楊 威， 閆海霞， 汪家璐， 紀(jì)麗蓮， 王新風(fēng)

(1.淮陰師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院/江蘇省環(huán)洪澤湖生態(tài)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 淮安 223300;2.淮安市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，江蘇 淮安 223300)

農(nóng)用土壤是受人類活動(dòng)強(qiáng)烈影響的一類特殊土壤，其質(zhì)量與人類健康密切相關(guān)［1］。土壤污染源主要來自工業(yè)“三廢”和農(nóng)藥、化肥，污染物可通過灌溉水進(jìn)入土壤，也可通過空中的顆粒物(含重金屬和致癌物質(zhì)等)干濕沉降造成土壤污染，隨著時(shí)間的推移，農(nóng)田表層土壤鎘、鉛、銅、鋅等重金屬含量有增加的趨勢［2］。由于農(nóng)作物的吸收作用，重金屬元素從土壤遷移轉(zhuǎn)化到農(nóng)作物根、莖、葉及果實(shí)中去，從而連帶造成農(nóng)作物的重金屬污染。全球每年釋放到環(huán)境中的鎘高達(dá) 3.9×104t［3］，而在環(huán)洪澤湖地區(qū)幾種重金屬污染當(dāng)中，鎘要高于其他幾種［4］。如何修復(fù)受到鎘污染的土地和水體是我們急需面對的問題。

目前，工程修復(fù)、電動(dòng)修復(fù)、電熱修復(fù)、土壤淋洗以及化學(xué)修復(fù)等方法雖然在一定程度上能夠緩解重金屬污染，但是卻存在著一些弊端，如實(shí)施工程量大、投資費(fèi)用高，破壞土體結(jié)構(gòu)造成土壤肥力下降，并且還要對換出的污土進(jìn)行堆放或處理，其中化學(xué)修復(fù)只是改變重金屬的存在形態(tài)，并不能徹底根除重金屬，重金屬還有再度活化污染的可能。另外，一些特定植物也可以通過對金屬離子的吸收、揮發(fā)以及穩(wěn)定對重金屬污染進(jìn)行修復(fù)。這種修復(fù)方式雖然效果好、易操作，但是卻只能用于非耕作土壤或水體，對于農(nóng)田重金屬污染依然無能無力［5］。

利用從自然環(huán)境中分離得到的有益微生物來修復(fù)農(nóng)田及水體的重金屬污染就可以克服這一缺點(diǎn)［6］。受到重金屬污染的土壤，往往富集多種耐重金屬的真菌和細(xì)菌，其通過多種作用方式影響土壤重金屬的毒性［7-8］。如魏本杰等人報(bào)道，產(chǎn)鐵載體細(xì)菌可以活化土壤中的鎘［9］。周小梅等人也發(fā)現(xiàn)了一株具有較強(qiáng)產(chǎn)酸能力的芽孢桿菌，該菌株除對鎘有耐性之外，對鉛、銅等均具有一定耐受性［10］。除此之外，植物內(nèi)生菌作為與植物關(guān)系緊密的重要微生物資源，也在修復(fù)重金屬污染中發(fā)揮著作用。如曹喆等人從重金屬鎘(Cd)超累積植物龍葵中分離到一株能夠去除鎘離子的芽孢桿菌［11］。另外，姜敏等人報(bào)道從重金屬富集植物(大葉相思)與非富集植物(水禾、水稻)中分離到的重金屬抗性真菌均高于根際真菌［12］，也說明了內(nèi)生菌在重金屬修復(fù)中的巨大潛力。尋找一種能夠有效降低環(huán)境中鎘離子濃度從而減少農(nóng)作物吸收積累的修復(fù)方式，對于日益嚴(yán)重的耕地重金屬污染來說意義重大。

本研究擬在離體條件下選擇能夠耐受并且降低環(huán)境中鎘離子濃度的菌株，并進(jìn)行盆栽條件下耐隔菌株的活性評價(jià)，初步探討其降低鎘離子濃度的可能機(jī)制，旨在尋找一條降低農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中鎘污染危害的途徑。

1 材料與方法

1.1 離體條件下菌株耐鎘活性檢測

從本實(shí)驗(yàn)室菌株資源庫中選擇了183株細(xì)菌，將活化后的菌株接種到含有終濃度為15 mg/L硫酸鎘的LB培養(yǎng)液中，28℃，180 r/min搖床培養(yǎng)24 h，對照組不加硫酸鎘溶液。分別從培養(yǎng)后的培養(yǎng)液中吸取2.0 ml溶液在600 nm下檢測其吸光值，判斷菌株生長情況。另取1.0 ml培養(yǎng)液離心后取上清液，在上清液中分別加入9.0 ml去離子水，轉(zhuǎn)移至50.0 ml小燒杯中，加入濃硝酸1.0 ml，80℃水浴，蒸發(fā)至1.0 ml左右再加入濃硝酸1.0 ml、高氯酸0.5 ml?；靹蚝罄^續(xù)水浴蒸發(fā)至1.0 ml，冷卻，加入4.0 ml去離子水，混勻后利用原子發(fā)射光譜法(ICP)測定其中鎘離子濃度。

