譚紅妍，閆瑞瑞，閆玉春，陳寶瑞，辛曉平＊

（1.中國農業(yè)科學院資源區(qū)劃所，北京100081；2.呼倫貝爾草原生態(tài)系統(tǒng)國家野外科學觀測研究站，北京100081）

土壤微生物群落是草地地下生態(tài)系統(tǒng)的重要組成成分，其不僅是土壤養(yǎng)分重要的“源”和“庫”，而且介導許多控制碳氮循環(huán)的關鍵過程，在草地生態(tài)系統(tǒng)過程和功能的維持中扮演著至關重要的角色［1－2］。微生物生命周期短，對生存的微環(huán)境十分敏感，土壤微生物群落成為判別干擾條件下土壤生態(tài)系統(tǒng)狀態(tài)的重要生物學指標。脂類物質是構成活體微生物細胞膜的主要成分，它在細胞中含量穩(wěn)定約占細胞干重的5%，PLFA即為甲基化土壤中提取磷脂成分后得到的脂肪酸產物［3］。不同的微生物通過不同的代謝途徑形成不同的PLFA，可以作為一種生物標記來鑒定土壤中微生物的種類和豐富度。近年來，PLFA技術以其快速、準確、重現(xiàn)性好、對試驗條件要求較低等優(yōu)點［4］，被廣泛用于土壤中微生物群落結構的動態(tài)監(jiān)測。

放牧是草地的主要利用方式之一，對土壤微生物乃至整個土壤生態(tài)系統(tǒng)都有深遠影響。適度放牧有助于土壤微生物數(shù)量的增加，過度放牧會導致微生物數(shù)量明顯減少；真菌和細菌對放牧強度的響應比放線菌更為敏感［5－6］，隨著放牧強度的增加，真菌、細菌數(shù)量顯著下降，放線菌數(shù)量升高。趙帥等［7］發(fā)現(xiàn)放牧干擾下土壤微生物的PLFAs種類發(fā)生改變，細菌與真菌PLFAs比值顯著升高，革蘭氏陽性菌與陰性菌PLFAs含量比值顯著下降。Clegg［8］對英格蘭西南一草地研究發(fā)現(xiàn)，放牧可以顯著提高革蘭氏陽性菌和陰性菌的PLFAs含量，放線菌與真菌的指示性PLFAs變化不顯著。而Ingram等［9］在美國懷俄明州北部的一個半干旱混合草地研究不同放牧強度對微生物群落結構的影響時發(fā)現(xiàn)，不同處理并沒有使表征各微生物類群 的PLFAs含量發(fā)生顯著變化，在輕度放牧區(qū)總PLFAs含量略高。

放牧對地上植被的影響研究的報道較多，對土壤性狀影響的研究也有一些報道，但大多數(shù)的研究內容都局限在土壤三大類群微生物（細菌、真菌、放線菌）的數(shù)量、土壤酶活性等研究上。本研究立足于呼倫貝爾草原連續(xù)5年的肉?？刂品拍翗拥?，采用磷脂脂肪酸技術研究不同放牧強度對土壤微生物群落結構的影響，旨在揭示長期放牧下土壤微生物多樣性及群落結構的演變狀況，為深入了解放牧系統(tǒng)地下生態(tài)學過程、合理利用草地資源提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

本研究在中國農業(yè)科學院呼倫貝爾草地生態(tài)系統(tǒng)試驗站的肉?？刂品拍翗拥刂羞M行。研究點位于呼倫貝爾市謝爾塔拉牧場場部東3km，屬于大興安嶺西麓丘陵向內蒙古高原的過渡區(qū)，地理位置為49°32′－49°34′N，119°94′－119°96′E，海拔670～677m。研究區(qū)屬于溫帶半干旱大陸性氣候，年均溫－3～1℃，≥10℃年積溫1580～1800℃，無霜期110d左右，年平均降水量350～400mm，降水期多集中在7－9月。土壤為暗栗鈣土。植被類型為羊草＋雜草類，主要物種有羊草（Leymuschinensis）、裂葉蒿（Artemisiaincise）、苔草（Carextristachva）、貝加爾針茅（Stipabaicalensis）、展枝唐松草（Thalictrumsquarrosum）、日蔭菅（Carexpediformis）、蓬子菜（Galiumverum）、麻花頭（Serratulacentauroides）等，伴生種有狹葉柴胡（Bupleurumscorzonerifolium）、斜莖黃芪（Astragalusadsuigens）、山野豌豆（Viciaamoena）、草地早熟禾（Poapratensis）等。

