穆晞惠，童朝陽，黃啟斌，劉 冰，劉志偉，郝蘭群，張金平

(國民核生化災(zāi)害防護(hù)國家重點實驗室，北京 102205)

金磁微粒(Gold-magnetic particle)是由納米金顆粒包被超順磁Fe3O4納米粒子后形成的磁性無機(jī)納米復(fù)合物，兼有納米金顆粒與磁微粒的雙重優(yōu)勢。作為一種新型的磁性納米功能材料，金磁微粒憑借其良好的穩(wěn)定性、分散性、生物相容性及磁性富集分離等特性，已被廣泛應(yīng)用于核酸雜交、疾病診斷、生物檢測和生物傳感等方面，可起到簡化操作步驟，提高檢測的靈敏度、特異性和抗干擾能力的作用［1－7］。噬菌體抗體作為免疫檢測中一種非常有前景的識別分子，兼具特異的抗原結(jié)合特性和噬菌體結(jié)構(gòu)特性，可與多個抗噬菌體衣殼蛋白pⅧ的酶標(biāo)抗體結(jié)合，形成攜帶大量酶分子的酶標(biāo)噬菌體抗體復(fù)合物。與傳統(tǒng)抗體與酶標(biāo)二抗結(jié)合形成的酶標(biāo)抗體復(fù)合物探針相比，噬菌體抗體可產(chǎn)生針對靶分子的特異信號放大效應(yīng)［8］。蛋白A(Staphylococcus protein A，SPA)通過疏水作用與IgG分子Fc段特異結(jié)合，可實現(xiàn)分子的定向固定從而提高探針活性，現(xiàn)已在生物檢測領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用［9－13］。

本課題組研究發(fā)現(xiàn)，蛋白A和酶標(biāo)噬菌體抗體在磁免疫分析中具有信號放大效應(yīng)［8，13］，然而目前尚缺乏對金磁微粒功能化探針以及金磁微粒、蛋白A、酶標(biāo)噬菌體抗體三者在磁免疫分析中的綜合放大效應(yīng)的深入研究，也無針對相思子毒素(Abrin)的快速、靈敏、特異和抗干擾能力強(qiáng)的磁免疫分析法的文獻(xiàn)報道。本研究以蛋白A包被金磁微粒偶聯(lián)相思子毒素多抗作為功能化捕獲探針，酶標(biāo)相思子毒素噬菌體抗體為特異信號檢測探針，采用“蛋白A包被金磁微粒功能化捕獲探針－相思子毒素 －酶標(biāo)噬菌體抗體信號探針”的檢測模式，建立了檢測相思子毒素的磁免疫分析新方法。通過與其他免疫檢測方法的比較，重點探討了金磁微粒功能化探針在提高檢測靈敏度上的效果，以及金磁微粒、蛋白A與酶標(biāo)噬菌體抗體三者產(chǎn)生的綜合信號放大效應(yīng)。同時重點考察了該方法對以河水、施肥土壤、奶油餅干和兔全血作為基質(zhì)的模擬樣品的檢測能力，為其在臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測、食品衛(wèi)生檢驗及生物反恐等領(lǐng)域的應(yīng)用提供技術(shù)基礎(chǔ)和參考依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

相思子毒素標(biāo)準(zhǔn)品、相思子毒素多抗、相思子毒素噬菌體抗體、蓖麻毒素(Ricin)、超順磁Fe3O4納米粒子(粒徑15 nm)、金磁微粒(粒徑150 nm)均由本實驗室制備;金黃色葡萄球菌腸毒素B(SEB)、氯金酸(HAuCl4·4H2O)、鹽酸羥胺、蛋白A(SPA)、牛血清白蛋白(BSA)、3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)購自Sigma公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗M13單克隆抗體(HRP－抗M13單抗)購自GE公司;BioMATE 3S型紫外－可見分光光度計(美國Thermo公司);680型酶標(biāo)儀(美國BioRad公司);96孔磁架(德國Dynal公司)。

1.2 金磁微粒的制備

參照文獻(xiàn)［14］制備金磁微粒并稍加改動。取本課題組利用微波共沉淀法制備的超順磁Fe3O4納米粒子(磁微粒)0.2 g［15］溶于100 mL超純水中超聲15 min;加入1%HAuCl4·4H2O水溶液10 mL，攪拌速度為1 500 r/min，室溫反應(yīng)1 h;加入50 mmol/L鹽酸羥胺40 mL，攪拌速度為2 000 r/min，室溫反應(yīng)1 h;磁性分離棄上清液，加入1 mol/L HCl浸泡4 h后，超純水洗至中性并定容至50 mL備用，同時計算固形物含量。

