劉金鳳， 吳健敏， 覃紹敏， 白安斌， 陳鳳蓮， 曹穎穎

(廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所，廣西 南寧 530001)

豬瘟(Classical swine fever，CSF)是由豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)引起的一種以高熱、出血及高死亡率為特征的接觸性烈性傳染病，在世界范圍內(nèi)廣泛流行，一旦暴發(fā)將會(huì)對(duì)當(dāng)?shù)仞B(yǎng)豬業(yè)造成毀滅性的打擊，已成為危害全球養(yǎng)豬生產(chǎn)的重要經(jīng)濟(jì)性疫病之一［1-4］。在中國(guó)，雖然依靠兔化弱毒疫苗免疫，較好地控制了豬瘟的大規(guī)模流行，但零散發(fā)生仍然存在，并且發(fā)病特點(diǎn)發(fā)生了變化。為此，對(duì)豬瘟的防治依舊面臨著嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，而在豬瘟的綜合防治中，如何快速、準(zhǔn)確診斷具有非常重要意義。

免疫學(xué)檢測(cè)是病原微生物診斷的主要手段，其關(guān)鍵技術(shù)在于獲得高效的可用于檢測(cè)的抗體。目前，以單鏈抗體為代表的基因重組抗體技術(shù)為抗體的制備提供了新途徑。單鏈抗體(ScFv)是由免疫球蛋白質(zhì)的重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)通過(guò)一段連接肽連接形成的單一肽鏈重組蛋白質(zhì)，它具有完全抗原結(jié)合位點(diǎn)的最小抗體片段，分子量小、滲透性高，特異性強(qiáng)，而且抗體的親和力和特異性在制備過(guò)程中均能較為容易控制，因此在免疫學(xué)檢測(cè)與醫(yī)學(xué)診斷中具有重要的應(yīng)用價(jià)值和廣泛的應(yīng)用前景［5-7］。本研究在獲得分泌抗豬瘟病毒單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株的基礎(chǔ)上，利用基因工程方法擴(kuò)增了抗體可變區(qū)基因VH和VL，組裝成單鏈抗體基因(CSFV-ScFv)，并進(jìn)行克隆和測(cè)序鑒定，同時(shí)利用計(jì)算機(jī)軟件對(duì)CSFV-ScFv基因及其所編碼蛋白質(zhì)的性質(zhì)進(jìn)行詳盡分析，為進(jìn)一步建立以單鏈抗體技術(shù)為支撐的CSFV病原快速檢測(cè)方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

抗CSFV單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株anti-CSFV14［8］、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞由廣西獸醫(yī)研究所診治中心實(shí)驗(yàn)室制備與保存;pMD18-T載體、DNA marker、限制性內(nèi)切酶、RevertAidM-MuLV Reverse Transcriptase、pfu 聚合酶、Ex Taq DNA Master Mix、RNase抑制劑購(gòu)自 TaKaRa公司，質(zhì)粒提取試劑盒、DNA純化試劑盒購(gòu)自北京天根生物公司，TRIzol試劑購(gòu)自Invitrogen公司，酵母抽提物及胰蛋白胨購(gòu)自O(shè)XID公司，其他生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)產(chǎn)品。

1.2 引物及Linker設(shè)計(jì)

參照文獻(xiàn)［9］設(shè)計(jì)鼠源抗體重鏈及輕鏈可變區(qū)的擴(kuò)增引物，連 接 肽Linker采用文獻(xiàn)［10］報(bào)道的較常用的(Gly4Ser)3形式;將Linker設(shè)計(jì)在VH基因的下游引物和VL基因的上游引物，并分別在兩端引入酶切位點(diǎn)BamH I和Not I，序列由北京博邁德基因有限公司合成，具體如表1。