1.2 試驗設計及樣品采集

放牧樣地共存在6個水平的放牧梯度處理，載畜率分別為 G0.00：0.00Au／hm2、G0.23：0.23Au／hm2、G0.34：0.34Au／hm2、G0.46：0.46Au／hm2、G0.69：0.69Au／hm2、G0.92：0.92Au／hm2。其中以500kg肉牛為一個標準家畜肉牛單位，用250～300kg的放牧肉牛頭數(shù)來控制不同的放牧強度，6個放牧梯度肉牛頭數(shù)分別為0，2，3，4，6，8頭，共用69頭肉牛。每種處理3個重復，共包括15個放牧區(qū)和3個對照封育區(qū)。各處理的分布遵循隨機區(qū)組試驗設計原則，每個小區(qū)為300m×160m，試驗區(qū)總面積90hm2（包括牧道），具體設計見圖1。從2009年開始，每年6月中旬開始放牧，10月中旬結束，為期120d。整個放牧期肉牛日夜均在放牧區(qū)，肉牛飲水通過拉水供應。

本項研究中選取了4個放牧強度：對照區(qū)G0.00、輕度放牧 G0.23、中度放牧 G0.46、重度放牧 G0.92，野外采樣時間為2013年08月15日至19日。每個試驗小區(qū)隨機設置3個采樣點，每個采樣點用直徑5cm的土鉆取0～20cm土壤（3點混合），剔除石塊和土壤中的動植物殘體后，采用“四分法”保留約500g土樣。一部分土樣帶回實驗室后立即過2mm篩保存于－80℃超低溫冰箱；另一部分土樣自然風干，用于測定土壤基本養(yǎng)分。

圖1 肉牛不同放牧強度試驗平面圖Fig.1 Design diagram of cattle different grazing gradients

表1 估算微生物生物量的脂肪酸Table 1 PLFA for calculating soil microbial biomass

1.3 分析指標與方法

1.3.1 土壤磷脂脂肪酸提取與分析 將置于超低溫冰箱中的土樣放入超低溫冷凍干燥機中處理后，取3.00g左右的凍干土，利用Blight／Dyer法通過氯仿－甲醇－檸檬酸緩沖液震蕩提取總脂，經SPE柱層析分離得到磷脂脂肪酸；將得到的磷脂脂肪酸甲酯化。PLFA的定性與定量分析用HP6890氣相色譜和Sherlock軟件，以正十九烷脂肪酸甲酯為內標物。各類群微生物標記如表1所示。命名法采用X：YωZ，其中X是指主鏈碳原子個數(shù)；Y為雙鍵個數(shù)；Z為甲基鏈離雙鍵的位置。i，a，Me分別表示異構、反異構、甲基支鏈，cy表示環(huán)丙基。

1.3.2 土壤基本養(yǎng)分分析 土壤有機質用重鉻酸鉀容量法—外加熱法進行測定；全磷采用NaOH熔融－鉬銻抗比色法；全氮采用半微量凱氏定氮法；土壤pH采用電位法；速效磷采用0.5mol／L NaHCO3浸提－鉬銻抗比色法；速效鉀采用NH4OAC浸提－火焰光度法；堿解氮采用1.0mol／L NaOH堿解擴散法［16］。

1.4 數(shù)據(jù)分析

微生物群落結構用CANOCO 4.5中的除趨對應分析（detrended correspondence analysis，DCA）并作圖。其余數(shù)據(jù)用SPSS 20.0分析，Excel作圖。

