原酶(pMMOR) 2部分組成，羥化酶含有3個亞基分別為α (PmoB)、β (PmoA) 和 γ (PmoC)，3個亞基的分子量分別為45、27和23 kDa。pMMOR由分子量分別為63和8 kDa的蛋白構(gòu)成，pMMO以三聚體(αβγ)3形式存 在[23,32]。pMMO的活性中心已經(jīng)證實包含金屬元素，一般認為pMMO含有2個金屬位點：一個是位于PmoB亞基的雙銅中心，一個是位于PmoC亞基的可變金屬位點中心[33]，但是人們對于金屬元素的種類(Cu, Fe, Zn) 和數(shù)目存在很大的爭議[17,19,34]。Bollinger等綜述了pMMO中可能存在的金屬種類和數(shù)目，從pMMO的晶體結(jié)構(gòu)分析，活性中心的金屬元素可能存在于PmoA亞基的三銅簇，或是存在于PmoC亞基的雙鐵簇，或是存在于PmoB亞基的三銅簇[35]。

圖2 MMOH催化底物氧化的循環(huán)過程示意圖[19]

pMMO酶的編碼基因是，對應編碼pMMO的γ、β和α亞基，此操縱子的轉(zhuǎn)錄需要σ70作為啟動子[23]。研究者已經(jīng)完成2種不同類型的甲烷氧化菌.(Bath) 和.(OB3b) 的pMMO基因測序，其相似度>99%[23,36]。MMO的表達都受銅離子濃度的影響，銅離子的濃度不僅決定了sMMO或pMMO基因是否表達，而且對2種不同類型的甲烷單加氧酶的表達量也具有影響[37]。相對于sMMO而言，pMMO的表達需要在較高銅離子濃度的條件。調(diào)控機理示意圖如圖1所示，關(guān)于pMMO轉(zhuǎn)錄調(diào)控有2個假說：負控調(diào)節(jié)假設(shè)，游離態(tài)抑制劑R具有抑制活性，但低Cu2+濃度條件下，CBR不能結(jié)合Cu2+，因此不能與抑制劑R結(jié)合，不能形成Cu-CBR-R復合物，R結(jié)合到上游的操縱基因區(qū)，的轉(zhuǎn)錄受到抑制；正控調(diào)節(jié)假設(shè)，激活劑在形成Cu-CBR-A復合物時具有激活作用，高Cu2+濃度下，激活劑A與Cu-CBR結(jié)合后，形成Cu-CBR-A復合物，具有激活作用，可以轉(zhuǎn)錄[17,23]。

研究者們認為pMMO的活性位點位于pmoB亞基的可溶性N末端區(qū)域[38]。關(guān)于pMMO的催化反應機理，一些學者提出了自己的觀點。Wang等通過比較pMMO和重組的pmoB亞基與氧化劑O2或H2O2的催化反應，通過譜峰分析等證明pMMO的氧氣結(jié)合位點在pmoB的可溶部分的雙銅離子中心[39]。Li等認為pMMO催化的甲烷羥基化反應是自由基重排反應，活性中心在雙銅離子中心，C–H鍵的斷裂是速度限制步驟，然而Li等、Shiota等認為在雙銅離子中心附近的蘇氨酸殘基提供一個氫原子配位過氧化二銅，形成一個氧化和一個羥基化的銅，從而羥基化甲 烷[40-41]。Sirajuddin等對pMMO晶體結(jié)構(gòu)衍射分析，在分辨率為2.6?條件下發(fā)現(xiàn)pMMO結(jié)構(gòu)中很可能存在2個Zn2+抑制位點，一個在pmoC亞基中，另一個在pmoC亞基的胞質(zhì)側(cè)，他們的研究結(jié)果表明Zn2+可能通過抑制質(zhì)子的傳遞來抑制pMMO活性[42]。pMMO催化甲烷生成甲醇的反應機理爭議較大，原因可能是一方面由于pMMO暴露在空氣中極不穩(wěn)定給研究帶來困難，另一方面由于pMMO結(jié)構(gòu)比較復雜。