1.2 盆栽條件下耐鎘菌株的活性評價(jià)

試驗(yàn)共進(jìn)行2批次，所用寄主分別為黃瓜品種新津優(yōu)1號(hào)和辣椒品種大禹牛角王，穴盤育苗，待苗長出3～4片真葉后移栽到溫室盆缽中，每盆1株。盆缽高10 cm，口徑12 cm，每盆裝基質(zhì)400～500 g。溫室條件設(shè)定為30℃，光照時(shí)間16 h，黑暗時(shí)間8 h。

根據(jù)菌株離體條件下耐鎘活性篩選結(jié)果，選擇培養(yǎng)液中鎘離子濃度下降率最高的5株菌株進(jìn)行2批次溫室試驗(yàn)。其中根圍細(xì)菌4株，編號(hào)分別為H2-1L、H2-22K、H3-11L 和 L5-2L;內(nèi)生菌1 株，編號(hào)為1JN2。每批溫室試驗(yàn)分別設(shè)5個(gè)處理組，處理方式如下:移栽時(shí)用1×109CFU/ml的菌懸液灌根處理，每盆20 ml，移栽7 d后用30 mg/L硫酸鎘灌根處理，每盆20 ml。另設(shè)2個(gè)對照，對照1不接種菌株，移栽7 d后用30 mg/L硫酸鎘灌根處理，每盆20 ml;對照2不接種菌株，正常培養(yǎng)。每組重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)24株植株。

1.3 植株生理指標(biāo)檢測

植株移栽后第21 d分別檢測各處理組根長、鮮質(zhì)量、葉綠素含量、根系活力以及葉片相對電導(dǎo)勢。檢測方法參照《植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》［13］。

每個(gè)處理組隨機(jī)選取植株3株，準(zhǔn)確稱取1 g莖，600℃灰化4 h(干法灰化)，1%鹽酸洗脫灰分，去離子水定容至5 ml，利用原子發(fā)射光譜法測定鎘離子濃度。

1.4 耐鎘菌株的鑒定

對菌株進(jìn)行革蘭氏染色反應(yīng)，并觀察其形態(tài)。采用樹脂型基因組試劑盒(賽百盛有限公司生產(chǎn))提取菌株基因組DNA，以提取的基因組DNA為模板，利用16S通用引物擴(kuò)增其16S rDNA片段并送南京金斯瑞有限公司測序，結(jié)果提交NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對。結(jié)合比對結(jié)果和菌株形態(tài)對其進(jìn)行鑒定。

1.5 耐鎘菌株鎘離子耐受機(jī)制

選擇溫室試驗(yàn)中協(xié)助寄主植物緩解鎘脅迫效果最好的菌株進(jìn)行耐鎘機(jī)制研究。將濃度為1×107CFU/ml的該菌株菌懸液按照1%接種量接入含有3 g/L硫酸鎘的LB培養(yǎng)液中，28℃、180 r/min搖床培養(yǎng)，分別在12 h、24 h、36 h和48 h吸取培養(yǎng)液，離心收集菌體，超純水洗脫后用2.5%戊二醛固定，通過掃描電鏡觀察菌株的群體以及單細(xì)胞形態(tài)。以不加鎘離子的處理組作為對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 離體條件下菌株耐鎘活性檢測

183株細(xì)菌中58株在含有15 mg/L Cd2+的LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h后OD600大于0.5，說明在外源鎘離子存在的情況下菌株依然能夠正常生長。其中22株菌株培養(yǎng)后溶液中Cd2+濃度下降大于10%，下降最高達(dá)51%。選擇其中5株菌株(H2-1L、H2-22K、H3-11L、1JN2、L5-2L)進(jìn)行盆栽試驗(yàn)評價(jià)其協(xié)助寄主植物耐受鎘脅迫的能力。

2.2 耐鎘菌株的溫室評價(jià)

與對照1相比(表1)，耐鎘菌株處理組能夠在鎘脅迫下增加黃瓜植株的根長、鮮質(zhì)量、葉綠素含量以及根系活力，其中菌株1JN2和L5-2L增加效果比較明顯，特別是植株鮮質(zhì)量、葉綠素含量以及根系活力3項(xiàng)指標(biāo)。菌株1JN2處理組顯著降低黃瓜植株葉片的相對電導(dǎo)率。

