劉 翠，楊書程，李 民，劉培慶*，陳纘光，張仁偉

(1．中山大學(xué) 藥學(xué)院 新藥成藥性評(píng)估與評(píng)價(jià)國(guó)家地方工程實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510006;2．太原市婦幼保健院藥劑科，山西 太原 030012;3．中山大學(xué) 藥學(xué)院 醫(yī)藥儀器研究所，廣東 廣州 510006)

醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)是事關(guān)國(guó)家未來經(jīng)濟(jì)社會(huì)發(fā)展的重要戰(zhàn)略性產(chǎn)業(yè)，是世界公認(rèn)的最具發(fā)展前景的國(guó)際化高技術(shù)產(chǎn)業(yè)之一。新藥研發(fā)帶來的新技術(shù)創(chuàng)新和新品種上市是推動(dòng)醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的源動(dòng)力。隨著現(xiàn)代科技的發(fā)展，計(jì)算機(jī)模擬設(shè)計(jì)、化學(xué)合成、生物提取、天然產(chǎn)物提取等領(lǐng)域的技術(shù)突飛猛進(jìn)，使得目標(biāo)化合物的獲取更加快速高效，并在此基礎(chǔ)上建立了以來源、結(jié)構(gòu)、作用等不同特點(diǎn)進(jìn)行分類的各種化合物庫(kù)，化合物庫(kù)的樣品數(shù)量從幾百到上百萬不等［1－2］。如美國(guó)ChemDiv公司擁有全球最大的小分子化合物庫(kù)，除了目前庫(kù)存的125萬種化合物以外，每年以15萬種新化合物的速度遞增。我國(guó)的化合物樣品庫(kù)儲(chǔ)量在2015年將超過100萬個(gè)，具有結(jié)構(gòu)多樣化、存儲(chǔ)專業(yè)化、管理集中化、信息系統(tǒng)化和質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)化等特點(diǎn)。如何從海量的化合物中篩選出有藥理活性的化合物或先導(dǎo)化合物，是目前醫(yī)藥行業(yè)的研究熱點(diǎn)之一，也是各科研院所、醫(yī)藥公司傾力投資發(fā)展的一個(gè)重要方向［3－4］。

藥物篩選是指對(duì)可能作為藥物使用的各種物質(zhì)，包括化學(xué)合成的化合物、蛋白多肽、天然產(chǎn)物、海洋產(chǎn)物等，應(yīng)用適當(dāng)?shù)暮Y選方法和篩選技術(shù)，檢測(cè)其可能存在的藥理活性，為開發(fā)新藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)的方法，是連接藥物從實(shí)驗(yàn)室研究到臨床應(yīng)用的重要紐帶，也是提高研發(fā)效率、縮短周期、減少成本、降低風(fēng)險(xiǎn)、使新藥研發(fā)能夠持續(xù)進(jìn)行的關(guān)鍵［5］。藥物篩選的歷史悠久，所采用的技術(shù)、方法也在不斷進(jìn)步，新技術(shù)的應(yīng)用，促進(jìn)了藥物篩選的發(fā)展和進(jìn)步。應(yīng)用新的藥物篩選技術(shù)也成為醫(yī)藥科學(xué)研究的重要內(nèi)容［6］。本文就近年來新發(fā)展的藥物篩選技術(shù)并結(jié)合現(xiàn)有的藥物篩選技術(shù)及其應(yīng)用進(jìn)行了簡(jiǎn)要綜述，主要包括高通量篩選技術(shù)、高內(nèi)涵篩選技術(shù)、表面等離子體共振技術(shù)及微流控芯片藥物篩選技術(shù)。

1 高通量篩選技術(shù)

