吳 祥， 姚克兵， 吉沐祥， 陳宏州， 楊敬輝， 李金鳳， 王莉莉

(1.江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 句容 212400;2.江蘇省綠盾植保農(nóng)藥實(shí)驗(yàn)有限公司，江蘇 句容 212444)

草莓(Fragaria ananassa Duch.)是多年生草本植物，因其果實(shí)色澤艷、營(yíng)養(yǎng)高、風(fēng)味濃，而備受栽培者和消費(fèi)者的青睞［1-6］。近年來(lái)，草莓種植面積逐年增大，品種不斷更新，頻繁地調(diào)種、引種以及連作，導(dǎo)致草莓枯萎病蔓延。再加上草莓灰霉病、白粉病、“v”型褐斑病、蛇眼病、炭疽病、紅中柱根腐病、根結(jié)線蟲(chóng)病、病毒病和革腐病［7-14］等不斷發(fā)生且日益嚴(yán)重，給種植戶帶來(lái)較大經(jīng)濟(jì)損失。

據(jù)報(bào)道，引起枯萎病的病原物主要有細(xì)菌性病原(如玉米細(xì)菌性枯萎病菌)和真菌性病原(如瓜類枯萎病菌)兩大類［15］。目前，研究較多的是鐮刀菌屬病原菌［16］，其中尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum Schl.)［17］和尖孢鐮刀菌草莓?；?Fusarium oxysporum f.sp.fragariae)是主要病原菌。枯萎病主要分布在美國(guó)、日本、澳大利亞和中國(guó)［18］，從苗期到收獲期的整個(gè)栽培過(guò)程中都會(huì)發(fā)生。目前生產(chǎn)上對(duì)該病害仍以化學(xué)防治為主，常用惡霉靈、多菌靈和甲基托布津、代森錳鋅等殺菌劑灌根防治，因連續(xù)多年使用這些藥劑，防治效果逐年降低，甚至達(dá)到無(wú)法控制的程度［19］。

句容地區(qū)種植草莓時(shí)間較早，發(fā)展規(guī)模和產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)水平在中國(guó)乃至東南亞享有較高知名度。近幾年隨著草莓品種更新和產(chǎn)業(yè)升級(jí)加快，紅頰草莓因大果率高、豐產(chǎn)性好、耐貯運(yùn)、甜度高、香味濃等特點(diǎn)，深受栽培者與消費(fèi)者歡迎，已經(jīng)成為句容地區(qū)大棚草莓主導(dǎo)品種，但苗期極易感炭疽病、枯萎病，移栽后枯萎病、炭疽病為害仍然嚴(yán)重，往往會(huì)造成毀滅性死苗，對(duì)農(nóng)民種植紅頰草莓的積極性造成很大的打擊，給紅頰草莓品種的推廣和農(nóng)戶致富帶來(lái)較大阻力［20］。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)草莓枯萎病的研究報(bào)道有:手塚信夫［21］利用從草莓植株體內(nèi)分離的非致病性鐮刀菌對(duì)草莓枯萎病進(jìn)行了生防試驗(yàn)，證明在健康植株上接種非致病性鐮刀菌可有效地防止草莓枯萎病發(fā)生。牧野孝宏［22］用非致病性尖孢鐮刀菌菌液浸草莓根，草莓未發(fā)生枯萎病。De Rodríguez 等［23］發(fā)現(xiàn)佛頭菊(Flourensia)浸提液對(duì)鐮刀菌有較好的防治效果。曾富春等［24］對(duì)草莓枯萎病病原菌的生物學(xué)特性進(jìn)行了研究。楊煥青等［19］對(duì)采自山東省煙臺(tái)市草莓枯萎病菌株進(jìn)行了生物學(xué)特性以及7種化學(xué)殺菌劑對(duì)草莓枯萎病菌的抑制作用研究。陳桂平等［25］2007-2008年對(duì)汕頭市草莓枯萎病田間發(fā)病情況進(jìn)行調(diào)查和田間化學(xué)藥劑防治試驗(yàn)，結(jié)果表明，該病在草莓定植后21 d開(kāi)始發(fā)病，田間發(fā)病常出現(xiàn)2個(gè)明顯的高峰:一個(gè)高峰出現(xiàn)在第1次噴施“九二0”7 d后，另一個(gè)高峰出現(xiàn)在11月底覆蓋薄膜之后7 d左右?；瘜W(xué)藥劑處理后，初期發(fā)病率均較低，隨著時(shí)間的推移，發(fā)病率越來(lái)越高，不同藥劑之間差異不明顯。于紅梅等［26-27］應(yīng)用PCR技術(shù)，結(jié)合形態(tài)學(xué)手段，對(duì)從江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院草莓生產(chǎn)基地采集的草莓枯萎病病原菌進(jìn)行分離鑒定，并進(jìn)行生物學(xué)特性研究，并采用生長(zhǎng)速率法進(jìn)行了4種化學(xué)殺菌劑對(duì)草莓枯萎病病原菌室內(nèi)毒力的測(cè)定，結(jié)果表明，4種參試殺菌劑對(duì)草莓枯萎病病原菌的抑制效果隨著殺菌劑濃度增大抑制效果增強(qiáng)，百菌清抑制效果較好，而乙嘧酚、噻菌銅、二氰蒽醌3種殺菌劑抑制效果相差不大。賈冬梅［28］用自然高溫土壤滅菌法對(duì)棚栽草莓枯萎病有較好防治效果。由于生防菌在土壤中定殖受諸多因素影響，制劑商業(yè)化困難，因此在生產(chǎn)中很少使用［29］。