2 結果與分析

2.1 不同放牧強度下溫性草甸草原土壤中所含PLFA的特征

本實驗共檢測出44種磷脂脂肪酸生物標記，其中G0.23處理下PLFA種類最多，G0.92處理下最少。不同放牧強度下土壤的PLFA種類存在明顯差異，比如15：0iso 3OH 與18：1 2OH 為 G0.23放牧處理所特有，16：1ω9c為G0.46放牧處理所特有。但4個放牧梯度下優(yōu)勢類群并未發(fā)生改變，均為16：00、16：0 10－methyl、18：1ω7c、19：0 cycloω8c，它們含量之和所占比例分別為36.06%，35.00%，36.84%，34.80%。表明不同放牧強度下磷脂脂肪酸組成改變，即放牧改變了土壤微生物的區(qū)系組成和豐富度，卻不會影響優(yōu)勢菌的地位（表2）。

2.2 不同放牧強度對土壤微生物各菌群生物量的影響

微生物區(qū)系組成中，細菌比例最高，其次為放線菌、真菌、AMF。不同放牧強度下，各大類微生物的特征標記PLFAs含量發(fā)生了改變（圖2）。土壤總微生物量隨著放牧強度的增加表現(xiàn)為先減少后增加的趨勢，即為對照區(qū)最高，中度放牧G0.46最低，重度放牧G0.92出現(xiàn)小幅度的回升；細菌、革蘭氏陰性菌、腐生真菌、AMF生物量也呈現(xiàn)相同變化。革蘭氏陽性菌、放線菌生物量則隨著放牧強度的增加而增加（表3）。此外，AMF對于放牧干擾最為敏感（各放牧強度下極顯著差異P＜0.01）。

表2 不同放牧強度下土壤微生物主要磷脂脂肪酸構成特征（平均值±標準誤）Table 2 The profiles of main PLFAs of microbes in soils from different grazed degrees（Mean±SE）nmol／g

2.3 不同放牧強度對土壤微生物群落結構的影響

為了更直觀了解不同放牧強度下土壤微生物群落的分布格局，對36個土樣和主要的磷脂脂肪酸進行排序，其中前兩個排序軸的特征值分別為0.526和0.167，累積貢獻率之和為78.3%。排序圖基本上能將4個放牧輕度的樣方區(qū)分開，輕度放牧G0.23同對照區(qū)G0.00群落結構較為相似，中度放牧G0.46同重度放牧G0.92群落結構較為相似。表明當放牧干擾超過某一強度時，會引起土壤微生物群落結構大幅度的變化。

表3 不同放牧強度下土壤各微生物類群生物量（平均值±標準誤）Table 3 The microbial groups PLFAs content from different grazed degrees（Mean±SE）nmol／g

圖3為主要磷脂脂肪酸在除趨勢對應分析中的因子載荷分析結果。第一排序軸上的載荷值較高的脂肪酸可以分為兩類，表征真菌的脂肪酸（18：2ω6、16：1ω5）和表征革蘭氏陰性菌的脂肪酸（17：1ω8、18：1ω9、18：1ω7），它們隨著放牧強度的增加而減少。表征革蘭氏陽性菌的脂肪酸（a17：0、a15：0、i14：0、i15：0、i16：0）和表征放線菌的脂肪酸（10Me18：0、10Me17：0、10Me16：0）在兩排序軸載荷值都較低，說明這幾種脂肪酸在中度放牧 G0.46含量最低。

2.4 各菌群PLFAs含量與土壤基本養(yǎng)分相關性分析

通過對各菌群PLFAs含量與土壤養(yǎng)分相關性分析表明（表4），土壤總PLFAs含量和細菌、真菌、革蘭氏陰性菌、叢枝菌根真菌的PLFAs含量均同有機質、全磷、速效磷、速效鉀呈顯著正相關（P＜0.05），尤其是腐生真菌、叢枝菌根真菌的PLFAs與有機質、速效磷相關水平達到了極顯著程度（P＜0.01）。由此說明真菌和AMF可用作評價土壤肥力與健康的生物指標，同時有機質、速效磷是影響微生物數(shù)量和種類的重要養(yǎng)分因素。相關分析結果還顯示，革蘭氏陽性菌、放線菌PLFAs含量同大多數(shù)養(yǎng)分指標成負相關，各菌群PLFAs含量與全氮、堿解氮、pH間無顯著相關性。

圖2 不同放牧梯度下土壤微生物群落PLFA的除趨勢對應分析Fig.2 Detrended correspondence analysis of PLFA profiles from soil microbialcommunities of different grazed degrees

