胡 成， 朱善元， 左偉勇， 王安平， 吳 雙， 洪偉鳴， 成大榮， 馬麗麗，王永娟

(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009;2.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300;3.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，甘肅蘭州730070)

鴨 I型肝炎病毒(Duck hepatitis virus type I，DHV I)是一種高致死性、高傳播性的病毒性傳染病病原［1］。該病毒傳播迅速，主要侵害4周齡以內(nèi)的雛鴨。病雛鴨的特征為意識紊亂，急性肝炎，肝臟腫大，有出血斑點(diǎn)［2-3］。在新疫區(qū)，本病的死亡率很高，可達(dá)90%以上，是危害養(yǎng)鴨業(yè)發(fā)展最為嚴(yán)重的傳染病之一［4］。

DHV I的傳統(tǒng)檢測方法有血清中和試驗(yàn)、瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等，這些檢測方法雖然可以對病原做出診斷，但是存在靈敏性不高，試驗(yàn)時(shí)間長，重復(fù)性低，不易標(biāo)準(zhǔn)化等缺點(diǎn)，在實(shí)際應(yīng)用中有一定的局限性［5-7］。目前，已建立的RT-PCR和熒光定量RT-PCR檢測方法，雖然靈敏性相對較高，但是需要使用昂貴的儀器和試劑，專業(yè)的人員，試驗(yàn)周期較長，不能適應(yīng)基層獸醫(yī)站和養(yǎng)殖場簡便易行快速檢測的需要［8-9］。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，是2000年由日本榮研化學(xué)株式會社開發(fā)的一種新型的恒溫核酸擴(kuò)增方法［10］。該技術(shù)依賴于能夠識別靶序列上特異區(qū)域的引物和一種具有解旋功能的Bst DNA聚合酶，能夠在等溫條件下，短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)核酸的指數(shù)級擴(kuò)增［11］。以其簡單、快速、高效、靈敏、特異等諸多優(yōu)點(diǎn)［12-14］受到越來越多獸醫(yī)工作者的關(guān)注。在一些病原微生物的檢測中已經(jīng)開始得到推廣應(yīng)用［15-18］。目前，國內(nèi)尚無針對鴨I型肝炎病毒的一步法快速RT-LAMP檢測方法。因此本研究設(shè)計(jì)了一套特異性引物，擬建立了DHV I的可視化檢測方法，為研制DHV I的快速檢測試劑盒打下基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 病毒株

鴨I型肝炎病毒(DHV I AV2111)購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;新城疫病毒(NDV)、番鴨細(xì)小病毒(MDPV)、小鵝瘟病毒(GPV)和鴨瘟病毒(DPV)株均由本實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定并于-80℃保存。

1.2 試劑及器材

MgSO4、Bst DNA 聚合酶(大片段)、Betaine和SYBR Green I染料購自New England Biolabs公司;RT-PCR檢測試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司;病毒基因組提取試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司;限制性內(nèi)切酶 SphI、DNA marker購自TaKaRa公司;dNTP、逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、DEPC水購自Sigma公司;其他試劑均為市售分析純。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中登錄的多條DHV I的基因序列，選取一段高度保守的區(qū)域(VP1蛋白基因序列:EF442073.1)，使用在線引物設(shè)計(jì)軟件Primer Explorer V4設(shè)計(jì)多套LAMP引物，其中包括2條外引物F3和B3;2條內(nèi)引物FIP(F1c+F2)和BIP(B1c+B2);2條環(huán)引物L(fēng)F和LB，分別識別保守區(qū)域8個(gè)基因位點(diǎn)。引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成(表1)。

表1 LAMP引物序列Table 1 Sequences of LAMP primers

1.4 病毒核酸的提取

參照生工柱式病毒抽提純化試劑盒說明書及相關(guān)文獻(xiàn)記載［19］，分別提取鴨I型肝炎病毒、新城疫病毒、番鴨細(xì)小病毒、小鵝瘟病毒和鴨瘟病毒的基因組，取1 μl樣品利用分光光度儀測定病毒總含量，少量分裝，于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 RT-LAMP反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化