1.3 金磁微粒功能化探針的制備

取1 mg金磁微粒，用0.01 mol/L pH 7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗金磁微粒，磁分離棄去上清液;加入一定量1 mg/mL SPA，室溫旋轉(zhuǎn)反應(yīng)3 h，PBST(0.01 mol/L pH 7.4 PBS緩沖液，含0.1%Tween－20)清洗金磁微粒，磁分離棄上清液;加入一定量1 mg/mL相思子毒素多抗，室溫旋轉(zhuǎn)反應(yīng)2 h，PBST清洗金磁微粒并定容至1 mL，于4℃或－20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 酶標(biāo)相思子毒素噬菌體抗體探針的制備

將滴度為1.0×1013pfu/mL的相思子毒素噬菌體抗體1 mL與HRP－抗M13單抗1 μL混勻，37℃溫育1 h，以4℃ 9 000 g離心20 min，棄去上清液;0.01 mol/L PBS緩沖液(pH 7.4，含0.1%Tween－20)重懸沉淀后繼續(xù)離心，重復(fù)3次;最后以0.01 mol/L PBS緩沖液(pH 7.4，含3%BSA)重懸沉淀，4℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 基于金磁微粒與酶標(biāo)噬菌體抗體的磁分離免疫分析法的建立

①加待測樣品:取金磁微粒功能化探針各100 μL，均加入用0.01 mol/L PBS緩沖液(pH 7.4)稀釋成100 μL的不同濃度的相思子毒素標(biāo)準(zhǔn)品，另取金磁微粒、金磁微粒功能化探針各100 μL分別作為空白和陰性對照管，加0.01 mol/L PBS緩沖液(pH 7.4，含1%BSA)各100 μL，37℃溫育1 h，PBST洗3次，磁分離棄去上清液。②加酶標(biāo)噬菌體抗體探針:除空白管外，各加一定滴度的酶標(biāo)相思子毒素噬菌體抗體100 μL，37℃溫育1 h，PBST洗3次，磁分離棄去上清液。③底物顯色:每管加100 μL TMB，37℃溫育15 min，加2 mol/L濃H2SO450 μL終止反應(yīng);④讀數(shù):磁架收集上清液，采用酶標(biāo)儀測A450nm值。檢測過程見圖1。

圖1 基于金磁微粒與酶標(biāo)噬菌體抗體的磁分離免疫分析法檢測毒素原理示意圖Fig.1 Model of detection toxin by magnetic affinity immunoassay(MAIA)based on gold-magnetic particle and HRP-conjugated phage antibody

1.6 相思子毒素模擬樣品的測定

取1 g施肥土壤(有機(jī)質(zhì)含量＞5%)、1 g奶油餅干(脂肪含量＞30%)、10 μL兔全血、1 mL河水，分別向各樣品中加入6.24 μL 10 mg/L的相思子毒素標(biāo)準(zhǔn)品，加稀釋液(0.01 mol/L pH 7.4 PBS緩沖液)混勻至8 mL，制成基質(zhì)分別為施肥土壤、奶油餅干、兔全血和河水的相思子毒素模擬樣品(終濃度均為7.8 μg/L)。河水樣品直接取混合液測定，土壤樣品以5 000 g離心20 min，餅干、全血樣品以10 000 g分別離心15 min和10 min，取上清液測定相思子毒素濃度，計算回收率、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差等指標(biāo)。

2 結(jié)果與討論

2.1 金磁微粒的制備

本研究采用微波共沉淀法獲得了分散性較好、形貌呈球形、粒徑為15 nm、飽和磁化強(qiáng)度為78.875 emu/g的磁微粒(圖2A)，與傳統(tǒng)共沉淀法相比，該法簡化了磁微粒制備過程，縮短了反應(yīng)時間。在此基礎(chǔ)上采用鹽酸羥胺還原法獲得了分散性好、形貌呈球形、粒徑為150 nm、飽和磁化強(qiáng)度為63.151 emu/g的金磁微粒(圖2B)，同時測得其固形物含量為3 mg/mL。

圖2 磁微粒(A)和金磁微粒(B)的透射電鏡照片F(xiàn)ig.2 TEM images of magnetic particle(A)and gold-magnetic particle(B)