圖3 不同放牧梯度下土壤微生物群落PLFA載荷因子貢獻Fig.3 Eigenvector loadings of PLFA contributing to soil communities ordination pattern of different grazed degrees

表4 PLFAs與土壤養(yǎng)分相關性分析Table 4 Correlation between soil PLFAs content and soil nutrients

3 討論

放牧干擾既引起植物生產力的下降，也降低了植物多樣性。生產力下降導致地上的葉凋落物、地下死亡根系的凋落物和根系分泌物的減少，使得微生物可利用營養(yǎng)物減少［17］，最終引起微生物數(shù)量的下降。物種多樣性降低會引起植物產物的改變和凋落物有機組分的變化［18－22］，從而影響微生物群落的組成和功能。與王啟蘭等［20］、Raiesi和Asadi［22］研究結果一致：隨著放牧壓力的增大，土壤總微生物顯著下降。放牧顯著降低了地上生物量和活根生物量，微生物分解底物減少。此外，植被蓋度的下降以及牲畜的過度踐踏，引起土壤的含水量、透水性和透氣性的下降［20］，土壤微環(huán)境遭到破壞，也會降低微生物的繁殖速率。

不同菌群微生物因自身生長繁殖特性不同，對放牧干擾存在不同的響應。革蘭氏陰性菌與腐生真菌生物量的下降，干擾的機制可能是：通過改變土壤環(huán)境來直接影響微生物生長，比如有機質含量、養(yǎng)分的有效性［2］，并且家畜活動會嚴重破壞腐生真菌的菌絲。而在重度放牧G0.92中，革蘭氏陰性菌、真菌、AMF和總微生物量都出現(xiàn)小幅回升，原因可能在于不穩(wěn)定基質（尿液與糞便）的輸入為微生物提供易利用的營養(yǎng)元素，適當?shù)卮龠M微生物生長［21］。此外，本研究中 AMF生物量在4個放牧強度下極顯著差異（P＜0.01）。Jansa等［23］和Schnoor等［24］曾采用PLFA技術研究不同微生物菌群對外界干擾響應時也發(fā)現(xiàn)：AMF對干擾反映最為敏感。AMF與植物是共生關系，植物物種的變化對其影響最為顯著。羊草為該研究區(qū)的主要優(yōu)勢種，也是牲畜較為喜歡的牧草之一。牧壓的增加必然會引起羊草優(yōu)勢度的顯著下降，那么與羊草存在共生關系的AMF因菌絲結構的破壞，其生物量定會顯著下降。有研究指出［24］，放牧干擾引起活根生物量的變化是影響微生物群落改變的主要原因，其中AMF為典型代表。隨放牧強度的增加，革蘭氏陽性菌和放線菌生物量呈現(xiàn)出增加的趨勢，同多數(shù)文獻研究結果不太一致，有待于進一步驗證。Klumpp等［25］在尋找高強度放牧導致土壤碳丟失的原因時，指出高強度的干擾通過影響植物根系及由它們控制的微生物，加快了土壤中營養(yǎng)元素的循環(huán)。是不是可以有這樣一種猜測：高強度放牧使得營養(yǎng)循環(huán)效率提高的原因在于，革蘭氏陽性菌和放線菌生物量的增加？

DCA分析結果表明，過度放牧會引起土壤微生物群落結構的顯著改變。本研究中取土深度為0～20cm，微生物大部分屬于根際微生物［19］。微生物群落能夠利用的能源物質主要為根際沉積物（根系分泌物、脫落根細胞、根殘體），不同植物根系沉積物元素組成差異很大［26］，最終引起異養(yǎng)微生物群落結構和功能的變化。當存在外部干擾時，植物將更多的營養(yǎng)元素分配給地下部分，根系各種元素的相對含量也會發(fā)生變化［27］。有機質、速效磷與微生物菌群極顯著正相關，是微生物生長和活性的主要營養(yǎng)因子，可能植物本身碳、磷含量是影響微生物種類和數(shù)量的生物因素。