1.5.1 鎂離子濃度的優(yōu)化 鎂離子終濃度為3.5～6.0 mmol/L，以0.5 mmol/L梯度依次遞增，重復(fù)進(jìn)行3次平行反應(yīng)。

1.5.2 引物濃度的優(yōu)化 由于外引物對試驗(yàn)結(jié)果影響很小，所以試驗(yàn)中參照文獻(xiàn)數(shù)據(jù)固定外引物，對內(nèi)引物終濃度為 0.8 ～ 2.4 μmol/L，以 0.4 μmol/L梯度依次遞增，重復(fù)進(jìn)行3次平行反應(yīng)。

1.5.3 dNTPs濃度的優(yōu)化 dNTPs終濃度為0.8～1.8 mmol/L，以0.2 mmol/L梯度依次遞增，重復(fù)進(jìn)行3次平行反應(yīng)。

1.5.4 甜菜堿濃度的優(yōu)化 由于甜菜堿具有穩(wěn)定酶活性的作用，同時(shí)又可以增強(qiáng)反應(yīng)的特異性，甜菜堿終濃度為0.2～0.7 mol/L，以0.1 mol/L梯度依次遞增，重復(fù)進(jìn)行3次平行反應(yīng)。

1.5.5 反應(yīng)溫度的優(yōu)化 以DHV AV2111 RNA為模板，反應(yīng)溫度為61～66℃，以1℃梯度依次遞增，重復(fù)進(jìn)行3次平行反應(yīng)。

1.5.6 最佳反應(yīng)時(shí)間的確定 反應(yīng)時(shí)間為15～90 min，以15 mim梯度依次遞增，重復(fù)進(jìn)行3次平行反應(yīng)。

1.5.7 擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測 反應(yīng)結(jié)束后肉眼直接觀察反應(yīng)管是否有混濁(短暫離心后可使焦磷酸鎂沉于管底，更利于觀察);吸取10 μl反應(yīng)液于1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察;向剩余15 μl反應(yīng)液中加入0.5 μl SYBR Green I染料輔助觀察。

1.5.8 擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切鑒定 用SeqBilder軟件分析RT-LAMP目的片段中的酶切位點(diǎn)，并篩選出單一的SphI(位點(diǎn)GCATG/C)限制性內(nèi)切酶。20 μl酶切體系如下:SphI(10U)1 μl，10 × 緩沖液 H 2 μl，RT-LAMP產(chǎn)物 5 μl，超純水 12 μl ，37 ℃ 反應(yīng) 2 h。取10 μl的酶切產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察。

1.6 RT-PCR方法的建立

參照一步法RT-PCR檢測試劑盒說明書。加入引物F3和 B3及模板 RNA各1 μl。反應(yīng)體系為25 μl，于PCR儀上按如下程序進(jìn)行擴(kuò)增:45℃孵育45 min;94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸40 s，共30個(gè)循環(huán);72℃延伸7 min。

1.7 RT-LAMP的靈敏性檢驗(yàn)

將抽提的DHV I核酸模板進(jìn)行10倍系列稀釋成 10 ng/μl、1 ng/μl、100 pg/μl、10 pg/μl、1 pg/μl、100 fg/μl、10 fg/μl、1 fg/μl等 8 個(gè)濃度梯度。對各濃度RNA模板分別用所建立的RT-LAMP和RT-PCR檢測方法進(jìn)行靈敏性對比試驗(yàn)。

1.8 RT-LAMP的特異性試驗(yàn)

分別用抽提的鴨I型肝炎病毒、新城疫病毒、番鴨細(xì)小病毒、小鵝瘟病毒和鴨瘟病毒基因組，按照所建立的鴨I型肝炎病毒RT-LAMP檢測方法，進(jìn)行特異性試驗(yàn)。

