謝珊珊， 黃 金， 楊發(fā)龍

(西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/動(dòng)物醫(yī)學(xué)四川省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610041)

綿羊肺炎支原體(Mycoplasma ovipneumoniae)可感染綿羊、山羊以及其他野生小反芻動(dòng)物，是引起非典型肺炎的病原，其在全球范圍內(nèi)流行，危害嚴(yán)重［1-4］。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果表明綿羊肺炎支原體和引起豬地方流行性肺炎的病原——豬肺炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae)的親緣關(guān)系最近［5-6］。在豬肺炎支原體中，黏附素P97及其旁系同源蛋白質(zhì)是重要的毒力因子，在介導(dǎo)支原體對宿主細(xì)胞的黏附過程中發(fā)揮著重要作用，而且也是重要的免疫原，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體［7-8］，從而在研制亞單位疫苗及建立血清學(xué)診斷技術(shù)時(shí)具有重要的意義。對綿羊肺炎支原體SC01株的全基因組進(jìn)行分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，在綿羊肺炎支原體基因組中存在一組與P97及其旁系同源基因高度同源的基因家族［9］。其中，綿羊肺炎支原體p109基因與豬肺炎支原體mhp843高度相似，而后者的編碼產(chǎn)物已被證明是重要的黏附素和免疫原［7，10］。因此，有理由推測綿羊肺炎支原體P109也極有可能是重要的功能蛋白質(zhì)之一。

本研究對p109基因的分子特征進(jìn)行了分析，并對其進(jìn)行了原核表達(dá)和免疫反應(yīng)性分析，為進(jìn)一步研究其結(jié)構(gòu)與功能，以及為其在亞單位疫苗及血清學(xué)診斷中作為抗原的可能性提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株、載體及血清

綿羊肺炎支原體SC01株由西南民族大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定和保存，E.coli DH5α、Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞均購自大連寶生物工程有限公司，pET-32(a+)載體為Novagen公司產(chǎn)品，山羊抗綿羊肺炎支原體SC01株陽性血清由西南民族大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備，HRP標(biāo)記兔抗山羊IgG為Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 主要試劑

限制性內(nèi)切酶Bam H I、Xho I為NEB公司產(chǎn)品，Taq DNA聚合酶、T4 DNA連接酶為TaKaRa公司產(chǎn)品，AxyPrepTMDNA Gel Extraction Kit、AxyPrepTMPlasmid Miniprep Kit均為Axygen公司產(chǎn)品，Immun-Star WesternC Chemiluminescence Kit為 Bio-Rad公司產(chǎn)品，HistrapTMHP重組蛋白質(zhì)純化柱為 GE Healthcare公司產(chǎn)品。

1.3 p109基因序列分析

采用NCBI的BLAST工具及DNAstar軟件包中MegAlign、EditSeq和Protean工具對核苷酸及氨基酸序列分子量大小及與其他基因的相似性進(jìn)行比較分析;蛋白質(zhì)信號肽、跨膜區(qū)以及脂蛋白質(zhì)預(yù)測分別利用在線工具SigalP4.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)、TMHMM(www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)以及 LipoP 1.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/LipoP/)進(jìn)行;抗原表位分析采用在線分析站點(diǎn)(http://imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl)進(jìn)行。

1.4 引物設(shè)計(jì)

由于在p109基因中近3'端含有2個(gè)TGA(在支原體中編碼色氨酸)密碼子，故依據(jù)抗原表位分析結(jié)果和引物設(shè)計(jì)原則，在其5'端設(shè)計(jì)1對引物。引物序列如下:P109F:5'-CGCGGATCCCAGATTGGTTATTCCTAGGAGC-3'(下劃線部分為Bam H I酶切位點(diǎn))，P109R:5'-CCGCTCGAGATTACCATCAAGATTTAGCC(下劃線部分為Xho I酶切位點(diǎn))，該引物擴(kuò)增片段大小852 bp(其編碼P109蛋白質(zhì)第119至第402位氨基酸)，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.5 目的片段的PCR擴(kuò)增

采用常規(guī)酚/氯仿法提取綿羊肺炎支原體SC01株基因組DNA作為模板，利用上述引物對P109F/P109R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)總體系為25.000 μl，包含 dNTP(各 2.5 mmol/L)2.000 μl、MgCl2(25 mmol/L)2.000 μl、上 下 游 引 物 (10 μmol/L) 各1.000 μl、Taq DNA 聚合酶(5 U/μl)0.125 μl、10 ×PCR buffer 2.500 μl、DNA 模板 2.000 μl以及去離子水14.375 μl。反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性5 min;94 ℃ 30 s，51 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min，16℃結(jié)束反應(yīng)。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。