4 結論

放牧改變了土壤微生物的組成，但不影響功能菌的優(yōu)勢地位。土壤總微生物量隨著放牧強度的增加表現(xiàn)為先減少后增加的趨勢，即為對照區(qū)最高，中度放牧最低，重度放牧出現(xiàn)小幅度的回升；細菌、革蘭氏陰性菌、腐生真菌、AMF生物量也呈現(xiàn)相同變化。革蘭氏陽性菌、放線菌生物量則隨著放牧強度的增加而增加。此外，AMF對于放牧干擾最為敏感（各放牧強度下極顯著差異P＜0.01）。除趨勢對應分析結果表明，對照區(qū)和輕度放牧處理下土壤的微生物群落結構較為相似，中度放牧和重度放牧處理導致微生物群落結構發(fā)生大幅度改變。有機質、速效磷是影響微生物種類和數(shù)量的重要養(yǎng)分因素。

Reference：

［1］Bach E M，Baer S G，Meyer C K，etal.Soil texture affects soil microbial and structural recovery during grassland restoration.Soil Biology and Biochemistry，2010，42（12）：2182－2191.

［2］M?rtensson L，Olsson P A.Reductions in microbial biomass along disturbance gradients in a semi－natural grassland.Applied Soil Ecology，2012，62：8－13.

［3］Wu Y P.Studies on soil microbial community structure based on phospholipid fatty acid（PLFA）analysis［D］.Hangzhou：Zhejiang University，2009.

［4］Zhang Q F，Liu B，Lin Y Z，etal.The diversity of phospholipid fatty acid（PLFA）biomarker for the microbial community in soil.Acta Ecologica Sinica，2006，29（8）：4127－4137.

［5］Yan R R，Yan Y C，Xin X P，etal.Changes in microorganisms and enzyme antivities in soil under different grazing intensities in meadow steppe，Inner Mongolia.Ecology and Environmental Sciences，2011，20（2）：259－265.

［6］Zhang C X，Nan Z B.Changeable characteristics of three soil microbial groups under different grazing intensities in Loess Plateau.Pratacultural Science，2010，27（11）：131－136.

［7］Zhang S，Zhang J N，Lai X，etal.Analysis of microbial biomass C，N and soil microbial community struture ofStipasteppes using PLFA at grazing and fenced in Inner Mongolia，China.Journal of Agro－Environment Science，2011，30（6）：1126－1134.

［8］Clegg C D.Impact of cattle grazing and inorganic fertiliser additions to managed grasslands on the microbial community composition of soils.Applied Soil Ecology，2006，31（1－2）：73－82.

［9］Ingram L J，Stahl P D，Schuman G E，etal.Grazing impacts on soil carbon and microbial communities in a mixed－grass ecosystem.Soil Science Society of America Journal，2008，72（4）：939.

［10］Allison V J，Miller R M，Jastrow J D，etal.Changes in soil microbial community structure in a tallgrass prairie chronosequence.Soil Science Society of America Journal，2005，69（5）：1412.

［11］Zelles L.Fatty acid patterns of phospholipids and lipopolysaccharides in the characterisation of microbial communities in soil：a review.Biology and Fertility of Soils，1999，29（2）：111－129.

［12］Zogg G P，Zak D R，Ringelberg D B，etal.Compositional and functional shifts in microbial communities due to soil warming.Soil Science Society of America Journal，1997，61（2）：475.

［13］Hu L，Wang C T，Wang G X，etal.Changes in the activities of soil enzymes and microbial community structure at different degradation successional of alpine meadows in the headwater region of Three Rivers，China.Acta Prataculturae Sinica，2014，23（3）：8－19.

［14］Bardgett R D，Hobbs P J，F(xiàn)rostegard A.Changes in soil fungal：bacterial biomass ratios following reductions in the intensity of management of an upland grassland.Biology and Fertility of Soils，1996，22：261－264.

［15］Olsson P A.Signature fatty acids provide tools for determination of the distribution and interactions of mycorrhizal fungi in soil.FEMS Microbiology Ecology，1999，29：303－310.

［16］Bao S D.Soil agricultural chemistry analysis（The third edition）［M］.Beijing：China Agriculture Press，2000：28－49.

［17］Xia B C.Effect of vegetation on structure on soil microbial community.Chinese Journal of Applied Ecology，1998，9（3）：296－300.