本研究對(duì)江蘇省句容市草莓枯萎病進(jìn)行了調(diào)查，對(duì)分離到的病原菌進(jìn)行形態(tài)和分子鑒定以及致病性試驗(yàn)，選用6種生物或低毒化學(xué)藥劑對(duì)草莓枯萎病進(jìn)行了田間防治試驗(yàn)，為該病害的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 病害調(diào)查

2013年10月23 日至2013年11月1日，對(duì)句容市天王鎮(zhèn)、二圣鄉(xiāng)、白兔鎮(zhèn)3地的98個(gè)大棚(隨機(jī)選擇)進(jìn)行草莓枯萎病發(fā)生情況進(jìn)行調(diào)查，觀察病害癥狀，并拍照。同時(shí)采集具有典型枯萎病癥狀的標(biāo)本帶回實(shí)驗(yàn)室作為試驗(yàn)材料。

1.2 病原菌的分離及純化

將草莓根上的泥土洗凈，取病健交界處的組織，在超凈臺(tái)上用0.1%升汞進(jìn)行表面滅菌 (2～3 min)，然后用滅菌水洗3次，每次1 min，再用滅菌過(guò)的鑷子將分離組織轉(zhuǎn)移到PDA平板培養(yǎng)基上，共81皿，每皿5塊，置于PRX-250A型智能人工氣候箱內(nèi)培養(yǎng)［相對(duì)濕度70%，黑暗，(25±2)℃］。培養(yǎng)第5 d檢查、記錄分離到的菌落數(shù)量和菌落形態(tài)，統(tǒng)計(jì)真菌和細(xì)菌的出現(xiàn)頻率，并進(jìn)行編號(hào)。用挑針挑取菌落邊緣的幼嫩菌絲進(jìn)行純化培養(yǎng)，4℃保存［30］。

1.3 病原菌的鑒定

1.3.1 形態(tài)觀察 草莓枯萎病菌屬于半知菌亞門(mén)、絲孢綱、鐮刀菌屬的真菌，觀察分生孢子梗和分生孢子的形態(tài)和產(chǎn)生情況，可采用載玻片培養(yǎng)法［31］培養(yǎng)2～3 d，在德國(guó)蔡斯Imager.A1型光學(xué)顯微鏡下觀察分生孢子梗和分生孢子形態(tài)，拍照，測(cè)量分生孢子梗和分生孢子大小(n=30)。根據(jù)病原菌的形態(tài)特點(diǎn)、培養(yǎng)性狀，結(jié)合相關(guān)資料進(jìn)行病原菌鑒定［32-35］