1.1 高通量篩選技術(shù)的發(fā)展

高通量篩選(High throughput screening，HTS)技術(shù)，首先需要配備快速處理樣品的全自動(dòng)工作站，靈敏快速的檢測(cè)儀器和強(qiáng)大的計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)等硬件設(shè)備，以分子水平或細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)方法為基礎(chǔ)，以微孔板作為實(shí)驗(yàn)工具載體，通過程序控制，同一時(shí)間對(duì)數(shù)以千萬的樣品進(jìn)行檢測(cè)，并以相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫(kù)系統(tǒng)支持整體運(yùn)轉(zhuǎn)的技術(shù)體系［7］。HTS技術(shù)大多是以光學(xué)檢測(cè)為基礎(chǔ)而建立的分子水平或細(xì)胞水平的分析檢測(cè)方法，包括光吸收檢測(cè)、熒光檢測(cè)、化學(xué)發(fā)光檢測(cè)等。由于HTS在創(chuàng)新先導(dǎo)物的發(fā)現(xiàn)過程中具有快速、高效、微量等特點(diǎn)，雖然其出現(xiàn)只有幾十年時(shí)間，卻已在全世界新藥研究機(jī)構(gòu)、大型醫(yī)藥公司的創(chuàng)新藥物發(fā)現(xiàn)過程中廣泛應(yīng)用。HTS模型以分子水平居多，篩選的靶點(diǎn)包括離子通道、酶和受體等。HTS通常以單一的篩選模型對(duì)大量樣品的活性進(jìn)行評(píng)價(jià)，從中發(fā)現(xiàn)針對(duì)某一靶點(diǎn)具有活性的樣品［8］。靶標(biāo)庫(kù)和化合物庫(kù)的建立，不僅為創(chuàng)新藥物的發(fā)現(xiàn)提供了機(jī)遇，也對(duì)HTS效率提出了新的要求，使HTS朝著日篩選規(guī)模越來越大，速度越來越快的方向發(fā)展。目前已形成了可日篩選10萬樣次的超高通量篩選技術(shù)(Ultra high throughput screening，uHTS)［9－10］。

1.2 高通量篩選技術(shù)的應(yīng)用

潘麗等［11］建立了穩(wěn)定可靠的以轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活子(STAT3)為靶標(biāo)的抗腫瘤HTS模型，應(yīng)用該模型對(duì)8 248個(gè)潛在的抗癌藥物進(jìn)行篩選，抑制率在80%以上的有5種，在500 μmol/L藥物濃度下，化合物MDC6的抑制率最高為92%，為后續(xù)MDC6的抗癌研究提供了可靠的前期數(shù)據(jù)。羅睿等［12］建立以蛋白激酶A為靶點(diǎn)的抗結(jié)核藥物HTS模型，利用該模型對(duì)4 000個(gè)微生物發(fā)酵液粗提物樣品進(jìn)行篩選，最終得到21個(gè)抑制蛋白激酶A活性的陽性樣品，陽性率為0.53%;以恥垢分枝桿菌和海分枝桿菌為檢定菌，平板紙片法檢測(cè)陽性樣品的抗分枝桿菌活性，然后對(duì)HTS篩選的陽性樣品的細(xì)胞毒性和酶活抑制特異性進(jìn)行評(píng)價(jià)，最終得到8個(gè)陽性樣品，其中有4個(gè)陽性樣品的酶活抑制特異性、抗菌活性均較好，且細(xì)胞毒性較低，證明該篩選模型得到的陽性藥品值得進(jìn)一步研究。隨著耐藥菌株的出現(xiàn)，抗生素的研發(fā)變得更加緊迫。應(yīng)用HTS技術(shù)，能快速?gòu)娜斯ず铣苫衔飵?kù)或天然產(chǎn)物化合物中篩選出具有潛在抗菌活性的物質(zhì)。Duetz等［13］提供的高通量發(fā)酵技術(shù)能在96孔板中進(jìn)行菌種發(fā)酵，發(fā)酵過程能與自動(dòng)化的提取和掃描平臺(tái)整合。該方法能夠在較短時(shí)間內(nèi)研究多達(dá)20種不同的培養(yǎng)基質(zhì)對(duì)微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物的影響。平板霉素正是采用這種新篩選方法得到的產(chǎn)物［14］。流感病毒的PA_N蛋白高度保守，且具有核酸內(nèi)切酶活性，是抗流感藥物研發(fā)的潛在靶點(diǎn)。張國(guó)防等［15］采用HTS體系，從372種化合物中篩選出3種對(duì)流感病毒H5N1的PA_N蛋白抑制作用較好的化合物。將這3種化合物分別與PA_N蛋白進(jìn)行分子對(duì)接模擬，結(jié)果顯示它們均可與PA_N蛋白活性位點(diǎn)的二價(jià)金屬離子和氨基酸殘基相互作用，從而為抗流感病毒藥物的發(fā)現(xiàn)提供了先導(dǎo)化合物。Canavaci等［16］建立了用化學(xué)發(fā)光方法檢測(cè)β-半乳糖苷酶的HTS模型，以384孔板為載體，篩選了NIH化合物庫(kù)中的303 224種化合物，得到4 394種能對(duì)抗美洲錐蟲病的陽性樣品，隨后的毒性檢測(cè)顯示，其中有3 005種化合物的IC50＜10 μmol/L。本課題組將由Tecan公司的全自動(dòng)工作站及其連續(xù)波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀組成的高通量篩選系統(tǒng)用于自主合成的化合物，包括β2受體激動(dòng)劑、PDE4抑制劑、乙酰膽堿酯酶抑制劑以及自由基清除劑的大量篩選，得到了具有潛在藥理活性的先導(dǎo)化合物［17－19］。

