周曉嬰， 付三雄， 陳 松， 張 超， 戚存扣

(1.國家油菜改良中心南京分中心，江蘇 南京 210014;2.農(nóng)業(yè)部長江下游棉花與油菜重點實驗室，江蘇 南京 210014;3.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所，江蘇 南京 210014)

植物雌性不育通常由雌性器官發(fā)育異常引起，雌性不育表型具有多樣性，不育機理復雜。了解其細胞分子機理對揭示植物花器官發(fā)育的分子機理以及在生產(chǎn)中克服不育性和利用雌性不育作為雜交育種手段等都具有重要的理論與實踐意義［1］。

甘藍型油菜雌性不育突變體FS-M1于1996年在甘藍型油菜(Brassica napus L.)品種寧油10號的135個株系群體中偶然被發(fā)現(xiàn)。形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn)突變株FS-M1雌蕊明顯短于雄蕊，無蜜腺，柱頭乳突細胞較大但數(shù)量較少，粘附花粉能力弱，柱頭授粉功能缺陷。切除柱頭及部分花柱后再授粉，在FS-M1花柱中觀察到伸長的花粉管，授精結角也接近正常。FS-M1雌性不育現(xiàn)象可能與柱頭乳突細胞發(fā)育畸變和功能缺失有關，與自交不親和無關［2-3］。遺傳研究結果顯示FS-M1的突變性狀由2對隱性基因控制，遺傳性狀穩(wěn)定，植株花粉育性正常［4］。

付三雄曾利用Agilent公司生產(chǎn)的油菜全基因組4×44K芯片比較了油菜FS-M1及其野生型花器官的轉錄組，發(fā)現(xiàn)突變體花器官組織1個CRABS CLAW(CRC)轉錄因子的基因表達量顯著下調。本研究為了進一步驗證CRC轉錄因子在油菜花器官發(fā)育中的作用，以及導致油菜FS-M1雌性不育性狀的決定因素是否與CRC基因表達量顯著下調有關，根據(jù)同源序列克隆了甘藍型油菜CRC基因，并構建CRC基因干擾表達載體，擬通過轉基因來驗證CRC基因的功能，明確CRC基因下調表達與FS-M1雌性不育的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

克隆載體pEASY-T1及感受態(tài)大腸桿菌DH5ɑ購自南京百斯凱公司，RNA提取試劑盒為Promega公司產(chǎn)品，瓊脂糖凝膠回收試劑盒及細菌質粒小量提取試劑盒均購自北京天根生物有限公司，Ex Taq、DNA Marker、RNA反轉錄試劑盒、各種限制性內切酶(如 EcoR I、Xho I、Hin III、BamH I、Not I等)、T4連接酶、堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase)均購自TaKaRa公司，X-gal、IPTG、酵母提取物、蛋白胨、抗生素等購自南京基天生物公司。測序由上海英駿公司完成。

中間載體pHurricane、表達載體 pCAMBIA1390系本實驗室保存。

1.2 CRC基因克隆

本試驗依據(jù)已經(jīng)公開的甘藍型油菜CRC基因cDNA序列(登錄號為XM00910 7216)設計RT-PCR引物。引物同時引進 NotⅠ和 XhoⅠ酶切位點，CRCXNFF:5'-CTCGAGCGGCCGCATGAACCTTGAA GAGAAACC-3'，CRCXNR R:5'-CTCGAGCGGCCGCATTTCCTTGGGCTATCACCTT-3'，以甘藍型油菜品種寧油10號花蕾RNA反轉錄cDNA為模板，采用Ex Taq酶PCR擴增靶基因序列片段，將目標條帶克隆到pEASY-T1載體上，挑選陽性克隆測序，并與目標序列進行比對分析，獲得含CRC基因片段的克隆載體pT-CRC。