1.3.2 分子鑒定

1.3.2.1 提取DNA 步驟如下:(1)真菌純化培養(yǎng)后收集菌體輕微離心，將菌絲收集在微管(Microtube)底部;(2)使用Pipette Tip尖端按壓菌體10次左右，進(jìn)行物理破碎;(3)加入400 μl的提取液1［Tris-HCl 100 mmol/L(pH8.0)，EDTA 50 mmol/L(pH8.0)，NaCl 500 mmol/L］，WH-861旋渦混合器(江蘇金壇華龍實(shí)驗(yàn)儀器廠生產(chǎn))劇烈振蕩5 s(3 000 r/min);(4)輕微離心，加入80 μl的提取液2(20%SDS)，產(chǎn)生白色沉淀，劇烈振蕩5 s后，溶液呈白濁狀態(tài);(5)輕微離心，加入150 μl的5 mol/L KAc，劇烈振蕩5 s;(6)輕微離心2 s，于50℃溫浴15 min;(7)12 000 r/min 4℃離心15 min;(8)取上層水相移至新的1.5 ml微管中;(9)添加等量的異丙醇(濃度≥99.7%)，輕柔混勻;(10)12 000 r/min 4℃離心10 min;(11)棄上清液，加入1 ml 70%乙醇，清洗沉淀;(12)12 000 r/min 4℃離心3 min;(13)棄上清液，沉淀干燥，加入適量TE Buffer(約20 μl)溶解沉。

1.3.2.2 PCR擴(kuò)增 采用通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTT ATTGATATGC-3')擴(kuò)增整個(gè)ITS序列。PCR體系如下:10 × Buffer 3 μl，Primer F/R(10 pmol/L)各 1 μl，dNTP 1 μl，聚合酶 1 μl，PCR 產(chǎn)物 0.5 ～1.0 μl，超純水30 μl。PCR反應(yīng)過(guò)程為94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，58 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸1 min，30 個(gè)循環(huán);72℃反應(yīng)后延伸3min，4℃暫時(shí)保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行回收純化，引物合成由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

1.3.2.3 測(cè)序反應(yīng) 在0.2 ml離心管中配置如下體系:超純水 5 μl，Primer(3.2 pmol/L 單引物)1 μl，Template 0.3 ～0.5 μl，BDT3.1 1 μl，PCR 反應(yīng)過(guò)程為:96℃預(yù)變性5 min;96℃變性30 s，50℃退火5 s，60℃延伸3 min，35個(gè)循環(huán);60℃反應(yīng)后延伸3 min，4℃暫時(shí)保存。清洗沉淀并上機(jī)反應(yīng)，測(cè)序儀采用ABI 3730XL。測(cè)序結(jié)果通過(guò)NCBI的Blast檢索系統(tǒng)進(jìn)行序列同源性比對(duì)。ITS序列的測(cè)序工作由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

1.4 致病性測(cè)定

在室溫條件下，用分離得到的菌株制成的孢子懸浮液(在顯微鏡10×10倍鏡下，孢子濃度以視野中含有50～100個(gè)孢子為宜)涂抹接種健康草莓的根部，以蒸餾水為對(duì)照，重復(fù)3次，每次10株，接種后保濕24 h，每7 d觀察1次。按照柯赫法則進(jìn)行驗(yàn)證，以確認(rèn)所分離的真菌是否為致病菌。