2 高內(nèi)涵篩選技術(shù)

2.1 高內(nèi)涵篩選技術(shù)的發(fā)展

細(xì)胞生物學(xué)研究已成為生命科學(xué)研究領(lǐng)域中最為重要的部分，尤其是步入到后基因組時(shí)代，科學(xué)家不再簡(jiǎn)單割裂地研究單個(gè)基因或單個(gè)蛋白的功能，而是開始從一個(gè)功能整體的角度考慮問題。HTS技術(shù)單指標(biāo)的篩選方法，已經(jīng)不能滿足藥物發(fā)現(xiàn)的需要，而且也不利于對(duì)化合物活性的綜合評(píng)價(jià)。因此，以多指標(biāo)多靶點(diǎn)為主要特點(diǎn)的高內(nèi)涵藥物篩選(High content screening，HCS)技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生［20－21］。HCS的儀器一般由白色連續(xù)光源、多通道濾光片(適于常用的熒光染料)、顯微鏡模塊和高速高分辨率的CCD照相機(jī)進(jìn)行圖像獲取，同時(shí)還可以配備細(xì)胞培養(yǎng)和自動(dòng)加樣模塊進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間全自動(dòng)的實(shí)驗(yàn)分析?；诩す獾挠布劢瓜到y(tǒng)使得自動(dòng)對(duì)焦在200 ms以內(nèi)，再結(jié)合軟件聚焦，完善了對(duì)拍攝對(duì)象的快速定位和圖像獲取。除了圖像獲取部分外，圖像采集、圖像分析和數(shù)據(jù)儲(chǔ)存也是高內(nèi)涵藥物篩選設(shè)備的主要組成部分。

20世紀(jì)70年代Talyor等［22］最早提出高內(nèi)涵概念，此后該課題組一直致力于開發(fā)定量研究細(xì)胞的新工具，1996年，Talyor成立了Cellomics公司，并于1999年研發(fā)生產(chǎn)了世界第一臺(tái)商用HCS儀器。進(jìn)入21世紀(jì)，單克隆抗體技術(shù)、細(xì)胞的制備方法、熒光染料的開發(fā)、儀器設(shè)備的改進(jìn)以及計(jì)算機(jī)的發(fā)展，使得HCS技術(shù)作為一門生物檢測(cè)技術(shù)已經(jīng)日臻完善，應(yīng)用領(lǐng)域日趨廣泛［23］。

相對(duì)于HTS結(jié)果單一，HCS是篩選結(jié)果多樣化的一種篩選技術(shù)手段。HCS模型主要建立在細(xì)胞水平，通過觀察樣品對(duì)固定或動(dòng)態(tài)細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)、分化、遷移、凋亡、代謝及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等多個(gè)功能的作用，涉及的靶點(diǎn)包括細(xì)胞的膜受體、胞內(nèi)成分、細(xì)胞器等，從多個(gè)角度分析樣品的作用，最終確定樣品的活性和可能的毒性。HCS技術(shù)克服了以往細(xì)胞研究領(lǐng)域的“串行”研究方法(即細(xì)胞周期→細(xì)胞毒理→信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)→代謝調(diào)控等)效率低、速度慢的弱點(diǎn)，在同一實(shí)驗(yàn)中，可完成各種對(duì)于細(xì)胞生理現(xiàn)象本質(zhì)的研究。這不僅大大提高了研究效率，降低了研究成本，避免了大量的重復(fù)勞動(dòng)，同時(shí)獲得了比之前成倍，甚至成百倍的海量數(shù)據(jù)，為各項(xiàng)研究提供了第一手實(shí)踐材料。圖1直觀比較了HTS和HCS的共同點(diǎn)和差異性［24］。從實(shí)驗(yàn)載體上看，HCS與HTS無顯著區(qū)別，均是在微孔板(Microplate)上進(jìn)行，兩者的樣品消耗量一致，實(shí)驗(yàn)操作同樣簡(jiǎn)單可行、自動(dòng)化。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，HTS實(shí)驗(yàn)結(jié)果單一，通常只獲得每個(gè)樣品孔的最終讀數(shù)。而HCS的實(shí)驗(yàn)結(jié)果多樣化，既有樣品孔的最終讀數(shù)，還有細(xì)胞計(jì)數(shù)、細(xì)胞形態(tài)學(xué)分析、細(xì)胞空間結(jié)構(gòu)分析、細(xì)胞成像等多種實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