表1 CSFV-ScFv基因引物序列Table 1 The primer sequences of CSFV-ScFv gene

1.3 雜交瘤細(xì)胞總RNA提取及cDNA合成

PRRSV雜交瘤細(xì)胞株anti-CSFV14復(fù)蘇培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，細(xì)胞計(jì)數(shù)約8×107時(shí)，1 200 r/min離心3～5 min收集細(xì)胞，在無(wú)RNA酶的條件下按 TRIzol試劑盒操作說(shuō)明書提取細(xì)胞總RNA，并取少量總RNA用紫外分光光度儀進(jìn)行純度和濃度鑒定。反轉(zhuǎn)錄過(guò)程按TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄酶(MMuLV)產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行。

1.4 VH和VL基因的擴(kuò)增

以合成cDNA第一鏈為模板，分別以VH基因上、下游引物(VH-B、VH-F)和VL基因上、下游引物(VL-B和VL-F)擴(kuò)增VH基因和VL基因。PCR反應(yīng)體系按常規(guī)比例配成50 μl(反應(yīng)程序:95℃ 5 min;95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30 個(gè)循環(huán);72℃ 10 min)。取5 μl PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，切膠回收獲得VH和 VL基因，并直接進(jìn)行DNA測(cè)序。

1.5 全長(zhǎng)CSFV-ScFv基因的擴(kuò)增

以上述的純化產(chǎn)物為模板，用引物VH-F1、VH-Linker-B和 Linker-VL-F、VL-B1分別進(jìn)行 VHLinker和Linker-VL序列的擴(kuò)增(反應(yīng)體系和反應(yīng)程序同方法1.4)，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定后進(jìn)行純化回收。取純化產(chǎn)物等摩爾混合，通過(guò)PCR反應(yīng)完成VH-Linker-VL片段的預(yù)拼接(預(yù)拼接程序:95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，10個(gè)循環(huán);72℃ 10 min)，再以2 μl預(yù)拼接產(chǎn)物為模板，用VH-F1、VL-B1引物進(jìn)行VH-Linker-VL全長(zhǎng)基因的拼接，拼接程序:95℃ 5 min;95℃ 30 s，60℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳鑒定后進(jìn)行純化回收，獲得VHLinker-VL全長(zhǎng)基因片段。

1.6 CSFV-ScFv基因的克隆與鑒定

將全長(zhǎng)ScFv純化回收后與 pMD-18T載體連接，連接體系與程序參考載體說(shuō)明書。將連接產(chǎn)物按常規(guī)方法轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落提取質(zhì)粒，經(jīng)過(guò)BamH I與Not I酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒pMD-CSFV-ScFv送至北京華大公司進(jìn)行核酸序列測(cè)定分析。

1.7 CSFV-ScFv基因所編碼的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

基于CSFV-ScFv基因的核苷酸序列，利用Edit-Seq推導(dǎo)其氨基酸序列，利用NCBI的blasp、Igblast進(jìn)行氨基酸序列的同源性分析和IgG結(jié)構(gòu)域分析，利用ExPASy服務(wù)器上的ProtParam軟件分析CSFVScFv分子理化性質(zhì)，利用 NPSA在線服務(wù)器預(yù)測(cè)CSFV-ScFv二級(jí)結(jié)構(gòu)，最后采用SWISS-Model在線服務(wù)器預(yù)測(cè)CSFV-ScFv三級(jí)結(jié)構(gòu)，并進(jìn)行同源建模。

2 結(jié)果

2.1 VH、VL基因片段的擴(kuò)增

提取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的抗PRRSV單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞anti-CSFV14的總RNA，測(cè)定其濃度為1 262 ng/μl。以此RNA為模板擴(kuò)增VH和VL基因，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果(圖1)顯示，獲得預(yù)期的約363 bp的VH基因和約324 bp的VL基因。

圖1 CSFV VH、VL基因擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR amplified products of CSFV VH and VL genes