為了更直接反應(yīng)耐鎘菌株協(xié)助寄主植物緩解鎘脅迫能力，我們檢測了鎘脅迫環(huán)境下寄主植物對于土壤中鎘離子的吸收和積累情況。如表1所示，在缺少耐鎘菌株保護(hù)情況下(對照1)，1 g黃瓜莖組織中鎘離子濃度達(dá)到0.1 mg/L，5株耐鎘菌株接種均能在一定程度上減少植物對于基質(zhì)中鎘離子的吸收，降低幅度從13.53%到23.43%。

表1 耐鎘菌株處理對黃瓜生長指標(biāo)及體內(nèi)鎘積累的影響Table 1 Growth and Cd accumulation in cucumber inoculated with Cd-tolerant bacterial strains

與對照1相比，菌株1JN2、L5-2L和 H2-22K處理增加了辣椒植株的根長、鮮質(zhì)量、葉綠素含量以及根系活力，特別是菌株1JN2處理，辣椒植株的根長、鮮質(zhì)量、葉綠素含量與正常培養(yǎng)的對照2相當(dāng)，而對根系活力的增加效果則顯著高于對照2。菌株H3-11L、1JN2和 L5-2L處理與對照1相比均能夠明顯降低寄主植物葉片的相對電導(dǎo)率，表現(xiàn)出在鎘脅迫條件下對于寄主植物的保護(hù)作用。相比于黃瓜而言，5株耐鎘菌株降低辣椒植株吸收鎘離子的效果更明顯，降低幅度從29.64%到40.39%(表2)。

綜合2批次溫室盆栽試驗(yàn)結(jié)果，菌株1JN2在鎘脅迫條件下對于寄主植物的綜合保護(hù)效應(yīng)更佳。

2.3 耐鎘菌株鑒定

菌株1JN2呈革蘭氏染色反應(yīng)陽性，通過形態(tài)學(xué)與16S rDNA序列比對鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。

表2 溫室條件下耐鎘菌株處理對于辣椒生長指標(biāo)及體內(nèi)鎘積累的影響Table 2 Growth and Cd accumulation in pepper inoculated with Cd-tolerant bacterial strains

2.4 耐鎘菌株的掃描電鏡觀察

根據(jù)掃描電鏡結(jié)果，與對照組相比，在培養(yǎng)液中加入鎘離子之后，菌株1JN2的胞外多糖黏度增強(qiáng)，且洗脫后胞外多糖殘留較多。鎘離子處理組在12 h時(shí)菌體受到明顯損傷，出現(xiàn)外壁內(nèi)陷。但是這種現(xiàn)象從24 h開始有一定程度緩解，菌體開始自我復(fù)原，至48 h，菌體已經(jīng)基本恢復(fù)到原有狀態(tài)(圖1A～1D)。說明此時(shí)菌株已適應(yīng)鎘離子的存在，并且能夠進(jìn)行正常生長代謝。第48 h時(shí)，處理組的胞外多糖開始發(fā)生形態(tài)上的變化，由最初的絮狀開始固化，形成片層狀固態(tài)(圖1E)。

圖1 菌株1JN2在鎘離子處理后群體和單細(xì)胞的形態(tài)Fig.1 The morphology of population and single cell of Cd-treated strain 1JN2

3 討論

植物內(nèi)生菌［14］和號(hào)稱植物“第二基因組”［15］的植物根圍細(xì)菌在寄主植物生長過程中發(fā)揮重要作用。這些微生物不僅能夠協(xié)助寄主植物阻止病原菌的入侵［16］，為植物生長提供必要的營養(yǎng)［17］，還能協(xié)助寄主抗逆，包括抗旱、耐鹽堿以及耐重金屬污染等［18-21］。

與以往的報(bào)道中發(fā)現(xiàn)內(nèi)生菌在重金屬抗性方面的優(yōu)勢［12，22］類似，本研究篩選出的一株植物內(nèi)生菌1JN2，在離體條件和溫室盆栽試驗(yàn)中均表現(xiàn)出顯著耐鎘活性，并降低植物體內(nèi)鎘離子的吸收累積，且活性顯著高于植物根圍細(xì)菌。該菌株能夠逐漸適應(yīng)鎘脅迫壓力，在處理24 h后開始進(jìn)行菌體的自我復(fù)原。從胞外多糖的形態(tài)來看，推測該菌株可能利用胞外多糖固定環(huán)境中的鎘離子，從而減少寄主植物對于鎘離子的吸收。在前期的研究中我們還發(fā)現(xiàn)菌株1JN2同時(shí)具有產(chǎn)IAA以及多種胞外酶的活性，能夠協(xié)助寄主植物防控土傳病害的侵染［23］。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)環(huán)境不斷惡化的大背景下，該菌株表現(xiàn)出一定的開發(fā)潛力。在今后的研究中，我們將重點(diǎn)研究其耐鎘機(jī)制、發(fā)酵條件優(yōu)化以及劑型開發(fā)等，為農(nóng)業(yè)安全生產(chǎn)提供保障。

［1］ 李秀蘭，胡雪峰.上海郊區(qū)蔬菜重金屬污染現(xiàn)狀及累積規(guī)律研究［J］.化學(xué)工程師，2005(5):36-38.

