嚴(yán)春梅，劉 鑫，梁 英，殷世民

(桂林電子科技大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，廣西 桂林 541004)

固相熒光光譜法因操作簡(jiǎn)單、靈敏度高等特點(diǎn)受到廣泛關(guān)注［1］。1977年Heller等首次采用固相熒光光譜法測(cè)定了低濃度的三硝基甲苯(TNT)［2］。20世紀(jì)90年代以來(lái)，Muller等［3］用三維固相熒光光譜法表征了固體廢物的成分;Yang等［4］以尼龍膜作為支撐材料，建立了簡(jiǎn)單、高靈敏的2-萘磺酸固相熒光檢測(cè)法，為降低2-萘磺酸對(duì)人類和環(huán)境的危害做出了貢獻(xiàn)。del Olmo等［5］建立了用于測(cè)定水樣中痕量西維因的新型固相熒光系統(tǒng)，該系統(tǒng)利用脈沖氮激光作為激發(fā)光源，以一種電荷耦合器件作為檢測(cè)器，將自然水域中的西維因轉(zhuǎn)化為1-萘酚進(jìn)行測(cè)定。Alves等［6］用固相分子熒光法測(cè)定藥物中的乙酰水楊酸、乙酰氨基酚和咖啡因;Huang等［7］將復(fù)合分子印跡聚合物膜(CIP)與固相熒光光譜法結(jié)合，測(cè)定了水樣中的L-苯丙氨酸，該方法無(wú)需進(jìn)行洗脫操作，簡(jiǎn)單、選擇性好、實(shí)驗(yàn)成本低。同時(shí)，他們還運(yùn)用鋱(Ⅲ)水楊酸印跡膜(CIM)結(jié)合固相熒光光譜法快速分離和檢測(cè)了藥物和人體尿液中的水楊酸，避免了基底熒光對(duì)熒光法測(cè)定水楊酸的影響，建立了一種簡(jiǎn)單、高效、快速、低成本的固相熒光光譜法［8］。Hu等［9］將復(fù)合分子印跡聚合物膜(CIP)與固相熒光光譜法結(jié)合，用于測(cè)定生物樣品中的槲皮素，方法選擇性強(qiáng)、成本低、測(cè)定快速。由此可見(jiàn)，經(jīng)過(guò)幾十年的發(fā)展，固相熒光光譜法已被廣泛應(yīng)用于環(huán)境［3－5］、醫(yī)學(xué)［6－8］、生物［9］等領(lǐng)域，具有簡(jiǎn)單、高效等優(yōu)點(diǎn)，但目前尚未見(jiàn)用于氨氮測(cè)定的文獻(xiàn)報(bào)道。

圖1 反應(yīng)機(jī)理Fig.1 Reaction mechanism of proposed method

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與溶液

實(shí)驗(yàn)所用化學(xué)藥品均為分析純(阿拉丁公司)，有特別說(shuō)明的藥品除外。實(shí)驗(yàn)用水為電阻率大于18.2 MΩ·cm的超純水。氨氮標(biāo)準(zhǔn)溶液:將于110℃干燥至恒重的(NH4)2SO4，配制成氨氮濃度為20 mmol/L的氨氮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4℃冷藏保存，使用時(shí)稀釋成氨氮濃度為0.10 mmol/L的氨氮標(biāo)準(zhǔn)使用液，當(dāng)天配制;不同濃度的氨氮標(biāo)準(zhǔn)工作溶液用0.10 mmol/L的氨氮標(biāo)準(zhǔn)使用液稀釋得到。10.6 g/L鄰苯二甲醛溶液:稱取2.65 g OPA，溶于50 mL甲醇(色譜純，阿拉丁)，再用水稀釋至250 mL，搖勻密封避光冷藏保存。2.50 g/L Na2SO3溶液:稱取1.25 g無(wú)水Na2SO3固體，溶于500 mL水后，向其中加入0.20 mL甲醛溶液(防止亞硫酸鈉溶液變質(zhì))，搖勻后冷藏保存。OPA－Na2SO3混合溶液:將一定體積的10.6 g/L OPA溶液和2.50 g/L Na2SO3溶液混合稀釋而成，溶液中OPA和Na2SO3的濃度分別為0.795 g/L和0.250 g/L。EDTA－NaOH緩沖溶液:稱取26.0 g EDTA二鈉和10.0 g NaOH溶于500 mL水中配制而成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