1.5 試驗(yàn)藥劑

1.5.1 田間試驗(yàn)藥劑 1×109CFU/g多黏芽孢桿菌(JX-13)WP(江蘇省綠盾植保農(nóng)藥實(shí)驗(yàn)有限公司生產(chǎn));1%申嗪霉素SC(上海農(nóng)樂(lè)生物制品有限公司生產(chǎn));1 g含6×108有效活性菌數(shù)的哈茨木霉T-22GR(荷蘭科伯特公司生產(chǎn));1×1011CFU/g枯草芽孢桿菌(DJ-6)WP(江蘇省綠盾植保農(nóng)藥實(shí)驗(yàn)有限公司加工生產(chǎn));1 g含1×106個(gè)孢子的寡雄腐霉WP(捷克生物制劑有限公司生產(chǎn));250 g/L吡唑醚菌酯EC(巴斯夫歐洲公司生產(chǎn))。

1.5.2 田間試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)設(shè)在句容市石獅鎮(zhèn)農(nóng)戶鄔平章草莓大棚中(2012年枯萎病發(fā)生嚴(yán)重田塊)，2013年夏季高溫悶棚處理61 d。草莓品種為紅頰，2013年9月8日定植，定植時(shí)灌根1次，每株藥液量均為200 ml，7 d后灌根1次，共防治2次。用清水灌根作為對(duì)照。

藥劑濃度與處理方法:(1)1×1011CFU/g枯草芽孢桿菌(DJ-6)WP 1000倍液;(2)1×109CFU/g多黏芽孢桿菌(JX-13)WP 1000倍液;(3)1 g含1×106個(gè)孢子的寡雄腐霉WP 7 000倍液;(4)1%申嗪霉素SC 900倍液;(5)1 g含6×108有效活性菌數(shù)的哈茨木霉T-22GR 500倍液;(6)250 g/L吡唑醚菌酯EC 2000倍液;(7)空白對(duì)照為清水。每處理3次重復(fù)，每小區(qū)50 m2，田間隨機(jī)區(qū)組排列。

2 結(jié)果與分析

2.1 草莓枯萎病的田間癥狀

草莓枯萎病主要危害根部，從開(kāi)花至收獲期均可發(fā)生，發(fā)病初期草莓植株的心、葉變?yōu)辄S綠色或黃色，有的蜷縮呈波狀產(chǎn)生畸形葉，病株葉片失去光澤，植株生長(zhǎng)衰弱，在三出復(fù)葉中往往有1～2片小葉畸形或者變小、硬化，且多發(fā)生在植株的一側(cè)。老葉呈紫紅色萎蔫，葉片枯黃，最后全株枯死(圖1)。受害植株的根冠部、葉柄、果梗維管束都變成褐色或黑褐色。草莓枯萎病可導(dǎo)致草莓結(jié)果減少，果實(shí)無(wú)法正常生長(zhǎng)膨大，品質(zhì)降低，甚至全株枯死［19］。

2.2 病原菌分離與鑒定

2.2.1 分離結(jié)果 本研究共分離405塊草莓枯萎病植株根部組織，其中從381塊草莓枯萎病植株根部組織中分離到真菌，占被分離草莓枯萎病植株根部組織總量的94.1%;分離到鐮刀菌(Fusarium oxysporum)的草莓枯萎病植株根部組織276塊，占分離到真菌的72.4%，分離到綠木霉(Trichoderma viride Pers.ex Fr.)的草莓枯萎病植株根部組織41塊，占分離到真菌的10.8%，分離到球黑孢菌(Nigrosporasphaerica Mason)的草莓枯萎病植株根部組織7塊，占分離到真菌的1.8%;分離到其他真菌的草莓枯萎病植株根部組織57塊，占分離到真菌的15.0%;分離到細(xì)菌的草莓枯萎病植株根部組織24塊，占被分離草莓枯萎病植株根部組織總量的5.9%。