2.2 金磁微粒功能化探針的制備

2.2.1 相思子毒素多抗最適固定量的確定 利用磁微粒、金磁微粒與蛋白間的物理吸附作用，分別將不同量SPA吸附至磁微粒和金磁微粒表面，通過測定固定前后SPA溶液的A280nm值，分別計算出每毫克磁微粒和金磁微粒上的SPA固定量。從表1可知，隨著SPA加入量的增加，磁微粒和金磁微粒表面固定的SPA量逐漸增加并趨于飽和，因此確定每毫克磁微粒和金磁微粒的SPA最適加入量分別為240 μg和320 μg，此時每毫克磁微粒和金磁微粒上SPA的固定量分別為111 μg和168 μg。

進(jìn)一步利用SPA與IgG分子Fc段的結(jié)合特異性，加入不同量的相思子毒素多抗分別制備磁微粒功能化探針和金磁微粒功能化探針，測定固定前后相思子毒素多抗溶液的A280nm值，計算出兩種功能化探針上相思子毒素多抗的實際固定量分別為453 μg和958 μg(見圖3)，理論最大量分別為845 μg和1 280 μg，實際固定量分別占理論最大量的53.6%和74.8%。

表1 磁微粒與金磁微粒固定前后蛋白A溶液的吸光度值變化Table 1 Absorbance value of SPA solution before and after binding to magnetic particle and gold-magnetic particle

通過比較SPA定向固定相思子毒素多抗制備的金磁微粒和磁微粒兩種功能化探針，發(fā)現(xiàn)金磁微粒功能化探針上SPA和相思子毒素多抗的固定量均最高，說明金磁微粒比磁微粒能提供更大的活性表面，從而固定更多的生物分子探針;同時SPA可使抗體在金磁微粒表面定向固定和有序排列，減少了分子間的空間位阻，從而進(jìn)一步提高了功能化探針的活性和檢測靈敏度。

2.2.2 金磁微粒功能化探針磁學(xué)性質(zhì)的鑒定 采用振動樣品磁強(qiáng)計對金磁微粒功能化探針的磁學(xué)性質(zhì)進(jìn)行鑒定，由圖4可知，金磁微粒功能化探針的飽和磁化強(qiáng)度為61.636 emu/g，與金磁微粒的飽和磁化強(qiáng)度基本相同，表明制備的金磁微粒功能化探針具有很好的磁學(xué)性質(zhì)。

圖3 金磁微粒和磁微粒表面多抗最適固定量的確定Fig.3 Immobilization ability of monoclonal antibody on gold－magnetic particle and magnetic particle

2.3 酶標(biāo)相思子毒素噬菌體抗體探針的制備

2.3.1 HRP－抗M13單抗最適用量的確定 分別取 0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6 μL HRP－抗M13單抗與1 mL(1.0×1013pfu/mL)相思子毒素噬菌體抗體混合，制得酶標(biāo)相思子毒素噬菌體抗體探針。分別取上述探針100 μL與100 μL(1 000 μg/L)相思子毒素標(biāo)準(zhǔn)品、100 μL金磁微粒功能化探針反應(yīng)進(jìn)行磁分離免疫測定，根據(jù)A450nm值變化確定HRP－抗M13單抗的最適用量。結(jié)果顯示，隨著HRP－抗M13單抗加入量的增加，其吸光度值逐漸增大，當(dāng)體積大于1 μL時，吸光度值基本不再增加，表明相思子毒素噬菌體抗體上結(jié)合的HRP－抗M13單抗趨于飽和，因此確定HRP－抗M13單抗最適用量為1 μL。

2.3.2 酶標(biāo)相思子毒素噬菌體抗體最適滴度的確定 分別取金磁微粒功能化探針100 μL，加入1 000 μg/L相思子毒素標(biāo)準(zhǔn)品，清洗磁微粒分別加入滴度為1.0×107，1.0×108，1.0×109，1.0×1010，1.0×1011，1.0×1012，1.0×1013pfu/mL的酶標(biāo)相思子毒素噬菌體抗體100 μL，相同條件下進(jìn)行磁分離免疫測定，根據(jù)A450nm值變化選擇適合滴度的酶標(biāo)相思子毒素噬菌體抗體。結(jié)果顯示，隨著酶標(biāo)相思子毒素噬菌體抗體對數(shù)滴度的增大，其吸光度值逐漸增大，當(dāng)對數(shù)滴度大于11時其吸光度值趨于飽和，因此確定酶標(biāo)相思子毒素噬菌體抗體的最適滴度為1.0×1011pfu/mL。