將中速定量濾紙裁剪成3.5 cm×3.5 cm的正方形小濾紙片(每張濾紙片必須保證無(wú)污損，可置于聚乙烯塑料袋中密封長(zhǎng)期保存)，置于適量(以完全浸泡濾紙為宜)OPA－Na2SO3混合溶液中浸泡至少4 h，使濾紙充分吸收混合溶液中的反應(yīng)試劑OPA和Na2SO3，待用。為減少誤差，同一條曲線上各點(diǎn)測(cè)定必須使用當(dāng)天同一批制備的濾紙;測(cè)定樣品時(shí)，工作曲線和樣品測(cè)定必須使用當(dāng)天同一批制備的濾紙。

圖2 自制反應(yīng)瓶Fig.2 Self-made reaction bottle

分別取50 mL不同濃度(2.00～12.0 μmol/L)的氨氮標(biāo)準(zhǔn)工作溶液或水樣于500 mL自制反應(yīng)瓶中(如圖2)，從OPA－Na2SO3混合浸泡液中取出濾紙片置于反應(yīng)瓶中的白色塑料支架上，加入4.0 mL EDTA－NaOH緩沖溶液至反應(yīng)液中，控制反應(yīng)液的pH值為11.5～13.0，蓋好瓶蓋，緩慢搖勻反應(yīng)液，室溫放置165 min，使反應(yīng)液中逸出的氨氣與濾紙片上的OPA與Na2SO3充分反應(yīng)生成熒光物質(zhì)，用鑷子取出濾紙，迅速置于固相熒光測(cè)定支架上，設(shè)置儀器的激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為3.0 nm，激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為368 nm和426 nm，用RF－5301PC型熒光分光光度計(jì)(島津公司)測(cè)定濾紙上熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度。為減小固相載體不均勻性帶來(lái)的測(cè)定誤差，對(duì)同一個(gè)濾紙樣品，通過(guò)移動(dòng)濾紙?jiān)跍y(cè)定支架上的位置使激發(fā)光照射在濾紙的不同位置，測(cè)得5個(gè)不同點(diǎn)的熒光值(圖3)，取其平均值為該樣品的熒光測(cè)定值(IF)，根據(jù)熒光測(cè)定值與反應(yīng)液中氨氮濃度的關(guān)系確定樣品中的氨氮濃度。

圖3 濾紙熒光值測(cè)定點(diǎn)示意圖Fig.3 Measuring points in a filter paper

2 結(jié)果與討論

2.1 激發(fā)光譜與熒光光譜

配制濃度為12.0 μmol/L的氨氮標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按“1.2”方法測(cè)定濾紙上熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜和熒光光譜，結(jié)果如圖4所示。由圖4可見(jiàn)，OPA與氨氮反應(yīng)所生成熒光物質(zhì)的最大激發(fā)波長(zhǎng)λex=368 nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)λem=426 nm，與OPA液相熒光法的激發(fā)波長(zhǎng)、發(fā)射波長(zhǎng)一致［14－17］，說(shuō)明氨氮與OPA和Na2SO3在濾紙上生成的熒光產(chǎn)物與在液相中的相同，均為熒光異吲哚化合物。因此，本實(shí)驗(yàn)設(shè)置激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)分別為368 nm和426 nm。

圖4 熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜(a)和熒光光譜(b)Fig.4 Excitation(a)and emission(b)spectra of the products of OPA－NH3－sulfite reaction on the filter paper