圖1 HTS和HCS的共同點(diǎn)和差異性比較［24］Fig.1 The similarities and differences between HTS and HCS［24］

2.2 高內(nèi)涵篩選技術(shù)的應(yīng)用

Baniecki等［25］將HCS用于尋找抗瘧新藥，認(rèn)為使用基于圖像的DAPI惡性瘧原蟲生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)，可以檢測(cè)到單個(gè)瘧原蟲;而使用DAPI惡性瘧原蟲生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)和 ［3H］標(biāo)記的次黃嘌呤實(shí)驗(yàn)，96孔板上得到的讀數(shù)結(jié)果顯示，具有活力的瘧原蟲比例為0.25%。兩種實(shí)驗(yàn)手段的結(jié)果比較表明，HCS的靈敏度及可靠性顯著提高。Xu等［26］針對(duì)一系列與肝毒性直接相關(guān)的細(xì)胞表面形態(tài)變化，建立了一個(gè)HCS檢測(cè)方案。在檢測(cè)300多種藥物和化合物(其中包括許多可以導(dǎo)致人類罕見的肝毒性藥物)時(shí)，使用該檢測(cè)方案，檢出率達(dá)50%～60%，假陽性率非常低，僅為0～5%。Moffat等［27］建立了一種基于HCS的方法，來鑒定有絲分裂進(jìn)程中所必須的基因，并針對(duì)5 000種表達(dá)獨(dú)特的shRNA、以1 028個(gè)人類基因作為靶點(diǎn)的慢病毒載體進(jìn)行篩選，篩選到約100個(gè)(新型)增殖相關(guān)的候選調(diào)控元件。此外，在藥物毒性篩選方面，采用基于熒光成像的HCS進(jìn)行篩選，能夠從單個(gè)細(xì)胞水平觀察到細(xì)胞內(nèi)部正在發(fā)生的事件，實(shí)驗(yàn)結(jié)果比傳統(tǒng)的MTT法的靈敏度更高，信息量更大，結(jié)果更可靠，從而降低了后續(xù)的藥物開發(fā)研究失敗的風(fēng)險(xiǎn)［28－29］。本實(shí)驗(yàn)室建立了以核轉(zhuǎn)錄因子NFκB為靶標(biāo)的NFκB－U2OS細(xì)胞質(zhì)核轉(zhuǎn)染高內(nèi)涵篩選模型，通過自動(dòng)獲取細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核的熒光強(qiáng)度差值(MEAN，Circ Ring Avg Inten Diff Ch2)，陽性組的差值比陰性組差值大8倍以上，說明NFκB在藥物刺激下入核明顯。96孔板方法評(píng)估因子Z－factor≥0.5。這一模型適于以NFκB為靶標(biāo)的高內(nèi)涵藥物篩選。

3 表面等離子體共振技術(shù)