3 展望

生物分子機器甲烷單加氧酶，能夠在溫和的條件下將甲烷氧化成甲醇，如果能夠有效地抑制甲醇脫氫酶的活性，如添加氯化銨、EDTA等[43]，減弱甲烷氧化菌中甲醇的進一步氧化，則可能實現(xiàn)生物法生產(chǎn)甲醇，節(jié)約工業(yè)甲醇合成時的能耗。Furuto等利用甲基彎菌OB3b發(fā)酵生產(chǎn)甲醇，發(fā)酵液甲醇的濃度達到6 mmol/L[44]；邢新會課題組利用膜反應器進一步將發(fā)酵液甲醇的濃度提高到35 mmol/L[45]。甲烷氧化菌也可用于生產(chǎn)蝦青素、單細胞蛋白、聚β-羥基丁酸等附加值高的產(chǎn)品，此外由于甲烷單加氧酶底物譜較廣使得甲烷氧化菌在重金屬、有機物污染的生物修復方面具有潛在的應用價值[5]。雖然用生物分子機器甲烷單加氧酶氧化甲烷生產(chǎn)甲醇還存在許多難題，但是我們可能尋找到一些策略來增加甲醇的生產(chǎn)效率。例如找到甲烷單加氧酶的關(guān)鍵基因，通過構(gòu)建工程菌高效表達甲烷單加氧酶，在體內(nèi)外進行催化反應；通過生物信息學分析，定點突變基因，篩選出高酶活菌株等。生物分子機器甲烷單加氧酶復雜精巧的催化反應機制巧妙地催化甲烷氧化成甲醇，也體現(xiàn)了具有生物活性的大分子催化劑的復雜和精巧的特點[3]，這些特性對合成生物學、催化劑或分子生物學中生物分子機器設(shè)計具有啟發(fā)和借鑒意義。一些科學家通過模仿MMO的催化機理設(shè)計出具有類似MMO活性位點的人造催化劑如3N配體二鐵復合物、銅激活的Fe-ZSM-5、Cu-ZSM-5、μ-氮二鐵酞菁、三銅復合物等，它們可在較溫和的條件下催化烷烴生成醇或降解鹵代烴[7,46-52]，這對于生產(chǎn)甲醇的工藝開發(fā)或鹵代烴污染物的治理提供了新的方法和思路。

[1] Huang TJ, Juluri BK. Biological and biomimetic molecular machines. Nanomedicine, 2008, 3(1): 107–124.

[2] Balzani V, Credi A, Raymo FM, et al. Artificial molecular machines. Angew Chem Int Ed, 2000, (19): 3349–3391.

[3] Lee SJ, McCormick MS, Lippard SJ, et al. Control of substrate access to the active site in methane monooxygenase. Nature, 2013, 494(21): 380–385.

[4] MIT Chemistry Directory: Stephen J. Lippard [EB/OL]. [2014-12-31]. http://chemistry.mit.edu/ people/lippard-stephen.

[5] Pandey VC, Singh JS, Singh DP, et al. Methanotrophs: promising bacteria for environmental remediation. Int J Environ Sci Te, 2014, 11(1): 241–250.

[6] Xing ZL, Zhang LJ, Zhao TT. Advances in degradation of chlorinated hydrocarbons by obligate and facultative methanotrophs. Chin J Biotech, 2014, 30(4): 531–544 (in Chinese).邢志林, 張麗杰, 趙天濤. 專一營養(yǎng)與兼性甲烷氧化菌降解氯代烴的研究現(xiàn)狀、動力學分析及展望. 生物工程學報, 2014, 30(4): 531–544.

[7] Chan SI, Lu YJ, Nagababu P, et al. Efficient oxidation of methane to methanol by dioxygen mediated by tricopper clusters. Angew Chem Int Edit, 2013, 52(13): 3731–3735.

[8] Lee JH, Kim TG, Cho KS. Isolation and characterization of a facultative methanotroph degrading malodor-causing volatile sulfur compounds. J Hazard Mater, 2012, 235(10): 224–229.

[9] Theisen AR, Murrell JC. Facultative methanotrophs revisited. J Bacteriol, 2005, 187(13): 4303–4305.

[10] Whittenbury R, Phillips KC, Wilkinson JF. Enrichment, isolation and some properties of methane-utilizing bacteria. J Gen Microbiol, 1970, 61(2): 205–218.

[11] Bowman J. The methanotrophs-the familiesand. Prokaryotes, 2006, 5(1): 266–289.

[12] Bowman JP, Sly LI, Nichols PD, et al. Revised taxonomy of the methanotrophs-description of, emendation of, validation ofandspecies, and a proposal that the familyincludes only the Group-I methanotrophs. Int J Syst Bacteriol, 1993, 43(4): 735–753.

[13] Semrau JD, DiSpirito AA, Yoon S. Methanotrophs and copper. FEMS Microbiol Rev, 2010, 34(4): 496–531.

[14] Murrell JC. Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology: the Aerobic Methane Oxidizing Bacteria (Methanotrophs). Berlin Heidelberg: Springer-Verlag, 2010: 1953–1966.

[15] Park D, Lee J. Biological conversion of methane to methanol. Korean J Chem Eng, 2013, 30(5): 977–987.

[16] Jiang H, Chen Y, Murrell JC, et al. Methanotrophs: multifunctional bacteria with promising applications in environmental bioengineering. Biochem Eng J, 2010, 49(3): 277–288.