2.2 實(shí)驗(yàn)參數(shù)的優(yōu)化

2.2.1 濾紙浸泡時(shí)間的優(yōu)化 濾紙浸泡于OPA－Na2SO3混合液中的目的是使其充分負(fù)載可與氨氮反應(yīng)的熒光試劑，理論上，時(shí)間過(guò)短，負(fù)載不飽和，可能會(huì)影響后續(xù)的固相熒光反應(yīng)。為考察濾紙浸泡時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，固定其它實(shí)驗(yàn)條件如“1.2”所述，采用單因素法考察空白和8.00 μmol/L氨氮標(biāo)準(zhǔn)工作溶液對(duì)應(yīng)的熒光測(cè)定值與濾紙浸泡時(shí)間的關(guān)系。結(jié)果表明，當(dāng)濾紙浸泡時(shí)間介于15 min～2.0 h時(shí)，隨著浸泡時(shí)間的增加，空白和8.00 μmol/L氨氮標(biāo)準(zhǔn)工作溶液對(duì)應(yīng)的熒光測(cè)定值呈先增后降的趨勢(shì);當(dāng)浸泡時(shí)間超過(guò)2.0 h時(shí)，熒光測(cè)定值逐漸趨于穩(wěn)定。考慮到方法的可重復(fù)性和易操作性，實(shí)驗(yàn)選擇將濾紙浸泡超過(guò)4.0 h后使用。

2.2.2 濾紙浸泡液中OPA與Na2SO3濃度的確定 濾紙浸泡液為OPA－Na2SO3混合溶液，本課題組的前期研究結(jié)果［18］表明，OPA及Na2SO3與氨氮在液相溶液中反應(yīng)的最佳濃度為OPA:0.457～0.913 g/L，Na2SO3:0.081～0.326 g/L。參照該結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)選擇濾紙浸泡液中OPA濃度為0.795 g/L，Na2SO3濃度為0.250 g/L。

2.2.3 反應(yīng)液pH值的優(yōu)化 氨氮在水溶液中通常以NH+4和NH3兩種形態(tài)存在，當(dāng)水溶液pH值大于9.75時(shí)，主要以NH3形態(tài)存在［19］。本方法的反應(yīng)原理是水樣中的氨氮在堿性溶液中以NH3形態(tài)逸出反應(yīng)液，與濾紙上的反應(yīng)試劑反應(yīng)生成熒光產(chǎn)物。因此，反應(yīng)液的pH值會(huì)影響NH3形態(tài)在反應(yīng)液中的含量，進(jìn)而影響濾紙上生成的熒光產(chǎn)物量。為了考察反應(yīng)液pH值對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，固定其它實(shí)驗(yàn)條件如“1.2”所述，通過(guò)改變1.0 mol/L NaOH溶液的加入量以改變反應(yīng)液的pH值，考察了空白和8.00 μmol/L氨氮標(biāo)準(zhǔn)工作溶液對(duì)應(yīng)的熒光測(cè)定值與pH值(10.0～13.0)的關(guān)系，結(jié)果如圖5所示。在此pH值范圍內(nèi)，空白和8.00 μmol/L氨氮標(biāo)準(zhǔn)工作溶液對(duì)應(yīng)的熒光測(cè)定值隨著pH值的增大先增加，當(dāng)pH值超過(guò)11.5后，熒光測(cè)定值趨于穩(wěn)定。因此，本方法反應(yīng)液的適宜pH值為11.5～13.0。另外，在50 mL反應(yīng)液中加入4.0 mL EDTA－NaOH緩沖溶液，可控制河水、地下水、山泉水、純水等水樣的pH值在本方法的適宜pH值范圍內(nèi)，因此，實(shí)驗(yàn)選擇在反應(yīng)液中加入4.0 mL EDTA－NaOH緩沖溶液以控制反應(yīng)液的pH值。

圖5 反應(yīng)液pH值對(duì)空白(a)及8.00 μmol/L氨氮標(biāo)準(zhǔn)工作溶液(b)熒光反應(yīng)的影響Fig.5 Effects of pH values of reaction solution on fluorescence reaction of blank(a)and 8.00 μmol/L ammonium solution(b)

2.2.4 反應(yīng)平衡時(shí)間的確定 配制8.00 μmol/L氨氮標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，固定其它實(shí)驗(yàn)條件如“1.2”所述，分別在不同時(shí)間點(diǎn)測(cè)定其熒光強(qiáng)度。發(fā)現(xiàn)反應(yīng)時(shí)間為30～165 min時(shí)，熒光測(cè)定值快速增加;反應(yīng)時(shí)間為165～210 min時(shí)，熒光測(cè)定值趨于穩(wěn)定，說(shuō)明反應(yīng)已達(dá)平衡，因此本方法選擇反應(yīng)平衡時(shí)間為165 min。