3.1 表面等離子體共振技術(shù)的發(fā)展

表面等離子共振(Surface plasmon resonance，SPR)是指當(dāng)一束平面單色偏振光以一定角度入射到鍍?cè)诓ＡП砻娴谋咏饘倌ど习l(fā)生全反射時(shí)，若入射光的波向量與金屬膜內(nèi)表面電子的振蕩頻率一致，光線即被耦合入金屬膜引發(fā)電子共振，即表面等離子共振。由于共振的產(chǎn)生，會(huì)使反射光的強(qiáng)度在某一特定的角度大大減弱，反射光消失的角度稱為共振角。共振角的大小隨金屬表面折射率的變化而變化，而折射率的變化又與金屬表面結(jié)合物的分子質(zhì)量成正比［30］。由此，在20世紀(jì)90年代發(fā)展了應(yīng)用SPR原理檢測(cè)生物傳感芯片(Biosensor chip)上的配體與分析物作用的新技術(shù)［31－33］。在該技術(shù)中，待測(cè)生物分子被固定在生物傳感芯片上，另一種被測(cè)分子的溶液流過表面，若二者發(fā)生相互作用，會(huì)使芯片表面的折射率發(fā)生變化，從而導(dǎo)致共振角的改變。而通過檢測(cè)該共振角的變化，可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)分子間相互作用的動(dòng)力學(xué)信息。雖然SPR篩選通量不及HTS和HCS，但其不需任何標(biāo)記，能在更接近生理溶液的環(huán)境中直接研究靶標(biāo)和分析物的相互作用，使之在藥物研究中占據(jù)著重要的一席之地。隨著商品化SPR生物傳感器儀器技術(shù)的逐步成熟，儀器的管路系統(tǒng)、進(jìn)樣方式及檢測(cè)速度等也發(fā)生了巨大變化，從最初的單點(diǎn)單通道分析到多通道陣列式分析，在分析通量和數(shù)據(jù)質(zhì)量方面有了很大改進(jìn)［34－36］。近年來在藥物篩選領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。圖2展示了不同時(shí)期SPR芯片的通路變化［34］，其中A為一對(duì)一模式，每個(gè)位點(diǎn)相互獨(dú)立，任何一個(gè)樣品只能流過其中某一個(gè)通道，通道間不能互為對(duì)照。B是Biacore 3000型芯片格式，4個(gè)位點(diǎn)用管路相連，任何一個(gè)位點(diǎn)可以為其它3個(gè)位點(diǎn)做空白背景的對(duì)照;C是Biacore T100型芯片格式，1－2通道和3－4通道直接相連，使相鄰的兩個(gè)位點(diǎn)間距離明顯縮短，對(duì)照效果更好，基線更平穩(wěn);D是Biacore S51的芯片格式，可以同時(shí)分別進(jìn)4個(gè)樣品，任一通道均可作為對(duì)照通道。G被襯為一次動(dòng)力學(xué)模式芯片，是Bio－Rad ProteOn XPR36的芯片格式，可以一次性平行標(biāo)記6個(gè)配體，芯片再旋轉(zhuǎn)90°，在垂直方向平行流過6個(gè)分析物或者6個(gè)不同濃度梯度的同一分析物，一次進(jìn)樣可完成兩個(gè)分子間的動(dòng)力學(xué)監(jiān)測(cè)。

圖2 各種SPR傳感器的芯片格式［34］Fig.2 Schematic of flow cell configurations in the SPR instrument［34］

3.2 SPR技術(shù)在藥物篩選中的應(yīng)用

隨著SPR技術(shù)檢測(cè)靈敏度的提高，SPR的檢測(cè)對(duì)象不再局限于大分子之間的相互作用，也可以實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)－小分子、核酸－小分子之間相互作用的檢測(cè)。由于SPR技術(shù)能夠直接反映兩個(gè)分子間相互作用的強(qiáng)弱和動(dòng)力學(xué)模式，所以采用SPR方法可對(duì)蛋白化合物庫(kù)、小分子化合物庫(kù)等進(jìn)行篩選，假陽性率大大降低［37－39］。Geschwindner等［40］采用SPR篩選以蛋白片段為靶標(biāo)的小分子活性化合物，比傳統(tǒng)檢測(cè)方法得到更多的活性物質(zhì)，且SPR方法的Z－factor(為0.67)遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的檢測(cè)方法(為0.37)，說明SPR篩選方法所得結(jié)果更穩(wěn)定可靠。G蛋白偶聯(lián)受體(GPCRs)是細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中的重要蛋白質(zhì)，其拓?fù)錁?gòu)象為7次跨膜的受體，同源性較低，當(dāng)膜外的配體作用于該受體時(shí)，該受體的膜內(nèi)部分與G蛋白相互結(jié)合，激活G蛋白。大多數(shù)的細(xì)胞激素和神經(jīng)遞質(zhì)細(xì)胞內(nèi)外的交流通過GPCR信號(hào)通路完成，藥物作用于GPCRs從而達(dá)到治療目的。迄今已發(fā)現(xiàn)作為治療藥物靶點(diǎn)的蛋白總數(shù)約500個(gè)，而GPCRs靶點(diǎn)占其中受體的絕大多數(shù)。很多科研工作者先后進(jìn)行了用SPR技術(shù)篩選GPCR配體及藥物的研究［41－44］。本課題組利用ProteOn XPR36儀器，建立了分別以DNA、RNA和POT1蛋白、Aβ蛋白等為靶標(biāo)的小分子藥物篩選模型，可對(duì)源源不斷新合成的化合物進(jìn)行初步的活性篩選，為化合物的進(jìn)一步開發(fā)研究提供了非常有參考價(jià)值的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)［45－50］。