2.2.2 形態(tài)學(xué)特征 尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysoporum Schl.)，在 (25±2)℃的PDA培養(yǎng)基上(相對(duì)濕度70%，黑暗)，菌落初為白色，漸變?yōu)榛疑偷仙?圖2 A)，平均日生長(zhǎng)量為27 mm，氣生菌絲絨毛狀，灰色。在人工培養(yǎng)過(guò)程中未出現(xiàn)有性世代。分生孢子梗單生(圖2 B)，直立，無(wú)色，大小 (6.3～63.8)μm×(1.9～2.8)μm，小型分生孢子在分生孢子梗頂端形成假頭狀，無(wú)色，大多數(shù)為單細(xì)胞，橢圓形、圓柱形，少量彎曲(圖 2C)，大小 (4.7～12.6)μm×(2.7～4.2)μm;大型分生孢子梭形，稍彎曲，兩端尖，多為 3個(gè)分隔(圖 2 D)，大小(21.0～40.4)μm×(3.2～5.8)μm，少數(shù)為 4～5個(gè)分隔，大小 (33.2～56.3)μm×(3.7～6.3)μm;厚垣孢子多，中生，厚壁(圖 2 E)，大小 (9.0～17.6)μm×(8.2～15.8)μm。

圖2 尖孢鐮刀菌的形態(tài)學(xué)特征Fig.2 Morphological characteristics of Fusarium oxysporum

2.2.3 分子鑒定 提取尖孢鐮刀菌菌絲DNA，用ITS1和ITS4的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長(zhǎng)度為546 bp的特異性DNA片段，擴(kuò)增ITS區(qū)全序列(圖3)。對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行測(cè)序，用NCBI的Blast在Gen-Bank中搜尋相似序列。結(jié)果與GenBank中登陸號(hào)為EF495230.1(包括18 S核糖體RNA基因的部分序列，內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1，5.8 S核糖體RNA基因全序列，內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2全序列和28 S核糖體RNA基因部分序列)的同源性為100%，因此，確定草莓上分離到的菌株為尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum Schl.)。

2.3 病原菌的致病性

草莓植株接種22 d后，全部發(fā)病，45 d后全部枯死，癥狀與田間發(fā)病相同，對(duì)照不發(fā)病(圖4)。將接種后發(fā)病的植株進(jìn)行再次分離，分離到了同樣的病菌，符合柯赫氏法則。由此證明分離到的病原菌為草莓枯萎病病原菌。

圖3 ⅠTS 1和ⅠTS 4區(qū)域的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.3 PCR ofⅠTS 1 and ⅠTS 4 of Fusarium oxysporum

圖4 草莓枯萎病菌的致病性Fig.4 Pathogenicity of strawberry fusarium wilt pathogen

2.4 田間防治效果

田間試驗(yàn)第1次調(diào)查(施藥后30 d)結(jié)果表明，250 g/L吡唑醚菌酯EC 2 000倍液、1%申嗪霉素SC 900倍液防治效果均為100%，兩者均極顯著好于其他參試藥劑處理;1×109CFU/g多黏芽孢桿菌(JX-13)WP1000倍液、1 g含1×106個(gè)孢子的寡雄腐霉WP 7 000倍液、1 g含6×108有效活性菌數(shù)的哈茨木霉T-22GR 500倍液的防治效果均為82.61%，極顯著好于1×1011CFU/g枯草芽孢桿菌(DJ-6)WP 1 000倍液的防治效果(表1)。

第2次調(diào)查(施藥后51 d)結(jié)果表明，250 g/L吡唑醚菌酯EC 2 000倍液的防治效果為93.11%，極顯著好于其他參試藥劑的防治效果;1×109CFU/g多黏芽孢桿菌(JX-13)WP 1 000倍液、1 g含1×106個(gè)孢子的寡雄腐霉WP 7 000倍液、1%申嗪霉素SC 900倍液的防治效果均為58.63%，顯著好于1×1011CFU/g枯草芽孢桿菌(DJ-6)WP 1 000倍液的防治效果和1 g含6×108有效活性菌數(shù)的哈茨木霉T-22 GR 500倍液的防治效果。