1.6 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

采用DNA Gel Extraction Kit對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收。用Bam H I和Xoh I分別對純化的PCR產(chǎn)物和pET-32(a+)進(jìn)行雙酶切，并經(jīng)純化回收后，采用T4連接酶進(jìn)行連接反應(yīng)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，隨后涂布至含有100 μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24 h。挑取陽性菌落，接種至含有100 μg/ml氨芐青霉素的LB肉湯中培養(yǎng)過夜，采用AxyPrepTMPlasmid Miniprep Kit提取質(zhì)粒。通過PCR擴(kuò)增對質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，并交由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測序確認(rèn)。重組表達(dá)載體命名為pET-32(a+)-P109，由其編碼表達(dá)的重組蛋白質(zhì)命名為rP109。

1.7 重組蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)、可溶性分析和純化

將上述鑒定正確的重組陽性質(zhì)粒pET-32(a+)-P109和空載體pET-32(a+)分別轉(zhuǎn)化E.coli Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，挑取單個(gè)菌落接種到含有 100 μg/ml氨芐青霉素和 34 μg/ml氯霉素的 LB肉湯中，37℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)過夜。取500 μl培養(yǎng)菌液接種到50 ml含有100 μg/ml氨芐青霉素和34 μg/ml氯霉素的LB肉湯中，37℃振蕩培養(yǎng)至OD600為0.6后，加入0.5 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，收集誘導(dǎo)前及誘導(dǎo)后不同時(shí)間點(diǎn)的菌液2 ml，離心收集菌體，PBS重懸后采用SDS-PAGE電泳檢測重組蛋白質(zhì)的表達(dá)情況。

選擇上述得到的最佳表達(dá)條件對目的蛋白質(zhì)進(jìn)行大量表達(dá)，12 000 r/min離心10 min，棄去上清液，沉淀采用10 ml裂解液進(jìn)行重懸，并采用超聲破碎儀在冰浴中進(jìn)行超聲裂解。在4℃條件下，以12 000 r/min離心20 min，收集上清液，對沉淀采用5 ml PBS液(0.01 mol/L，pH 7.4)進(jìn)行重懸。用SDS-PAGE電泳對沉淀和上清液中的重組蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測，以鑒定其可溶性。隨后，利用GE Healthcare公司生產(chǎn)的HistrapTMHP重組蛋白質(zhì)純化柱，按照說明書對重組蛋白質(zhì)rP109進(jìn)行純化。

1.8 Western-blot分析

用純化的rP109蛋白質(zhì)制樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，用半干轉(zhuǎn)印儀轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。50 g/L脫脂奶粉封閉過夜，TBST洗滌3次(每次10 min)后以1∶600倍稀釋的山羊抗綿羊肺炎支原體SC01株陽性血清為一抗孵育2 h;同法洗滌后孵育二抗2 h，二抗為1∶6 000稀釋的HRP標(biāo)記的兔抗山羊IgG;最后洗滌后加Immun-Star WesternC Chemiluminescence Kit發(fā)光劑，于VersaDoc成像系統(tǒng)中成像，讀取結(jié)果。以綿羊肺炎支原體抗體陰性的山羊血清作為對照。

2 結(jié)果

2.1 p109基因的生物信息學(xué)分析

p109基因CDS全長為2 904 bp，G+C含量為28.44%，編碼的蛋白質(zhì)分子量為108 900，等電點(diǎn)為4.91。該基因包含2個(gè)用于編碼色氨酸的TGA密碼子，分別位于第1 996 bp和2 692 bp處。經(jīng)BLAST比較分析，p109基因與豬肺炎支原體黏附相關(guān)基因mhp843相似性最高，兩者間核苷酸序列相似性為47.00%，編碼氨基酸序列相似性為45.30%，表明p109為mhp843的直系同源基因。

跨膜結(jié)構(gòu)域及信號肽分析結(jié)果顯示，P109蛋白質(zhì)在其N端有1個(gè)明顯的跨膜區(qū)螺旋，位于9～31 aa?？乖砦环治鼋Y(jié)果顯示P109蛋白質(zhì)包含豐富的抗原表位，通過預(yù)測發(fā)現(xiàn)其包含33個(gè)可能的抗原表位，該蛋白質(zhì)的平均抗原趨勢為1.008 1(圖1)。

圖1 P109抗原表位預(yù)測Fig.1 Prediction of antigenic epitope of protein P109

2.2 p109基因片段的PCR擴(kuò)增

以綿羊肺炎支原體SC01株基因組DNA為模板，用P109F/P109R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳得到與預(yù)期大小相符的條帶(圖2)。

圖2 p109基因片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR amplification of p109 fragment

2.3 原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定

PCR產(chǎn)物連接至pET-32(a+)載體，轉(zhuǎn)化E.coli DH5α細(xì)胞，篩選得到陽性克隆，以提取的重組質(zhì)粒為模板，采用P109F/P109R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得條帶大小與預(yù)期相符。對PCR鑒定為陽性質(zhì)粒進(jìn)行測序，結(jié)果顯示目的片段的序列與綿羊肺炎支原體SC01株 p109基因相應(yīng)區(qū)域完全相同，在pET-32(a+)載體中的插入位置正確。