4 微流控芯片技術(shù)

4.1 微流控芯片技術(shù)的發(fā)展

在毛細(xì)管電泳發(fā)展的基礎(chǔ)上，20世紀(jì)90年代Manz等［51］提出了微全分析系統(tǒng)，即微流控芯片(Microfluidic chip)或芯片實(shí)驗(yàn)室(Lab on a chip)，它是將化學(xué)和生物等領(lǐng)域中所涉及的樣品制備、反應(yīng)、分離、檢測(cè)及細(xì)胞培養(yǎng)、分選、裂解等基本操作單元集成或基本集成到一塊幾平方厘米(甚至更小)的芯片上，由微通道形成網(wǎng)絡(luò)，以可控流體貫穿整個(gè)系統(tǒng)，用以取代常規(guī)化學(xué)或生物實(shí)驗(yàn)室的各種功能的一種技術(shù)平臺(tái)［52］。經(jīng)過幾十年的飛速發(fā)展，微流控芯片系統(tǒng)的芯片制作、檢測(cè)器研制、加樣操作等相關(guān)技術(shù)已日趨成熟并規(guī)?；?，其應(yīng)用范圍覆蓋了醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、生命科學(xué)、環(huán)境科學(xué)等諸多領(lǐng)域，在藥物篩選方面也得到了非常廣泛的應(yīng)用［53－55］。并憑借其樣品及試劑消耗少、分析速度快、效率高、操作模式靈活多變，以及可在生理環(huán)境或接近生理環(huán)境下運(yùn)行等優(yōu)點(diǎn)，為大規(guī)模高通量藥物篩選提供了絕佳的實(shí)驗(yàn)和檢測(cè)技術(shù)平臺(tái)。微流控芯片是最有可能滿足高通量篩選要求的新興技術(shù)平臺(tái)之一［56］。