圖4 金磁微粒功能化探針的磁滯回線圖Fig.4 Magnetic hysteresis loops curve of functionalized gold-magnetic particle probe

2.3.3 酶標(biāo)相思子毒素噬菌體抗體探針的活性測定 為了驗證酶標(biāo)相思子毒素噬菌體抗體信號探針的活性，分別用濃度為5，10，20，40，60，80，100，120 μg/L的相思子毒素標(biāo)準(zhǔn)品100 μL包被酶標(biāo)板，封閉后加入滴度為1.0×1011pfu/mL的酶標(biāo)相思子毒素噬菌體抗體100 μL，同等條件下采用間接ELISA法測定，根據(jù)A450nm值變化對酶標(biāo)相思子毒素噬菌體抗體的活性進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，隨著相思子毒素濃度的增大，其吸光度值逐漸增大，表明該探針可與目標(biāo)物毒素結(jié)合且具有很好的量效關(guān)系，毒素的濃度(X，μg/L)與吸光度值(Y)呈顯著線性相關(guān)，回歸方程為Y=0.008X+0.524(r=0.995 5，P＜0.000 1，n=9)，因此制備的酶標(biāo)相思子毒素噬菌體抗體探針具有很好的活性，可滿足本實驗的檢測需求。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限與定量下限

用建立的磁分離免疫分析法對濃度范圍為0.008～250 μg/L的相思子毒素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測，以相思子毒素濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)作圖(見圖5)。結(jié)果顯示，相思子毒素濃度的對數(shù)值(X)與其吸光度值(Y)之間呈線性相關(guān)(圖5插圖)，回歸方程為Y=0.554X+1.289(r=0.991 0，P＜0.000 1，n=16)。

分別以測定值＞陰性對照A450nm值+3SD和測定值＞陰性對照A450nm值+10SD作為判定檢出限、定量下限的標(biāo)準(zhǔn)，取20個陰性對照樣本測定A450nm值為0.121±0.01，相思子毒素濃度為0.008 μg/L時的 A450nm值為0.272，因此確定檢出限為0.008 μg/L，定量下限為0.008 μg/L。由于本研究中得出的標(biāo)準(zhǔn)差值很小，表明該方法具有很好的精確度，因此導(dǎo)致定量下限接近檢出限。

相同條件下，采用“蛋白A包被金磁微粒偶聯(lián)多抗捕獲探針－毒素－酶標(biāo)噬菌體抗體信號探針”(方法1)、“蛋白A包被磁微粒偶聯(lián)多抗捕獲探針－毒素－酶標(biāo)噬菌體抗體信號探針”(方法2)、“金磁微粒偶聯(lián)多抗捕獲探針－毒素－酶標(biāo)噬菌體抗體信號探針”(方法3)、“蛋白A包被金磁微粒偶聯(lián)多抗捕獲探針－毒素－酶標(biāo)單抗信號探針”(方法4)、“金磁微粒偶聯(lián)多抗捕獲探針－毒素－酶標(biāo)單抗信號探針”(方法5)、“磁微粒偶聯(lián)多抗捕獲探針－毒素－酶標(biāo)單抗信號探針”(方法6)6種檢測模式的雙抗體夾心磁分離免疫分析法(MAIA)及傳統(tǒng)雙抗體夾心ELISA法(方法7)對相思子毒素進(jìn)行檢測與比較。由表2可知，該方法中金磁微粒、蛋白A和酶標(biāo)噬菌體抗體的單獨放大效應(yīng)可使檢測靈敏度分別提高5.2倍(方法5和7比較)、3倍(方法1和3比較)和4倍(方法1和4比較)，三者產(chǎn)生的綜合放大效應(yīng)使其檢測靈敏度比傳統(tǒng)雙抗體夾心ELISA法提高了62倍(方法1和7比較)。蛋白A－金磁微粒功能化探針與蛋白A－磁微粒功能化探針相比，具有更高的結(jié)合活性，使其檢測靈敏度提高了3倍(方法1和2比較)，而與傳統(tǒng)磁微粒功能化探針相比檢測靈敏度提高了9倍(方法4和6比較)。證明金磁微粒較磁微粒具有更好的生物相容性，可提供更大的活性表面固定更多生物分子;蛋白A可使抗體在金磁微粒表面定向固定和有序排列，從而進(jìn)一步提高了金磁微粒功能化探針的活性和檢測靈敏度;酶標(biāo)噬菌體抗體和金磁微粒功能化探針在磁分離免疫中信號放大效應(yīng)的存在，提高了檢測靈敏度，放大了檢測信號。