2.2 全長(zhǎng)CSFV-ScFv基因的擴(kuò)增拼接

以純化的VH與VL基因?yàn)槟０宸謩e擴(kuò)增出長(zhǎng)約410 bp的VH-Linker及長(zhǎng)約369 bp的Linker-VL基因片段(圖2)，將 VH-Linker與 Linker-VL等量混合，在PCR反應(yīng)中完成 VH-Linker-VL的預(yù)拼接，再以預(yù)拼接產(chǎn)物為模板進(jìn)行VH-Linker-VL全基因的拼接擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，獲得預(yù)期長(zhǎng)約730 bp的目的基因(圖3)。

圖2 VH-Linker、Linker-VL基因擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 PCR amplified products of VH-Linker and Linker-VL genes

圖3 全長(zhǎng)CSFV-ScFv基因擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 PCR amplified products of full-length CSFV-ScFv gene

2.3 CSFV-ScFv基因的克隆及酶切鑒定

將純化的CSFV-ScFv基因與pMD-18T載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，提取單菌落質(zhì)粒，經(jīng)BamH I和Not I雙酶切鑒定后，發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒pMDCSFV-ScFv可切出約730 bp的外源基因片段(圖4)。

圖4 pMD-CSFV-ScFv重組質(zhì)粒的酶切鑒定結(jié)果Fig.4 Ⅰdentification of pMD-CSFV-ScFv recombinant plasimid

2.4 CSFV-ScFv重組質(zhì)粒的測(cè)序及分析

將酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行序列測(cè)定，結(jié)果顯示所擴(kuò)增的單鏈抗體基因全長(zhǎng)732 bp，由預(yù)期的VH基因、VL基因和Linker組成，其中 VH基因位于Linker的上游，大小為363 bp，為一開放閱讀框，不含終止密碼子，可編碼121個(gè)氨基酸;序列中有明確的3個(gè)互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)和4個(gè)框架區(qū)(FR)，第22、96位的氨基酸殘基為抗體可變區(qū)特征性的半胱氨酸殘基，核苷酸序列與鼠源的重鏈可變區(qū)框架相似率最高達(dá)90.28%，表明VH基因所編碼的氨基酸序列符合鼠抗體可變區(qū)基因特征。VL基因則位于Linker下游，長(zhǎng)324 bp，基因內(nèi)無(wú)終止密碼子，編碼108個(gè)氨基酸，序列中亦有明確的CDRs和FRs，抗體可變區(qū)特征性的半胱氨酸殘基位于第23、88位，核苷酸序列與鼠源的輕鏈可變區(qū)框架相似率最高達(dá)92.83%，表明VL基因所編碼的氨基酸序列符合鼠抗體可變區(qū)特征。Linker大小為45 bp，編碼15個(gè)氨基酸殘基。序列詳見圖5。

2.5 CSFV-ScFv蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分析預(yù)測(cè)

2.5.1 CSFV-ScFv氨基酸序列比對(duì)分析 將VH、VL及ScFv基因編碼的氨基酸序列經(jīng)NCBIblastp檢索分析，發(fā)現(xiàn)了IgG典型的可變區(qū)結(jié)構(gòu)域(IGV)，并與多種已登錄的鼠單鏈抗體同源性很高，與ScFv anti-White Spot Syndrome Virus(AAY88909.1)同源性最高達(dá)79%，具有鼠源單鏈抗體可變區(qū)的所有特征。

2.5.2 CSFV-ScFv蛋白質(zhì)理化性質(zhì)與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析 用蛋白質(zhì)序列分析軟件分析蛋白質(zhì)理化性質(zhì)，并對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。CSFV-ScFv基因所編碼蛋白質(zhì)分子式為C1164H1767N317O363S8，原子數(shù)3 619，理論相對(duì)分子質(zhì)量為26 266.2，等電點(diǎn)為8.93，不穩(wěn)定系數(shù)為35.05，為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)，疏水氨基酸92個(gè)，占37.7%，親水性評(píng)估值為-0.425，為親水性蛋白質(zhì)。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，該蛋白質(zhì)主要由β-片層和無(wú)規(guī)則卷曲組成。其中，17個(gè)氨基酸殘基可形成α螺旋，占6.97%，92個(gè)氨基酸殘基形成自由伸展，占37.70%，135個(gè)氨基酸殘基可形成無(wú)規(guī)則卷曲，占55.33%，Linker呈無(wú)規(guī)則卷曲(圖6)。