4.2 微流控芯片技術(shù)在藥物篩選中的應(yīng)用

在微流控芯片上進(jìn)行藥物篩選，可大致分為分子水平、細(xì)胞水平和整體動(dòng)物水平3大方面的藥物篩選。在分子水平的藥物篩選中，美國(guó)Caliper Life Sciences公司將微流控芯片技術(shù)應(yīng)用于藥物篩選領(lǐng)域，開發(fā)了微流控芯片實(shí)時(shí)動(dòng)力學(xué)檢測(cè)功能的EZ Reader系列藥物篩選平臺(tái)，在不加中止試劑的情況下檢測(cè)酶學(xué)實(shí)驗(yàn)。用于實(shí)驗(yàn)的底物是帶有熒光標(biāo)記的多肽，底物在反應(yīng)體系中酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物，其所帶的電荷也發(fā)生相應(yīng)的變化，利用底物和產(chǎn)物所帶電荷的不同，將二者在芯片通道中進(jìn)行分離，并分別檢測(cè)。在檢測(cè)過程中，96或384孔板中的反應(yīng)物通過芯片底部的吸樣針被吸入芯片通道。由于在芯片的分離通道上施加了分離電壓，帶有熒光標(biāo)記的多肽底物和反應(yīng)產(chǎn)物由于電荷的不同而被分離，然后在檢測(cè)窗口進(jìn)行檢測(cè)(見圖3)。在檢測(cè)每一個(gè)樣品時(shí)，可以同時(shí)看到底物和產(chǎn)物的信號(hào)。該系統(tǒng)可用于大規(guī)模的激酶抑制劑篩選［57－58］。本課題組已在EZ Reader平臺(tái)上開展激酶抑制劑的篩選研究。在細(xì)胞水平的藥物篩選上，微流控芯片也具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。它可以將細(xì)胞種植、培養(yǎng)、標(biāo)記、刺激、加藥、梯度稀釋等操作通過微通道網(wǎng)絡(luò)流體控制技術(shù)集成到一張芯片上完成，保持了細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性，可全面記錄細(xì)胞對(duì)藥物刺激的各種反應(yīng)。Ye等［59］構(gòu)建了一套用于細(xì)胞水平藥物篩選研究的集成化微流控芯片系統(tǒng)，芯片結(jié)構(gòu)的主體部分是由8個(gè)金字塔形的濃度梯度生成器網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)圍繞一個(gè)公共的廢液池構(gòu)成，網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)單次可產(chǎn)生64種藥物作用條件，并獲得192種細(xì)胞生物信號(hào)。為了進(jìn)一步提高藥物篩選的準(zhǔn)確性，在體的藥物篩選越來越受到人們的重視，并且為了降低篩選成本，會(huì)優(yōu)先使用一些模式生物來篩選藥物，如秀麗隱桿線蟲、斑馬魚胚胎等。微流控芯片則成為實(shí)現(xiàn)整體動(dòng)物水平藥物篩選的良好平臺(tái)［60－63］。本課題組［63］在微流控芯片上建立了斑馬魚癲癇模型，研究了維生素C和苯妥英鈉對(duì)斑馬魚幼魚癲癇的解救作用。此外，《分析測(cè)試學(xué)報(bào)》近期策劃的專題—— 《微流控技術(shù)在分析檢測(cè)中的應(yīng)用》，對(duì)我國(guó)微流控技術(shù)在分析檢測(cè)領(lǐng)域的最新研究成果進(jìn)行了總結(jié)與集中報(bào)道，其中也凸顯了微流控技術(shù)在藥物篩選中的應(yīng)用優(yōu)勢(shì)［64－65］。

圖3 微流控芯片分離檢測(cè)酶產(chǎn)物和底物的示意圖Fig.3 Schematic of mobility－shift assay

5 展望

新藥開發(fā)，有助于治療人類所面臨的各種重大疾病，提高患者的生存質(zhì)量，延長(zhǎng)壽命，而藥物篩選則是發(fā)現(xiàn)新藥的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。藥物篩選新技術(shù)的應(yīng)用，能更快速有效地從龐大的化合物庫(kù)中篩選出有藥理活性的藥物，提高新藥開發(fā)速度，降低新藥研發(fā)成本。藥物篩選新技術(shù)之間的相互融合匹配將能更好地達(dá)到藥物篩選的目的。比如HTS技術(shù)可借鑒HCS的成像系統(tǒng)，將檢測(cè)對(duì)象的反應(yīng)過程通過精密數(shù)碼相機(jī)記錄下來，為藥物活性評(píng)估提供更全面的信息。HCS的發(fā)展可更加切實(shí)地做到高內(nèi)涵篩選，目前已發(fā)表的有關(guān)HCS論文中，60%～80%的文章只用到雙通道成像檢測(cè)細(xì)胞對(duì)藥物刺激的變化，離多通道高內(nèi)涵檢測(cè)還有一定距離［66］。經(jīng)過HTS和HCS篩選的靶標(biāo)和藥物，可以采用SPR技術(shù)進(jìn)行二次篩選，以進(jìn)一步確證藥物的活性，降低藥物開發(fā)的投資風(fēng)險(xiǎn)［67］。微流控芯片技術(shù)由于其微型化集成化的特點(diǎn)，有望集成HTS、HCS以及SPR篩選技術(shù)于一體，既能在分子水平評(píng)估藥物活性，也能在細(xì)胞水平監(jiān)測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞的影響，從而更加全面完整快速地對(duì)藥物進(jìn)行篩選。毫無疑問，隨著科技進(jìn)步及社會(huì)發(fā)展的需要，新的藥物篩選技術(shù)會(huì)不斷出現(xiàn)，各種新興技術(shù)各自發(fā)展又相互融合是未來藥物篩選技術(shù)的發(fā)展方向，這將為新藥開發(fā)提供更強(qiáng)有力的技術(shù)支持，從而為人類的健康帶來福音。

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