[17] Dalton H. The leeuwenhoek lecture 2000-the natural and unnatural history of methane-oxidizing bacteria. Phil Trans R Soc B, 2005, 360(1458): 1207–1222.

[18] Xu N, Xin JY, Wang Y, et al. Research advances of methane monooxygenase. Lett Biotechnol, 2013, 24(1): 130–133 (in Chinese).徐寧, 辛嘉英, 王艷, 等. 甲烷單加氧酶的研究進展. 生物技術(shù)通訊, 2013, 24(1): 130–133.

[19] Trotsenko YA, Murrell JC. Metabolic aspects of aerobic obligate methanotrophy. Adv Appl Microbiol, 2008, 63(1): 183–229.

[20] Hua SF, Song YY, Li SB, et al. Sequencing analysis of 16S rDNA and soluble methane monooxygenase genes from a methanotrophIMV 3011. Ann Microbiol, 2011, 61(2): 391–396.

[21] Merkx M, Lippard SJ. Why? characterization of MMOD, a long overlooked component of the soluble methane monooxygenase from(Bath). J Biol Chem, 2002, 277(8): 5858–5865.

[22] Csaki R, Bodrossy L, Kovacs KL, et al. Genes involved in the copper-dependent regulation of soluble methane monooxygenase of(Bath): cloning, sequencing and mutational analysis. Microbiol-SGM, 2003, 149(7): 1785–1795.

[23] Murrell JC, McDonald IR, Gilbert B. Regulation of expression of methane monooxygenases by copper ions. Trends Microbiol, 2000, 8(5): 221–225.

[24] Banerjee R, Meier KK, Munck E, et al. Intermediate P* from soluble methane monooxygenase contains a diferrous cluster. Biochemistry-Us, 2013, 52(25): 4331–4342.

[25] Tinberg CE, Lippard SJ. Revisiting the Mechanism of Dioxygen Activation in Soluble Methane Monooxygenase from(Bath): Evidence for a Multi-Step, Proton-Dependent Reaction Pathway. Biochemistry-Us, 2009, 48(51): 12145–12158.

[26] Gherman BF, Dunietz BD, Lippard SJ, et al. Activation of the C-H bond of methane by intermediate Q of methane monoozygenase: a theoretical study. J Am Chem Soc, 2001, 123(16): 3836–3837.

[27] Wang WX, Iacob RE, Lippard SJ, et al. Electron transfer control in soluble methane monooxygenase. J Am Chem Soc, 2014, 136(27): 9754–9762.

[28] Huang SP, Shiota Y, Yoshizawa K. DFT study of the mechanism for methane hydroxylation by soluble methane monooxygenase (sMMO): effects of oxidation state, spin state, and coordination number. Dalton Trans, 2013, 42(4): 1011–1123.

[29] Culpepper MA, Cutsail GE, Rosenzweig AC, et al. Identification of the valence and coordination environment of the particulate methane monooxygenase copper centers by advanced EPR characterization. J Am Chem Soc, 2014, 136(33): 11767–11775.

[30] Tavormina PL, Ussler W, Orphan VJ, et al. Abundance and distribution of diverse membrane-bound monooxygenase (Cu-MMO) genes within the Costa Rica oxygen minimum zone. Env Microbiol Rep, 2013, 5(3): 414–423.

[31] Chen YS, Luo WI, Chiang CH, et al. Controlled oxidation of aliphatic C-H bonds in metallo-monooxygenases: mechanistic insights derived from studies on deuterated and fluorinated hydrocarbons. J Inorg Biochem, 2014, 134(5): 118–133.

[32] Dispirito A, Gulledge J, Krema C, et al. Trichloroethylene oxidation by the membrane-associated methane monooxygenase in type I, type II and type X methanotrophs. Biodegradation, 1991, 2(3): 151–164.

[33] Liew EF, Tong DC, Holmes AJ, et al. Mutagenesis of the hydrocarbon monooxygenase indicates a metal centre in subunit-C, and not subunit-B, is essential for copper-containing membrane monooxygenase activity. Microbiol-SGM, 2014, 160(6): 1267–1277.

[34] Lieberman RL, Rosenzweig AC. Biological methane oxidation: regulation, biochemistry, and active site structure of particulate methane monooxygenase. Crit Rev Biochem Mol, 2004, 39(3): 147–164.

[35] Bollinger JM. Biochemistry getting the metal right. Nature, 2010, 465(6): 40–41.

[36] Murrell JC, Gilbert B, McDonald IR. Molecular biology and regulation of methane monooxygenase. Arch Microbiol, 2000, 173(5): 325–332.