［18］Hu Y L，Wang S L，Yan S K.Research advances on the factors influencing the activity and community structure of soil microorganism.Chinese Journal of Soil Science，2006，37（1）：170－176.

［19］Wang G H，Jin J，Xu M N，etal.Effect of plant，soil and soil management on soil microbial community diversity.Chinese Journal of Ecology，2006，25（5）：550－556.

［20］Wang Q L，Wang C T，Du Y G，etal.Grazing impact on soil microbial biomass carbon and relationship with soil environment in alpineKobresiameadow.Acta Prataculturae Sinca，2008，17（2）：39－46.

［21］Wang K H，Mcsorley R，Bohlen P，etal.Cattle grazing increases microbial biomass and alters soil nematode communities in subtropical pastures.Soil Biology and Biochemistry，2006，38（7）：1956－1965.

［22］Raiesi F，Asadi E.Soil microbial activity and litter turnover in native grazed and ungrazed rangelands in a semiarid ecosystem.Biology and Fertility of Soils，2006，43（1）：76－82.

［23］Jansa J，Mozafar A，Anken T R，etal.Diversity and structure of AMF communities as affected by tillage in a temperate soil.Mycorrhiza，2002，12（5）：225－234.

［24］Schnoor T K，Lekberg Y，Rosendahl S，etal.Mechanical soil disturbance as a determinant of arbuscular mycorrhizal fungal communities in semi－natural grassland.Mycorrhiza，2011，21（3）：211－220.

［25］Klumpp K，F(xiàn)ontaine S，Attard E，etal.Grazing triggers soil carbon loss by altering plant roots and their control on soil microbial community.Journal of Ecology，2009，97（5）：876－885.

［26］Donald R Z，William E H，David C W，etal.Plant diversity，soil microbial communities，and ecosystem function：are there and links.Ecology，2003，84（8）：2042－2050.

［27］Zhang T，Weng Y，Yao F J，etal.Effect of grazing intensity on ecological stoichiometry ofDeyeuxiaangustifoliaand meadow soil.Atca Prataculturae Sinica，2014，23（2）：20－28.

［3］吳愉萍.基于磷脂脂肪酸（PLFA）分析技術的土壤微生物群落結構多樣性的研究［D］.杭州：浙江大學，2009.

［4］張秋芳，劉波，林營志，等.土壤微生物群落磷脂脂肪酸PLFA生物標記多樣性.生態(tài)學報，2006，29（8）：4127－4137.

［5］閆瑞瑞，閆玉春，辛曉平，等.不同放牧強度下草甸草原土壤微生物和酶活性研究.生態(tài)環(huán)境學報，2011，20（2）：259－265.

［6］張成霞，南志標.放牧對草地土壤理化特性影響的研究進展.草業(yè)科學，2010，27（11）：131－136.

［7］趙帥，張靜妮，賴欣，等.放牧與圍欄內蒙古針茅草原土壤微生物生物量碳、氮變化及微生物群落結構PLFA分析.農業(yè)環(huán)境科學學報，2011，30（6）：1126－1134.

［13］胡雷，王長庭，王根緒，等.三江源不同退化演替階段高寒草甸土壤酶活性和微生物群落結構的變化.草業(yè)學報，2014，23（3）：8－19.

［16］鮑士旦.土壤農化分析（第3版）［M］.北京：中國農業(yè)出版社，2000：28－49.

［17］夏北成.植被對土壤微生物群落結構的影響.應用生態(tài)學報，1998，9（3）：296－300.

［18］胡亞林，汪思龍，顏紹馗.影響土壤微生物活性與群落結構因素研究進展.土壤通報，2006，37（1）：170－176.

［19］王光華，金劍，徐美娜，等.植被、土壤及土壤管理對土壤微生物群落結構的影響.生態(tài)學雜志，2006，25（5）：550－556.

［20］王啟蘭，王長庭，杜巖功，等.放牧對高寒草甸草原土壤微生物量碳的影響及其與土壤環(huán)境的關系.草業(yè)學報，2008，17（2）：39－46.

［27］張婷，翁月，姚鳳嬌，等.放牧強度對草甸植物小葉章及土壤化學計量比的影響.草業(yè)學報，2014，23（2）：20－28.