1.3 CRC基因反向重復框構建

根據(jù)中間載體pHurricane內含子序列設計特異性引物:INTRONFW:5'-CGTATTCTCAACGCAATC-3'，和 INTRONRV:5'-CAAAGTGGGAAATCAGGT-3'，用于鑒別靶序列插入方向。用 Not I酶切pT1-CRC，回收580bp目的片段。同時利用Not I酶切pHurricane載體，并進行末端去磷酸化處理后，再與目的片段連接，連接產(chǎn)物轉化感受態(tài)大腸桿菌。采用INTRONRV和CRCXNF引物對鑒定正向插入的陽性克隆，此時獲得的中間載體命名為pH-CRCF。再用Xho I酶切pT-CRC，回收580 bp目的片段，用Xho I酶切pH-CRCF載體，并去磷酸化處理、純化后與目的片段連接，連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌。用INTRONFW和CRCXNF引物對進行菌落PCR，選擇反向插入的陽性克隆。此時獲得的中間載體命名為pH-CRCir，包含目的基因反向重復框。

1.4 CRC干擾表達載體的組裝及酶切鑒定

本試驗選擇CaMV35S啟動子作為CRC反向重復序列表達框的啟動子。以pCAMBIA1390質粒DNA為模板，設計特異性擴增引物，在35SHF 5'端加Hind III的酶切位點，在35SBR 5'端增加BamH I的酶切位點。35SHF:5'-AAGCTTATGGTGGAGCACGACACTCT-3'，35SBR:5'-GGATCCAGAGATAGATTTGTA GAGAG-3'，擴增35S序列，先將擴增產(chǎn)物克隆到pEASY-T載體上，再用Hind III和Bam H I雙酶切獲得780bp大小的35S啟動子序列，再組裝到pCAMBIA1390載體相應的酶切位點上，得中間載體pCAMBIA1390-35S。

用BamHⅠ和EcoRⅠ分別雙酶切pCAMBIA1390-35S和pH-CRCir，回收純化線性化的pCAMBIA1390-35S載體片段和大小約2.3 kb的CRC正反向重復框片段，將回收產(chǎn)物用T4連接酶連接后轉化大腸桿菌。用CRCXNF和CRCXNR引物進行菌落PCR鑒定陽性克隆，并提取陽性克隆質粒DNA，分別用單酶切(HindⅢ)和雙酶切(BamHⅠ和EcoRⅠ)進行鑒定并測序，獲得的載體定名為pA6-CRCi。

2 結果

2.1 油菜CRC基因片段克隆與序列分析

本研究對甘藍型油菜寧油10號花蕾RNA進行RT-PCR，擴增到1個約580 bp大小的產(chǎn)物(圖1)。經(jīng)克隆測序，并用BioXM軟件對其核酸序列進行分析，結果顯示該cDNA全長580 bp，具有1個編碼193個氨基酸的開放式閱讀框。

圖1 CRC基因克隆菌落PCR鑒定結果Fig.1 The PCR amplification of CRC gene clones

用BLAST在線分析軟件進一步將所克隆的cDNA序列與GenBank中登錄的油菜、擬南芥等多種植物的CRC基因cDNA序列進行同源性比較，發(fā)現(xiàn)該核苷酸序列與油菜、擬南芥、非洲獨行菜、蕓薹、甘藍等植物中的CRC基因序列高度同源，相似性大于90%，其中與甘藍型油菜CRC基因的cDNA序列(XM 009107216)同源性達99%，表明所克隆序列即為油菜CRC基因序列，此克隆定名為pT-CRC。

2.2 油菜CRC基因反向重復表達框構建及酶切鑒定

將2.1克隆到的CRC基因片段分2步，依次克隆到中間載體pHurricane內含子兩側的Not I和Xho I限制性內切酶位點。分別利用內含子上的引物INTRONRV和INTRONFW與干擾片段的上游引物CRCNX F組合進行菌液PCR鑒定，可以篩選到干擾片段正向插入Not I位點的陽性克隆和反向插入Xho I位點的陽性克隆(圖2)。

圖2 PCR鑒定CRC基因片段插入正反方向克隆Fig.2 PCR identification of CRC positive clones

培養(yǎng)經(jīng)PCR鑒定后的陽性克隆菌株，提取質粒，分別用Not I和Xho I限制性內切酶酶切，均可以切出大小約580 bp的條帶(圖3)。進一步用BamH I和EcoR I限制性酶進行雙酶切，可以獲得大小2.29 kb左右的片段(圖3)，該片段包含有正向插入、反向插入的干擾片段和內含子片段，表明CRC基因片段已成功連接到中間載體的相應酶切位點上。