［2］ 張 民，龔子同.我國菜園土壤中某些重金屬元素的含量與分布［J］.土壤學(xué)報(bào)，1996，33(1):85-93.

［3］ NRIAGU J O，PACYNA J M.Quantitative assessment of worldwide contamination of air，water and soils by trace metals［J］.Nature，1988，333:134-139.

［4］ 余 輝，張文斌，余建平.洪澤湖表層沉積物重金屬分布特征及其風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)［J］.環(huán)境科學(xué)，2011，32(2):437-444.

［5］ ZHUANG X L，CHEN J，SHIM H，et al.New advances in plant growth-promoting rhizobacteria for bioremediation［J］.Environment International，2007，33:406-413.

［6］ RATHNAYAKE I V N，MEGHARAJ M，BOLAN N，et al.Tolerance of heavy metals by gram positive soil bacteria［J］.World A-cademy of Science，Engineering and Technology，2009，53:1185-1190.

［7］ GADD G M.Metals，minerals and microbes:geomicrobiology and bioremediation［J］.Microbiology，2010，156:609-643.

［8］ ZOUBOULIS A I，LOUKIDOU M X，MATIS K A.Biosorption of toxic metalsmith from aqueous solutions by bacteria strains isolated from metal-polluted soils［J］.Process Biochemistry，2004，39:909-916.

［9］ 魏本杰，曾曉希，劉志成，等.產(chǎn)鐵載體菌的篩選鑒定及活化鎘的性能探究［J］.環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2014，37(11):26-31.

［10］周小梅，趙運(yùn)林，胥正鋼，等.蔞蒿(Artemisia selengensis)根際耐鎘產(chǎn)酸細(xì)菌的篩選鑒定及其生物學(xué)特性［J］.環(huán)境工程學(xué)報(bào)，2014，8(11):5010-5014.

［11］曹 喆，羅勝聯(lián)，曾光明，等.一株龍葵內(nèi)生細(xì)菌 SDE06去除Cd2+的實(shí)驗(yàn)［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2009，36(3):328-333.

［12］姜 敏，曹理想，張仁鐸.重金屬抗性內(nèi)生真菌與其宿主植物重金屬抗性關(guān)系初探［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2008，26(6):2038-2042.

［13］張志良.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)［M］.2版.北京:高等教育出版社，2002:59-62，88-91，257-258.

［14］鄒文欣，譚仁祥.植物內(nèi)生菌研究新進(jìn)展［J］.植物學(xué)報(bào)，2001(9):881-892.

［15］ BERENDSEN R L，PIETERSE C M J，BAKKER P H M.The rhizosphere microbiome and plant health［J］.Trends in Plant Science，2012，17(8):478-486.

［16］宋小雙，鄧 勛，遇文婧，等.一株生防內(nèi)生真菌D202對立枯絲核菌的抑制作用及生理學(xué)特性研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42(27):9274-9275.

［17］陳曉斌，張炳欣.植物根圍促生細(xì)菌(PGPR)作用機(jī)制的研究進(jìn)展［J］.微生物學(xué)雜志，2000，20(1):38-44.

［18］王 娜，楊 鎮(zhèn)，馬曉穎，等.植物內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物對干旱脅迫下辣椒幼苗生理機(jī)制的影響［J］.北方園藝，2014(22):29-32.

［19］ ZAHIR Z A，MUNIR A，ASGHAR H N，et al.Effectiveness of rhizobacteria containing ACC deaminase for growth promotion of peas(Pisum sativum)under drought conditions［J］.J Microbiol Biotechnol，2008，18(5):958-963.

［20］ EGAMBERDIEVA D，LUGTENBERG B.Use of plant growth-promoting rhizobacteria to alleviate salinity stress in plants［M］//Use of microbes for the alleviation of soil stresses.New York:Springer，2014:73-96.

［21］ TEKAYA S B，TIPAYNO S，KIM K，et al.Rhizobacteria:restoration of heavy metal-contaminated soils［M］//AHMAD P，WANI M R.Physiological mechanisms and adaptation strategies in plants under changing environment.New York:Springer，2014:297-323.

［22］王銀科，宋劍飛.內(nèi)生菌在修復(fù)重金屬污染土壤的研究進(jìn)展［J］.北方環(huán)境，2013(12):68-71.

［23］ YANG W，XU Q，LIU H X，et al.Evaluation of biological control agents against Ralstonia wilt on ginger［J］.Biological Control，2012，62(3):144-151.