宓捷波，畢玉國，趙孔祥，李淑靜，許 泓，何 佳，鄭文杰

(天津出入境檢驗檢疫局，天津 300461)

多酚類物質是葡萄酒的重要組成成分，主要包括非類黃酮和類黃酮兩大類，這些物質對葡萄酒的色澤、苦味、收斂性等感官特性和貯藏時間具有決定性作用［1－3］。研究表明，多酚類物質還對人體具有重要的生理功效，可以提高高密度脂蛋白，防止動脈粥樣硬化，抑制冠心病，消除自由基，減少誘變劑致癌，解毒護肝等［4－6］。因此，檢測葡萄酒中多酚類物質的種類和含量對于監(jiān)控葡萄酒產(chǎn)品質量、引導人們健康消費具有重要意義。

目前，葡萄酒中多酚類物質的檢測大多采用液相色譜法(HPLC)［7－10］，該方法具有靈敏度高、穩(wěn)定性好和易于操作的特點，但由于結構相近的多酚類物質在色譜行為上不易區(qū)分且葡萄酒中存在其他雜質的干擾，HPLC無法準確定性。一些研究［11－13］采用液相色譜－電噴霧離子阱法測定紅酒中的多酚類物質，利用質譜碎片信息進行定性，但由于一些多酚類物質的分子量較小(如香豆素的分子量為164)，無法獲得足夠的碎片信息以滿足國內(nèi)外法規(guī)關于定性確證的要求。而高分辨質譜技術利用高分辨性和精確質量信息進行定性，可彌補上述技術的不足。本研究結合四極桿/靜電場軌道高分辨質譜(QE HRMS)的全掃描和目標離子二級掃描技術，通過對液相色譜條件及碰撞能量的優(yōu)化，建立了葡萄酒中10種多酚類物質的準確定性和定量檢測技術，為有效監(jiān)管和分析葡萄酒產(chǎn)品提供了有力的技術支持。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

超高壓液相色譜－四極桿/靜電場軌道阱質譜儀(QE，美國Thermo－fisher公司)，配有VIM閥切換和多柱切換模塊(MCM)。Avanti J－30I高速冷凍離心機(美國Beckerman Coulter公司)，MS3basic渦旋混合器(美國IKA Weake公司)，HS 501振蕩反應器(美國IKA Weake公司)，Xcel VapTM自動氮吹濃縮儀(美國Horizon公司)。乙酸乙酯、甲醇、冰乙酸(色譜純，德國Merck公司)，兒茶素、槲皮素二水合物、沒食子酸、2，5-二羥基苯甲酸、對羥基苯甲酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、反式阿魏酸、反式p-香豆素、反式白藜蘆醇標準品(美國Sigma－Aldrich公司)。濃鹽酸(分析純，天津化學試劑廠)。實驗一般用水為去離子水，用于HPLC及質譜的水為電阻率小于18.2 MΩ·cm的超純水。

1.2 混合標準儲備液的配制

準確稱取10 mg各標準品，分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，得1.0 mg/mL標準儲備液，于－18℃避光保存。分別取100 μL上述標準液混合于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配成100 μg/mL的混合標準儲備液，－18℃避光保存。

1.3 色譜－質譜條件

色譜條件:ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm);流速0.3 mL/min;進樣量10 μL;流動相:A為0.5%的乙酸水，B為甲醇。洗脫程序:0～1 min，95%A;1～10 min，95%～10%A;10～14 min，95%A。

質譜條件:采用全掃描(Full scan)和目標離子二級掃描(Target MS2)結合方式，負離子模式，全掃描離子范圍:100～500 m/z，分辨率35 000，質量偏差5 ppm。鞘氣流速:0.72 L/min，輔助氣流速:3.3 L/min，噴霧電壓:2.75 kV，毛細管溫度:280℃，離子源加熱溫度:350℃，歸一化的碰撞能量(Normalized collision energy，NCE):35 eV。高分辨質譜離子信息及碰撞能量見表1。利用全掃描結果外標法定量，Target MS2結果定性。

表1 10種多酚類物質的HPLC－QE HRMS質譜參數(shù)Table 1 Mass spectral parameters of HPLC－QE HRMS for 10 polyphenols

1.4 樣品前處理

取1 mL葡萄酒與9 mL水混合，用濃鹽酸調(diào)至pH 2.0，加入3 mL乙酸乙酯，振蕩提取10 min，3 500 r/min離心5 min，取上清液至15 mL離心管中，重復提取3次，合并提取液，于30℃水浴中氮吹至干，用10 mL 50%甲醇水復溶。取100 μL復溶液，與900 μL 50%甲醇水混合，過0.22 μm尼龍濾膜后進樣檢測。

2 結果與討論

2.1 提取方法的優(yōu)化

葡萄酒中多酚類物質通常采用有機溶劑(乙醚或乙酸乙酯)液液萃?。?－9］或固相萃取(SPE)［7］方式進行提取。與固相萃取相比，液液萃取法操作相對簡單。而Malovana［7］和陳建業(yè)［9］等的研究表明，液液萃取法的提取效率優(yōu)于SPE法，故本研究采用乙酸乙酯液液萃取的方式進行提取?？疾炝藀H值分別為2.0，4.0，7.0時的提取結果(圖1)，結果顯示，pH 2.0時各物質的提取效率最高，這可能與目標物質在pH 2.0時均呈分子狀態(tài)，更易溶于有機相有關，故本研究采用pH 2.0作為提取溶液酸度。