圖3 酶切鑒定pH-CRCirFig.3 Enzymatic identification of pH-CRCir

2.3 CRC基因ihpRNAi植物表達載體構建

為構建組成型表達的CRC基因的干擾載體，本研究選擇CaMV35S啟動子作為CRC反向重復表達框的啟動子。首先通過PCR從pCAMBIA1390上擴增1個780 bp的增強型CaMV35S啟動子，再經(jīng)過酶切與連接等步驟，將 CaMV35S啟動子連接到pCAMBIA1390雙元表達載體的Hind III和BamH I位點上，再用BamH I和EcoR I雙酶切，獲得2.29 kb的CRC基因反向重復框片段，與同樣雙酶切的pCAMBIA1390-35S載體片段連接后最終形成CRC基因的干擾表達載體 pA6-CRCi。pA6-CRCi經(jīng)BamH I和EcoR I雙酶切驗證，酶切圖譜中含有2.29 kb大小的CRC反向重復表達框片段(圖4)。表明CRC基因的干擾重復框已經(jīng)成功連接到帶pCAMBIA1390-35S雙元表達載體上。最終形成的pA6-CRCi載體含有1個由CaMV35S啟動子驅動的CRC反向重復序列表達框，終止子是原載體自帶的nos終止子。

圖4 BamHⅠ和EcoRⅠ酶切鑒定pA6-CRCiFig.4 Enzymatic identification of pA6-CRCi with BamHⅠand EcoRⅠ

3 討論

植物的雌性不育現(xiàn)象普遍存在，在水稻［5］、油松［6］、小麥［7］、甘藍型油菜［2］、大豆［8］和苜蓿［9］等十余種植物中均報道過雌性不育現(xiàn)象。導致植物雌性不育的原因比較復雜，而遠緣雜交后代發(fā)現(xiàn)雌性不育的報道比較多。Stort［10］將蘭花的屬間或種間F1代與母本回交，發(fā)現(xiàn)其回交后代結實率下降，且雌性不育率遠遠大于雄性不育率。劉永勝等［11］觀察到水稻秈粳F(xiàn)1雜種的結實率僅為40% ～60%，其主要原因是由雌性不育引起。離體培養(yǎng)易產(chǎn)生無性系變異，也是產(chǎn)生雌性不育突變體的原因之一［5］。環(huán)境的變化也會影響植物的育性，Lillecrapp等［12］在Trevatt Blue的研究中發(fā)現(xiàn)，溫度可以影響到胚珠的數(shù)量，進而形成多胚珠現(xiàn)象而導致雌性不育。

植物雌性不育的原因相當復雜，一些表現(xiàn)為大孢子母細胞減數(shù)分裂不正常，不能形成功能性大孢子。Rim［13］等研究發(fā)現(xiàn)豆科百脈根屬2個種的體細胞雜交后代由于大孢子母細胞減數(shù)分裂后期發(fā)生異常，不能形成4個大孢子而導致雌性不育;也有的是因為不能形成成熟的胚囊［14］或胚珠發(fā)育異常而導致不結實［15］。此外，雌蕊發(fā)育異常，如多雌和雌蕊短小等突變現(xiàn)象，也會引起育性降低或不育［16］。近幾年來人們應用遺傳學方法與分子生物學技術研究植物雌性不育的分子機理，發(fā)現(xiàn)了一些與雌性不育相關的基因。Lang等［17］研究證實，擬南芥sinl基因的突變會導致胚珠畸形發(fā)育與雌性不育的發(fā)生。Tian等［18］發(fā)現(xiàn)擬南芥中組蛋白脫乙?；?AtHD1)表達下調會導致許多異?，F(xiàn)象產(chǎn)生，包括花器官缺陷及雌性和雄性不育。Capomaccio等［19］對紫花苜蓿雌性不育突變株和可育對照株雜交分離后代進行了cDNA-AFLP擴增分析，篩選并鑒定了3個與雌性不育性狀相關的基因MsBGluc、MsMAPKKK和MselF4G。