2.5.3 CSFV-ScFv蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)分子建模 經(jīng)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)2gki.1所編碼的氨基酸序列與目的基因CSFV-ScFv所編碼的氨基酸序列同源性可達(dá)到72.20%，根據(jù)同源建模的思路，運(yùn)用SWISS-Model軟件進(jìn)行同源建模，模擬CSFV-ScFv蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)，模擬結(jié)構(gòu)可靠。結(jié)果顯示，重鏈可變區(qū)主要由10個(gè)β片層折疊形成，輕鏈可變區(qū)主要由11個(gè)β片層折疊形成。三級(jí)結(jié)構(gòu)中連接肽無(wú)規(guī)則卷曲形成索狀結(jié)構(gòu)，將VH和VL牽拉而相互靠近，形成一個(gè)口袋樣形狀的溝槽結(jié)構(gòu)，以利于抗原結(jié)合(圖7)，理論上具有良好的抗原結(jié)合活性。

圖5 CSFV-ScFv基因及其所推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.5 The CSFV-ScFv gene and its deduced amino acid sequence

圖6 CSFV-ScFv蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.6 The prediction of secondary structure of CSFV-ScFv protein

圖7 CSFV-ScFv蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)同源建模Fig.7 The 3D structure homology modeling of CSFV-ScFv protein

3 討論

抗體在免疫學(xué)檢測(cè)的應(yīng)用由來(lái)已久，早在19世紀(jì)末，人們就能通過(guò)免疫動(dòng)物獲得抗血清。1975年，Kohler等［11］建立的B淋巴雜交瘤細(xì)胞技術(shù)更是抗體生產(chǎn)的重大技術(shù)革命，不僅為醫(yī)學(xué)與生物學(xué)研究開創(chuàng)了新紀(jì)元，也為臨床疫病的診斷和治療提供了新的工具。然而由于單克隆抗體制備過(guò)程復(fù)雜，價(jià)格昂貴，很大程度上限制了它的臨床使用。隨著基因工程抗體技術(shù)的發(fā)展，單鏈抗體技術(shù)走進(jìn)了人們的視野，單鏈抗體由于分子量小，穿透性強(qiáng)，免疫原性低，體內(nèi)易于清除，利于進(jìn)行基因工程操作，在疾病預(yù)防、診斷和治療中顯示了巨大的應(yīng)用前景。以單鏈抗體替代傳統(tǒng)的IgG抗體為檢測(cè)元件應(yīng)用于病原微生物的檢測(cè)具有明顯的優(yōu)勢(shì)。與傳統(tǒng)單抗比，單鏈抗體制備簡(jiǎn)單，成本低廉而又具有親代抗體的全部抗原結(jié)合位點(diǎn)，Nimmagadda等［12］以 HAVScFv基因?yàn)榛A(chǔ)建立的免疫捕獲ELISA檢測(cè)方法，與商業(yè)化單克隆抗體檢測(cè)試劑盒應(yīng)用效果無(wú)明顯的差異，證實(shí)單鏈抗體具有親本抗體相同的免疫活性。此外，單鏈抗體基因工程操作更簡(jiǎn)便，其N端或C端可與其他分子拼接構(gòu)建雙功能分子，除替代傳統(tǒng)抗體用于建立ELISA等檢測(cè)方法外，還可應(yīng)用于疫病的快速檢測(cè)領(lǐng)域，如覃紹敏等［13］以抗人紅細(xì)胞單鏈抗體與豬瘟E2基因融合蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)建立的紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)可快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確地進(jìn)行豬瘟抗體的檢測(cè)。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)研制出多種單鏈抗體基因，并應(yīng)用于臨床［14-15］。