[37] Ho A, Luke C, Frenzel P, et al. Selective stimulation in a natural community of methane oxidizing bacteria: effects of copper on pmoA transcription and activity. Soil Biol Biochem, 2013, 65(10): 211–216.

[38] Lawton TJ, Ham J, Rosenzweig AC, et al. Structural conservation of the B subunit in the ammonia monooxygenase/particulate methane monooxygenase superfamily. Proteins, 2014, 82(9): 2263–1167.

[39] Wang WX, Lippard SJ. Diiron oxidation state control of substrate access to the active site of soluble methane monooxygenase mediated by the regulatory component. J Am Chem Soc, 2014, 136(6): 2244–2247.

[40] Li CQ, Yang HQ, Hu CW, et al. Hydroxylation mechanism of methane and its derivatives over designed methane monooxygenase model with peroxo dizinc core. Org Biomol Chem, 2012, 10(19): 3924–3931.

[41] Shiota Y, Juhasz G, Yoshizawa K. Role of tyrosine residue in methane activation at the dicopper site of particulate methane monooxygenase: a density functional theory study. Inorg Chem, 2013, 52(14): 7907–7917.

[42] Sirajuddin S, Barupala D, Rosenzweig AC, et al. Effects of zinc on particulate methane monooxygenase activity and structure. J Biol Chem, 2014, 289(31): 21782–21794.

[43] Han JS, Ahn CM, Kim CG, et al. Partial oxidative conversion of methane to methanol through selective inhibition of methanol dehydrogenase in methanotrophic consortium from landfill cover soil. Appl Biochem Biotech, 2013, 171(6): 1487–1499.

[44] Furuto T, Takeguchi M, Okura I. Semicontinuous methanol biosynthesis byOB3b. J Mol Catal A-Chem, 1999, 144(2): 257–261.

[45] Duan CH, Luo MF, Xing XH. High-rate conversion of methane to methanol byOB3b. Bioresour Technol, 2011, 102(15): 7349–7353.

[46] Hammond C, Forde MM, Jenkins RL, et al. Direct catalytic conversion of methane to methanol in an aqueous medium by using copper-promoted fe-zsm-5. Angew Chem Int Ed, 2012, 51(21): 5129–5133.

[47] Shan JJ, Huang WX, Li YY, et al. Conversion of methane to methanol with a bent mono (mu-oxo) dinickel anchored on the internal surfaces of micropores. Langmuir, 2014, 30(28): 8558–8569.

[48] Chen PPY, Nagababu P, Chan SI, et al. Development of the tricopper cluster as a catalyst for the efficient conversion of methane into MeOH. Chemcatchem, 2014, 6(2): 429–437.

[49] Sankaralingam M, Palaniandavar M. Diiron(III) complexes of tridentate 3N ligands as functional models for methane monooxygenases: effect of the capping ligand on hydroxylation of alkanes. Polyhedron, 2014, 67(1): 171–180.

[50] Colomban C, Kudrik EV, Sorokin AB, et al. Degradation of chlorinated phenols in water in the presence of H2O2 and water-soluble mu-nitrido diiron phthalocyanine. Catal Today, 2014, 235(10): 14–19.

[51] Stoian SA, Xue GQ, Munck E, et al. Spectroscopic and theoretical investigation of a complex with an [O=Fe-IV-O-Fe-IV=O] core related to methane monooxygenase intermediate Q. J Am Chem Soc, 2014, 136(4): 1545–1558.

[52] Sheppard T, Hamill CD, Thompson JM, et al. A low temperature, isothermal gas-phase system for conversion of methane to methanol over Cu-ZSM-5. Chem Commun, 2014, 50(75): 11053–11055.

(本文責編 陳宏宇)

Advances in biomolecular machine: methane monooxygenases

Jixue Lu1, Shizhen Wang1,2, and Baishan Fang1,2

1,,361005,,2,361005,,

Methane monooxygenases (MMO), regarded as “an amazing biomolecular machine”, catalyze the oxidation of methane to methanol under aerobic conditions. MMO catalyze the oxidation of methane elaborately, which is a novel way to catalyze methane to methanol. Furthermore, MMO can inspire the biomolecular machine design. In this review, we introduced MMO including structure, gene and catalytic mechanism. The history and the taxonomy of MMO were also introduced.

methane monooxygenases, biomolecular machine, methanotrophs, mechanism, methane

October 28, 2014;

January 19, 2015

National Natural Science Foundation of China (Nos. 21336009, 41176111, 41306124), the Fundamental Research Funds for the Central Universities (No. 2013121029).

Baishan Fang. Tel: +86-592-2185869; E-mail: fbs@xmu.edu.cn

國家自然科學基金 (Nos. 21336009, 41176111, 41306124), 中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金(No. 2013121029) 資助。