大多數(shù)植物的雌性不育在花的外觀特征上都有所表現(xiàn)。如Carapetian［20］等在紅花的雌性不育研究中觀察到2個紅花品種雜交產(chǎn)生的不育植株開花時會發(fā)生小花的干枯和花柄的延長。一些學者試圖從花器官發(fā)育調控方面去尋找雌性不育的內在原因，其中花發(fā)育調控相關的一些轉錄因子受到人們的普遍關注，如YABBY家族的INNER NO OUTER(INO)參與了擬南芥胚珠的發(fā)育［21］;TONGARI-BOUSHI1(TOB1)參與了水稻小穗的發(fā)育［22］。而擬南芥CRABS CLAW(CRC)轉錄因子也屬于YABBY基因家族成員，是控制心皮發(fā)育的關鍵性基因，Alvarez等［23］報道CRC可抑制正在發(fā)育的雌蕊的橫向生長，促進其軸向生長，CRC基因突變將引起雌蕊呈現(xiàn)較寬而短的結構，且使兩心皮在頂點處呈非融合狀態(tài)，并導致蜜腺的缺失［24-25］。心皮發(fā)育還有SPT(SPATULA)基因［26-27］及花器官確定基因AGA(AGAMOUS)的參與［28］。從一些心皮突變體的研究中，首先認為CRC基因很有可能是AGA調節(jié)的下游基因［25］。對分離到的2個突變基因CRC、SPT的研究發(fā)現(xiàn)，二者除了影響雌蕊的發(fā)育之外還導致其他不同的生理缺陷，通過對CRC、SPT和AGA以及其他的相關基因的詳細分析，發(fā)現(xiàn)CRC和SPT 2個基因都與心皮的發(fā)育有關，在心皮發(fā)育過程中CRC和SPT是與AGA平行起作用，而不是位于AGA的下游。

FS-M1突變體是研究甘藍型油菜柱頭發(fā)育分子機理的理想材料。李春宏等［4］基于蛋白質組學水平比較甘藍型油菜野生型和FS-M1的柱頭差異蛋白質，獲得了甘藍型油菜野生型柱頭顯著上調且可鑒定的蛋白質有33個，包括抗脅迫/防御、氧化還原反應平衡調節(jié)、碳水化合物代謝、蛋白質水解、蛋白折疊、氨基酸和氮代謝、核苷酸代謝等7類功能蛋白。李春宏等［29］以FS-M1突變體和其野生型為材料利用油菜基因表達譜芯片篩選甘藍型油菜柱頭特異表達基因，發(fā)現(xiàn)野生型較FS-M1顯著上調的基因多達198個，主要是水解酶基因、轉移酶基因、氧化還原酶基因和轉錄因子中。但目前尚沒有詳實的證據(jù)闡明油菜突變體FS-M1雌性不育的原因。

我們對油菜雌性不育突變體FS-M1初步研究發(fā)現(xiàn)，其CRC基因表達水平較野生型對照極顯著下調，結合先前的研究報道FS-M1突變體柱頭短小且異常，因此我們推測油菜CRC基因下調可能是油菜雌性不育突變體FS-M1的內在原因。為此，我們構建了CRC基因的RNAi干擾載體，以期通過下調CRC表達，驗證其在FS-M1突變體中所起的作用。本研究利用同源序列法通過PCR擴增克隆了油菜CRC基因序列，經(jīng)過與已知序列進行比對分析，證明本試驗所克隆的基因序列正是甘藍型油菜的CRC基因序列。我們利用 pHurricane載體構建CRC反向重復序列表達框，該表達框有1個擬南芥的FAD2基因的可剪切的內含子序列，兩邊有多個限制性內切酶位點可供選擇。將CRC基因片段分別插入該載體的Not I和Xho I位點，結合內含子序列設計的引物，可以比較方便地選擇片段插入的方向。應用該載體我們成功構建了多個基因的干擾載體［30-31］。在本研究中我們選擇了增強型的CaMV35S啟動子，該啟動子全長序列780 bp左右，5'端有一段重復序列，可以起到增強表達的作用，用該啟動子驅動CRC的反向重復序列表達框，目的是提高組成型表達的強度，達到徹底抑制CRC表達的效果。本試驗成功構建組成型表達的CRC基因干擾載體，經(jīng)過酶切驗證和序列分析，表明所構建的載體正確，這為進一步開展農(nóng)桿菌遺傳轉化油菜奠定了基礎。

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