本研究在前期的試驗(yàn)中獲得1株高親和力的抗豬瘟E2蛋白質(zhì)單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞anti-CSFV14的基礎(chǔ)上，通過(guò)合成通用引物，分別進(jìn)行單克隆抗體的重鏈和輕鏈可變區(qū)基因的擴(kuò)增，并進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用IMGT數(shù)據(jù)庫(kù)、NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)平臺(tái)提供的在線分析工具進(jìn)行驗(yàn)證，通過(guò)分析，證實(shí)了基因序列的正確性，并根據(jù)分析的結(jié)果重新設(shè)計(jì)了后續(xù)的引物進(jìn)行VH基因、VL基因的修正以及CSFV-ScFv基因全長(zhǎng)的拼接克隆及結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析。

單鏈抗體的表達(dá)量及其免疫活性和其構(gòu)建方法密切相關(guān)，不同的連接順序會(huì)影響ScFv的二聚或多聚化的行為［16］，進(jìn)而影響單鏈抗體表達(dá)產(chǎn)量及其三維空間構(gòu)象的形成，最終影響單鏈抗體的生物活性。很多研究結(jié)果表明，VL-Linker-VH的連接方式可表現(xiàn)出更強(qiáng)的形成高分子聚合物的趨勢(shì)，在進(jìn)行分泌表達(dá)時(shí)其表達(dá)量要高于VH-Linker-VL的10～20倍，但VH-Linker-VL基因表達(dá)的蛋白質(zhì)要比VL-Linker-VH基因表達(dá)的蛋白質(zhì)顯示出更大的結(jié)合活性［17-18］，因此，基于抗體活性效價(jià)考慮，我們選取了親和力較好的VH-Linker-VL連接方式構(gòu)建CSFVScFv基因。Linker的設(shè)計(jì)對(duì)保持親本抗體的親和力有重要影響，它必須能使VH和VL易于自由折疊，使抗原結(jié)合位點(diǎn)處于適當(dāng)?shù)臉?gòu)型，并不引起其分子動(dòng)力學(xué)改變，避免對(duì)抗原結(jié)合部位造成干擾。目前報(bào)道使用最多的Linker是Huston根據(jù)X線晶體衍射分析抗體可變區(qū)結(jié)構(gòu)及計(jì)算機(jī)輔助分析結(jié)果設(shè)計(jì)的15肽序列(Gly4Ser)3，該序列已經(jīng)有許多成功應(yīng)用的報(bào)道，因此本研究中亦選用此序列。

蛋白質(zhì)同源建模是基于查詢的蛋白質(zhì)氨基酸序列與已知蛋白質(zhì)氨基酸序列顯著的相似性來(lái)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的方法，是一種可靠的、廣泛接受的具有實(shí)用性的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)技術(shù)。通常蛋白質(zhì)的氨基酸序列間相似度應(yīng)高于30%，表示空間結(jié)構(gòu)相似，低于30%時(shí)，序列比對(duì)時(shí)會(huì)搜索到大量的非相關(guān)蛋白質(zhì)，難以用于同源建模［19］。我們對(duì)所得到的CSFV-ScFv基因進(jìn)行同源建模分析時(shí)，搜索到的模型蛋白質(zhì)與靶蛋白質(zhì)的相似度為72.20%，所以對(duì)靶蛋白質(zhì)的模擬結(jié)果可靠度高。從模擬結(jié)果可看出，CSFVScFv屬于 β-片層結(jié)構(gòu)，其相鄰的兩條 β-鏈反向平行，形成由輕鏈連接的β-片層結(jié)構(gòu)，兩個(gè)片層之間通過(guò)疏水作用和二硫鍵穩(wěn)定。ScFv的理化性質(zhì)分析可知，ScFv為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。此外，從蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)還可看出，目的蛋白質(zhì)的VH和VL結(jié)構(gòu)域相互靠近，形成一個(gè)相對(duì)致密的分子，Linker則游離在外，使VH和VL形成一個(gè)口袋結(jié)構(gòu)，這樣的結(jié)構(gòu)可能有利于抗體識(shí)別和結(jié)合抗原。

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