2.4 重組蛋白質(zhì)的表達(dá)、可溶性分析和純化

重組質(zhì)粒pET-32(a+)-P109轉(zhuǎn)化E.coli Rosetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞后進(jìn)行IPTG誘異表達(dá)，在不同時(shí)間點(diǎn)收集菌體進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果(圖3)顯示，重組工程菌經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，在50 000處出現(xiàn)明顯的表達(dá)條帶，其大小與預(yù)期(50 900)相符，表明目的片段以融合蛋白質(zhì)的形式得到了有效表達(dá)。

圖3 重組P109蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)Fig.3 Prokaryotic expression of recombinant P109 protein

為分析重組蛋白質(zhì)的可溶性，用全菌裂解物上清液和沉淀制樣后進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示，表達(dá)的重組蛋白質(zhì)主要存在于沉淀中，說明該蛋白質(zhì)以包涵體形式進(jìn)行表達(dá)。利用HistrapTMHP純化柱對重組P109蛋白質(zhì)進(jìn)行純化，經(jīng)SDS-PAGE電泳，僅在51 000處出現(xiàn)單一條帶(圖4)，說明純化效果良好。

圖4 表達(dá)產(chǎn)物的可溶性分析及純化Fig.4 Solubility analysis and purification of recombinant P109 protein

2.5 重組蛋白質(zhì)Western-blot分析

將純化的重組蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素后以山羊抗綿羊肺炎支原體高免血清作為一抗，以辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗山羊IgG為二抗進(jìn)行Western-blot分析，結(jié)果(圖5)顯示，重組蛋白質(zhì)在51 000處出現(xiàn)一條特異條帶，表明重組蛋白質(zhì)與山羊抗綿羊肺炎支原體全菌抗體發(fā)生特異性結(jié)合，重組P109蛋白質(zhì)具有良好的免疫反應(yīng)性。

圖5 重組蛋白質(zhì)的Western-blot分析Fig.5 Western-blot analysis of recombinant P109 protein

3 討論

與大多數(shù)病原性細(xì)菌不同，致病性支原體一般不產(chǎn)生毒素及侵襲素等典型的毒力因子，主要是通過位于膜表面的黏附素附著于細(xì)胞表面，并通過有毒中間代謝產(chǎn)物對宿主細(xì)胞造成損傷。同時(shí)，支原體作為一種沒有細(xì)胞壁的特殊原核微生物，其膜表面蛋白質(zhì)也是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答的主要免疫原。因此，深入研究支原體中與黏附相關(guān)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能對于闡明其致病機(jī)理、開發(fā)血清學(xué)診斷技術(shù)和研發(fā)亞單位疫苗均具有十分重要的意義。

綿羊肺炎支原體是引起山羊及綿羊非典型肺炎的病原，隨著養(yǎng)羊業(yè)從散養(yǎng)向集約化舍養(yǎng)方式的轉(zhuǎn)變，其危害也不斷嚴(yán)重。然而，目前對該病原的重要功能蛋白質(zhì)知之甚少。此前，我們對綿羊肺炎支原體可能的黏附素分子P113的分子特征和免疫反應(yīng)性進(jìn)行了研究［11-12］，表明其與豬肺炎支原體的黏附素P97高度同源，并且是良好的免疫原。研究結(jié)果表明，豬肺炎支原體存在多個(gè)p97基因的旁系同源基因，且多數(shù)同樣參與黏附過程，也是良好的免疫原。其中，由mhp384編碼的蛋白質(zhì)(Mhp384)同樣可以結(jié)合到豬氣管上皮細(xì)胞纖毛，參與黏附過程［10］。豬肺炎支原體在感染宿主細(xì)胞的過程中，Mhp384可以在體內(nèi)獲得表達(dá)，并且誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體［7］。本研究對綿羊肺炎支原體p109基因的生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，其與mhp384為直系同源基因，在其N端具有一跨膜區(qū)，并含有豐富的抗原表位。為研究該蛋白質(zhì)的功能，本研究對編碼綿羊肺炎支原體P109的部分基因片段進(jìn)行了克隆，并在大腸桿菌中成功進(jìn)行高效表達(dá)。利用山羊抗綿羊肺炎支原體全菌抗體進(jìn)行免疫印跡分析，結(jié)果表明純化得到的重組蛋白質(zhì)能與山羊抗綿羊肺炎支原體全菌抗體特異性結(jié)合，說明P109是綿羊肺炎支原體的免疫原之一。這同時(shí)也說明本研究所表達(dá)的重組蛋白質(zhì)可以作為抗原，在ELISA等綿羊肺炎支原體血清抗體檢測試劑盒的研制和亞單位疫苗的開發(fā)等方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

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