圖5 磁分離免疫分析法檢測相思子毒素的工作曲線Fig.5 Standard curve of abrin determined by magnetic affinity immunoassay(MAIA)

2.5 精密度與特異性

在檢測的線性濃度范圍內(nèi)，選擇濃度分別為250，62.5，1.95，0.032 μg/L的相思子毒素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測定，每個濃度重復(fù)測定5次，得到吸光度值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為1.3%，1.3%，2.8%和6.1%，表明方法具有較好的精密度。

表2 6種磁分離免疫分析法與傳統(tǒng)ELISA方法的比較Table 2 Comparison of six MAIA and ELISA methods

采用磁分離免疫分析法分別對基質(zhì)為稀釋液(pH 7.4，0.01 mol/L PBS緩沖液)，濃度均為15.6 μg/L的相思子毒素(Abrin)和蓖麻毒素(Ricin)、金黃色葡萄球菌腸毒素(SEB)、牛血清白蛋白(BSA)樣品進(jìn)行檢測，同時選用基質(zhì)分別為稀釋液、河水、施肥土壤、奶油餅干和兔全血的無目標(biāo)分子相思子毒素存在的模擬樣品作為陰性對照，結(jié)果見表3。當(dāng)檢測 Ricin、SEB和 BSA等非目標(biāo)蛋白時，其所得吸光度值基本接近陰性值，RSD為1.7%～9.0%，表明該法檢測相思子毒素具有很好的特異性。

2.6 相思子毒素模擬樣品的測定

對基質(zhì)分別為河水、施肥土壤、奶油餅干和兔全血的相思子毒素模擬樣品進(jìn)行測定，其回收率均大于90%，RSD為1.2%～2.1%(見表4)，表明該法具有較好的回收率和重現(xiàn)性，能滿足水樣、土樣、食品及血液等人工模擬樣品的分析要求。

表3 特異性測定(n=5)Table 3 Detection specificity of MAIA(n=5)

表4 相思子毒素模擬樣品的測定(n=4)Table 4 Determination of abrin in the simulated samples(n=4)

3 結(jié)論

本文將蛋白A包被金磁微粒偶聯(lián)相思子毒素多抗作為功能化捕獲探針，酶標(biāo)噬菌體抗體作為特異信號檢測探針，建立了基于金磁微粒與酶標(biāo)噬菌體抗體的磁分離免疫分析法，實現(xiàn)了微量相思子毒素的檢測。該方法中金磁微粒、蛋白A及酶標(biāo)噬菌體抗體三者產(chǎn)生的綜合放大效應(yīng)使其檢測靈敏度比傳統(tǒng)雙抗體夾心ELISA法提高了62倍。蛋白A－金磁微粒功能化探針與蛋白A－磁微粒功能化探針相比，具有更高的結(jié)合活性，使其檢測靈敏度提高3倍，而與傳統(tǒng)磁微粒功能化探針相比可使檢測靈敏度提高9倍。

本研究中的蛋白A－金磁微粒功能化探針與傳統(tǒng)磁微粒功能化探針相比，在提高檢測靈敏度方面具有以下優(yōu)勢:①金磁微粒具有更好的穩(wěn)定性及生物相容性，可提供大的活性表面，從而提高生物分子固定量;②由于蛋白A可通過疏水作用與IgG分子的Fc段特異結(jié)合，使抗體分子探針定向固定至固相表面，這種固定抗體特性較直接物理吸附或共價結(jié)合更為有序且不影響抗體活性，從而進(jìn)一步提高了功能化探針活性。因此，與傳統(tǒng)磁微粒功能化探針相比，將金磁微粒優(yōu)勢與蛋白A定向固定抗體特性相結(jié)合制備的蛋白A－金磁微粒功能化探針具有更高的活性，且可提高檢測靈敏度。此外，這種將蛋白A－金磁微粒功能化捕獲探針、酶標(biāo)噬菌體抗體信號檢測探針的信號放大效應(yīng)及磁免疫分離技術(shù)等多重優(yōu)勢結(jié)合的研究思路，在發(fā)展靈敏度高、特異性強(qiáng)的復(fù)雜生物樣品檢測領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。

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