圖1 不同pH值條件下多酚類物質的提取效果Fig.1 Extraction effect of polyphenols in different pH values

2.2 流動相的優(yōu)化

多酚類物質通常具有帶1個或多個羥基的芳環(huán)結構，在負離子模式下檢測可獲得較強的質譜信號［14－16］。依據(jù)負離子模式檢測時物質離子化的特點，若流動相中含酸會抑制目標物的離子化，所以以水為流動相。但以甲醇－水為流動相時，多酚類物質在色譜柱上的峰形嚴重拖尾，而加入少量乙酸后，峰形明顯改善。為兼顧多酚類物質的峰形和響應值，分別在流動相中添加0.1%，0.2%，0.5%，1.0%的乙酸進行測定，結果表明，以含0.5%乙酸的水溶液與甲醇為流動相時多酚類物質的響應最佳。圖2分別為以水－甲醇和0.5%乙酸水－甲醇為流動相時香草酸的全掃描譜圖，以水－甲醇為流動相時峰形拖尾且分叉(圖2A)，而0.5%乙酸水－甲醇流動相下香草酸的峰形完好且響應高(圖2B)。香草酸的保留時間在不同流動相時相差近1 min，這可能是由于流動相呈酸性時香草酸大多以分子狀態(tài)存在，極性降低，所以在C18柱上的保留更強。

圖2 香草酸在不同流動相下的全掃描譜圖Fig.2 Full scan chromatograms of vanillic acid using different mobile phases

2.3 多酚類物質的定性定量測定

由于葡萄酒中含有大量的基質干擾物，如何對目標物進行準確定性顯得尤為重要。根據(jù)歐盟EC/657指令規(guī)定，用質譜檢測確認目標物時需要3～4個識別點，一般低分辨率質譜的前體離子(Precursor ion)為1個識別點，碎片離子(Fragment ion)為1.5個識別點，所以利用低分辨質譜進行目標物定性確認時需要1個前體離子和2個碎片離子。但由于部分多酚類物質的結構較小(如沒食子酸、香豆素和咖啡酸等)，而且均帶有含酚羥基的芳環(huán)結構，一般的質譜條件下只能獲得1個明顯的碎片離子，故利用低分辨率質譜進行這些物質的確證存在缺陷。圖3顯示了咖啡酸的碎裂質譜圖，從圖中可以看出，前體離子經(jīng)碎裂后只有1個明顯的碎片離子。因此，文獻均采用質譜與二極管陣列檢測器(DAD)聯(lián)用［11－13］，以相同保留時間點的特征吸收峰進行輔助定性，但這一技術要求每個物質在色譜柱上實現(xiàn)完全分離，整個分析時間長達70～90 min。而高分辨率質譜由于具備高質量精度和高分辨率的特點，其前體離子為2個識別點，碎片離子為2.5個識別點，所以用高分辨質譜進行小分子多酚類物質檢測時，1個前體離子和1個二級特征碎片離子可以滿足定性識別的要求。而且多個掃描事件同時掃描的模式可在一次分析過程內(nèi)同時進行全掃描和Target MS2掃描，利用全掃描獲得的前體離子進行定量，Target MS2獲得的碎片離子進行定性即可，所以分析時間大大縮短。

圖3 咖啡酸的質譜圖Fig.3 MS profile of caffeic acid

2.4 標準曲線與定量下限

以50%甲醇水配制10種多酚類物質的混合標準溶液，其濃度分別為0.001，0.005，0.01，0.1，1.0，10 mg/L，進行高分辨質譜檢測，以化合物的響應峰面積(y)為縱坐標，其對應濃度(x，mg/L)為橫坐標，擬合標準工作曲線。表2結果顯示，10種多酚類物質在相應濃度范圍內(nèi)線性關系良好，相關系數(shù)均大于0.999。以不同水平稀釋后分析化合物響應的信噪比(S/N)大于10計算方法的定量下限(LOQ)，得到各物質的 LOQ 為0.000 5～0.002 5 mg/L。文獻研究表明［7－9，11－12］，每升葡萄酒中上述10種多酚類物質的含量一般為mg級，所以，本方法的靈敏度可以滿足葡萄酒中多酚類物質稀釋100倍后的檢測需要。圖4為實際葡萄酒中10種多酚類物質的全掃描提取離子色譜圖，圖中目標物出峰明顯，不存在干擾。

表2 10種多酚類物質的標準曲線與定量下限Table 2 Standard curves and limits of quantitation of 10 polyphenols