2.3 工作曲線與檢出限

2.3.1 工作曲線 在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，分別配制氨氮濃度為2.00，3.00，4.00，8.00，12.0 μmol/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示，熒光測(cè)定值與反應(yīng)液中氨氮濃度在2.00～12.0 μmol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，其回歸方程為IF=12.10c(μmol/L)+177.6(n=5，r=0.993 5)。

2.3.2 檢出限 采用本方法平行測(cè)定7個(gè)空白樣，熒光測(cè)定平均值為91.244，標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.53，按照檢出限=3×SD/工作曲線斜率［20］，計(jì)算得本方法的檢出限為0.746 μmol/L。當(dāng)天工作曲線的回歸方程為:IF=18.21c(μmol/L)+89.10(n=4，r=0.998 0)。

2.4 方法驗(yàn)證

2.4.1 加標(biāo)回收率 以泉水、河水作為基底，分別加入不同濃度的氨氮測(cè)定基底加標(biāo)回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1知，加標(biāo)濃度分別為3.00，6.00 μmol/L時(shí)，泉水的基底加標(biāo)回收率分別為(101.6±14.3)%、(96.6±4.8)%，河水的基底加標(biāo)回收率分別為(89.6±6.5)%、(91.7±5.0)%，說(shuō)明本方法可用于測(cè)定泉水和河水中的氨氮，基底均無(wú)干擾。

表1 泉水和河水基底的加標(biāo)回收率(n=3)Table 1 The matrix spiked recoveries of spring and river sample(n=3)

2.4.2 與靛酚藍(lán)分光光度方法的比較 靛酚藍(lán)分光光度法［21］是測(cè)定氨氮的經(jīng)典方法，采用本方法與靛酚藍(lán)分光光度法對(duì)取自桂林市花江的兩個(gè)河水樣品進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)兩者的結(jié)果做t統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，結(jié)果列于表2。表2數(shù)據(jù)表明，兩個(gè)河水樣品的統(tǒng)計(jì)量t的計(jì)算值均小于置信度為95%時(shí)的臨界值，說(shuō)明本法用于河水樣測(cè)定與靛酚藍(lán)分光光度法的結(jié)果無(wú)顯著差異。

表2 本法與靛酚藍(lán)分光光度法測(cè)定結(jié)果的比較(n=3)Table 2 Comparison of analytical results of the proposed method and the indophenol blue method(n=3)

2.5 方法的應(yīng)用

2014年11月22日取自花江上游到下游的14個(gè)水樣，立即用本法和靛酚藍(lán)分光光度法［21］進(jìn)行測(cè)定。當(dāng)水樣中氨氮的濃度大于12.0 μmol/L，用本法測(cè)定時(shí)，水樣需稀釋后方可進(jìn)行。以靛酚藍(lán)方法的測(cè)定結(jié)果為橫坐標(biāo)，本法的測(cè)定結(jié)果為縱坐標(biāo)，作線性相關(guān)圖。結(jié)果表明，花江水樣中氨氮濃度在2.50～34.0 μmol/L范圍內(nèi)，本方法與靛酚藍(lán)分光光度法的測(cè)定結(jié)果呈顯著線性相關(guān)，相關(guān)方程為y=1.177x－0.759(n=14，r=0.992 5)，其斜率為1.177，接近1.0，說(shuō)明本方法測(cè)定河水樣與靛酚藍(lán)分光光度法的測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著差異，能準(zhǔn)確測(cè)定河水樣中氨氮的含量。

3 結(jié)論

本文基于OPA－NH3－Na2SO3的熒光反應(yīng)，以濾紙為固相載體，建立了操作簡(jiǎn)單、試劑消耗少、靈敏度高、成本低的固相熒光分析方法。該方法的線性范圍為2.00～12.0 μmol/L，檢出限為0.746 μmol/L，基底加標(biāo)回收率為89.6%～101.6%。用本法與靛酚藍(lán)分光光度法測(cè)定河水樣，兩者的測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著性差異。相對(duì)于其它測(cè)定氨氮的光譜分析方法，本方法無(wú)需對(duì)水樣進(jìn)行預(yù)處理，操作簡(jiǎn)便，成本較低。

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