3 討論

表1 6種藥劑對(duì)草莓枯萎病田間防治效果調(diào)查表Table 1 The field control effects of 6 fungicides on strawberry fusarium wilt

本研究共分離405塊草莓枯萎病植株根部組織，得到381株真菌，全部為半知菌亞門(mén)的真菌，其中鐮刀菌屬的真菌(Fusarium)占真菌種類的72.4%。通過(guò)形態(tài)特征觀察和DNA測(cè)序結(jié)果分析確認(rèn)草莓枯萎病病原菌為尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysoporum Schl.)。致病性試驗(yàn)結(jié)果證明，草莓植株接種22 d后全部發(fā)病，癥狀與田間發(fā)病相同，再次分離得到了同樣的病原菌，符合柯赫氏法則。6種農(nóng)藥對(duì)草莓枯萎病田間防治效果試驗(yàn)結(jié)果顯示，250 g/L吡唑醚菌酯EC 2 000倍液防治效果最佳，1%申嗪霉素 SC 900倍液的防治效果次之。1×109CFU/g多黏芽孢桿菌(JX-13)WP 1 000倍液、1 g含1×106個(gè)孢子的寡雄腐霉WP 7 000倍液等均有一定防治效果。

隨著草莓種植面積的不斷擴(kuò)大，多種草莓病害不斷發(fā)生，且有加重的趨勢(shì)，主要原因是草莓種苗帶菌和同一地塊多年連作所致，此外，也有可能是病原菌發(fā)生變異，產(chǎn)生新菌株或生理小種所致。針對(duì)這些問(wèn)題，有必要尋找一種較安全、有效的病害控制措施，以達(dá)到阻止病害發(fā)生，保障草莓產(chǎn)業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展。

從目前對(duì)草莓枯萎病等病害的防治措施來(lái)看，種植戶仍以化學(xué)藥劑為主，生物農(nóng)藥為輔，應(yīng)用化學(xué)藥劑防治植物病害，雖能快速有效地達(dá)到防治目的，但長(zhǎng)期單一使用，病原菌會(huì)產(chǎn)生抗藥性［36］。應(yīng)力求推薦符合草莓高效安全標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)要求的植物源和微生物源農(nóng)藥。生物防治在應(yīng)用中對(duì)環(huán)境較安全，污染較小，成本較低，成為了目前研究和開(kāi)發(fā)的熱點(diǎn)［37］。王占武等［38］報(bào)道了連續(xù) 2 年使用拮抗菌(B.subtilis)在草莓根際定植防治草莓枯萎病具有很好的的效果;吳加志等［39］發(fā)現(xiàn)腸桿菌屬(Enterobacter spp.)和假單孢菌屬(Psudomonas spp.)中的一些菌對(duì)由尖孢鐮刀菌引起的枯萎病具有明顯的防治效果;Porras等［40］利用太陽(yáng)能土壤消毒和木霉菌(Trichoderma)結(jié)合的方法，得出在太陽(yáng)高溫消毒后再添加生物菌劑的方法防治草莓枯萎病也具有很好的效果;陳義群等［41］研究發(fā)現(xiàn)優(yōu)化施肥模式對(duì)控制草莓枯萎病有顯著的作用。

新型低毒化學(xué)殺菌劑吡唑醚菌酯與生物藥劑申嗪霉素防治效果最好，多種微生物菌劑均有一定效果。我們?cè)趯?shí)際生產(chǎn)中應(yīng)用草莓連作大棚夏季太陽(yáng)能高溫消毒處理，草莓定植后采用生物藥劑灌根1～2次，能基本控制枯萎病等連作病害的發(fā)生。為進(jìn)一步提高生物農(nóng)藥的防治效果，需對(duì)微生物菌劑間混用效果或微生物菌劑與吡唑醚菌酯、申嗪霉素等混用效果做進(jìn)一步研究。

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