2.5 回收率與精密度

鑒于多酚類物質在葡萄酒中普遍存在，完全空白的酒樣不易獲得，而模擬酒樣又難以反映樣品的真實屬性，所以加標回收實驗選擇多酚含量較低的白葡萄酒作為添加基質，分別添加1，5，10 mg/L(沒食子酸為5，10，20 mg/L)的多酚類混合標準，提取定容后稀釋至100倍進行測定。由于方法的LOQ遠低于真實酒樣中的含量，所以LOQ的加標回收實驗選擇在模擬酒樣(12%乙醇水溶液，以酒石酸調(diào)至pH 3.0)中添加0.000 5～0.002 5 mg/L多酚混合標準，提取定容后直接進行定量檢測。由表3可見，10種多酚類物質的加標回收率為82.0%～109.1%，相對標準偏差(RSD)均小于10%。

圖4 葡萄酒中10種多酚類物質的全掃描提取離子色譜圖Fig.4 Full scan chromatograms of 10 polyphenols in wine

表3 葡萄酒中添加10種多酚類物質的回收率與相對標準偏差(n=6)Table 3 Recoveries and RSDs of 10 polyphenols spiked in wine(n=6)

2.6 實際樣品的測定

采用本方法對天津口岸進口的來自8個國家11批次葡萄酒中的多酚類物質進行測定，結果顯示，不同產(chǎn)區(qū)葡萄酒中的多酚類物質含量差異較大(表4)?？傮w而言，干白葡萄酒(Dry white wine)中10種多酚物質的含量明顯低于干紅葡萄酒(Dry red wine)，這可能與干紅和干白葡萄酒的原料和處理工藝有關。在10種多酚類物質中，沒食子酸、兒茶素、咖啡酸、香豆素、丁香酸和槲皮素的含量相對較大，這與文獻報道［8－9］一致，但各種多酚類物質的含量和比例在不同產(chǎn)地的葡萄酒中無明顯規(guī)律，這可能是不同葡萄酒存在不同的風味特征和感官特性的原因。

表4 11種葡萄酒中10種多酚類物質的含量Table 4 Contents of 10 polyphenols in 11 wines ρ/(mg·L－1)

3 結論

本研究利用QE高分辨質譜的高分辨和精確質量信息的特點，結合全掃描和目標分子二級掃描技術，建立了葡萄酒中10種多酚類物質的準確定性和定量檢測技術。與以往HPLC和低分辨質譜法相比，高分辨質譜法不僅定性準確、靈敏度高，而且只需一種檢測器，分析速度快，有效提高了檢測的準確性和效率，能夠滿足國內(nèi)外對葡萄酒品質的有效監(jiān)管和分析需要。

［1］Cheynier V，Rigaud J．Am.J.Enol.Vitic．，1986，37(4):248 －252．

［2］Vidal S，F(xiàn)rancis L，Guyot S，Marnet N，Kwiatkowski M，Gawel R，Cheynier V，Waters E J．J.Sci.Food Argic．，2003，83(6):564－573．

［3］Liu Y J，Sun J F，Wang J．China Brewing(劉一健，孫劍鋒，王頡．中國釀造)，2009，209(8):5－9．

［4］Saint－Cricq de Gaulejac N，Vivas N，de Freitas V，Bourgeois G．J.Sci.Food Agric．，1999，79(8):1081 －1090．

［5］Rice－Evans C A，Miller N J，Paganga G．Free Radical Biol.Med．，1996，20(7):933 －956．

［6］Flamini R．Mass Spectrom.Rev．，2003，22(4):218 －250．

［7］Malovana S，Garcia Montelongo F J，Perez J P，Rodriguez－Delgado M A．Anal.Chim.Acta，2001，428(2):245 －253．

［8］Rodriguez－Delgado M A，Malovana S，Perez J P，Borges T，Garcia－Montelongo F J．J.Chromatogr.A，2001，912(2):249－257．

［9］Chen J Y，Wen P F，Zhan J C，Li J M，Pan Q H，Kong W F，Huang W D．J.Chin.Inst.Food Sci.Technol．(陳建業(yè)，溫鵬飛，戰(zhàn)吉成，李景明，潘秋紅，孔維府，黃衛(wèi)東．中國食品學報)，2006，6(6):133－138．

［10］Ma L Y，Li J M．J.Instrum.Anal．(馬麗艷，李景明．分析測試學報)，2004，23(6):87－90．

［11］Monagas M，Suárez R，Gómez－Cordovés C，Bartolomé B．Am.J.Enol.Vitic．，2005，56(2):139 －147．

［12］Sun J P，Hou X G，Liang F，Shi T H，Duan C Q．Chin.J.Anal.Chem．(孫建平，侯小歌，梁峰，時同華，段長青．分析化學)，2006，34(11):1565－1569．

［13］Ginjom I，D’Arcy B，Caffin N，Gidley M．Food Chem．，2011，125(3):823－834．

［14］Pérez－Magari1o S，Revilla I，González－SanJosé M L，Beltrán S．J.Chromatogr.A，1999，847(1/2):75 －81．

［15］Wachs T，Conboy J C，Garicia F，Henion J D．J.Chromatogr.Sci．，1991，29(8):357 －366．

［16］Hayasaka Y，Waters E J，Cheynier V，Herderich M J，Vidal S．Rapid Commun.Mass Spectrom．，2003，17(1):9－16．