1.9 RT-LAMP重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)

取等量5份不同代次的DHV I尿囊液，分別提取RNA進(jìn)行RT-LAMP檢測，觀察結(jié)果。取等量5份不同代次的DHV I尿囊液，對每一代次重復(fù)3次進(jìn)行RT-LAMP檢測，觀察結(jié)果，以確定該檢測方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-LAMP反應(yīng)條件

通過對各反應(yīng)條件的調(diào)整優(yōu)化，最終確定RT-LAMP反應(yīng)體系為25 μl:包括Bst DNA聚合酶(8 U/μl)1.0 μl、10 × Bst Buffer 2.5 μl、dNTPs(10 mmol/L)3.5 μl、Betaine(5 mol/L)2.0 μl、MgSO4(25 mmol/L)4.0 μl、AMV(5 U/μl)1.0 μl、Inhibitor(40 U/μl)1.0 μl、FIP/BIP(20 μmol/L)2.0 μl、F3/B3(20 μmol/L)0.5 μl、LF/LB(20 μmol/L)0.2 μl、模板 RNA 1.0 μl，加 DEPC 水補(bǔ)足至 25 μl。充分混勻。反應(yīng)程序:63℃反應(yīng)45 min，85℃滅活5 min。

2.2 最佳反應(yīng)時(shí)間

在反應(yīng)進(jìn)行45 min后，電泳檢測有明顯的條帶，且隨著時(shí)間延長，條帶亮度并沒有顯著增強(qiáng)，因此選擇45 min為最佳反應(yīng)時(shí)間(圖1)。

2.3 特異性

2.3.1 產(chǎn)物酶切鑒定 用限制性內(nèi)切酶SphI對RT-LAMP產(chǎn)物進(jìn)行酶切鑒定，出現(xiàn)與預(yù)期大小218 bp相符合的酶切產(chǎn)物條帶(圖2)。

2.3.2 特異性檢驗(yàn) 采用本試驗(yàn)建立的RT-LAMP方法進(jìn)行檢測，只有以DHV AV2111的RNA為模板時(shí)，結(jié)果為陽性(肉眼觀察反應(yīng)管可見乳白色渾濁，加入SYBR Green I染料后呈現(xiàn)翠綠色，1.5%瓊脂糖凝膠電泳呈現(xiàn)特異性梯形條帶)，而以新城疫病毒、番鴨細(xì)小病毒、小鵝瘟病毒和鴨瘟病毒的DNA/RNA為模板進(jìn)行檢測時(shí)，結(jié)果均為陰性(肉眼觀察反應(yīng)管清亮透明、無乳白色渾濁，加入SYBR Green I染料后呈現(xiàn)橘紅色，1.5%瓊脂糖凝膠電泳無特異性梯形條帶出現(xiàn))(圖3)，表明該方法的特異性良好。

圖1 最佳反應(yīng)時(shí)間的確定Fig.1 Determination of the best reaction time

圖2 DHVⅠRT-LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物酶切鑒定Fig.2 Results of the specificity of DHVⅠRT-LAMP assay

2.4 靈敏性

所建立的RT-LAMP對DHV RNA的最低檢測限為10 fg(圖4)，而常規(guī)RT-PCR方法最低檢測限為1 pg(圖5)，建立的 RT-LAMP敏感性比常規(guī)RT-PCR高約100倍。

圖3 RT-LAMP方法檢測DHVⅠ的特異性Fig.3 Specificity of RT-LAMP assay for DHVⅠ

圖4 RT-LAMP方法檢測DHVⅠ的靈敏性Fig.4 Sensitivity of RT-LAMP assay for DHVⅠ

圖5 RT-PCR方法檢測DHVⅠ的靈敏性Fig.5 Sensitivity of RT-PCR assay for DHVⅠ

2.5 重復(fù)性和穩(wěn)定性

取等量5份不同代次的DHV I尿囊液，分別提取RNA進(jìn)行RT-LAMP檢測，結(jié)果顯示，5份檢測結(jié)果均沒有明顯差異;取等量5份不同代次的DHV I尿囊液，對每一代次重復(fù)三次進(jìn)行RT-LAMP檢測，結(jié)果顯示，3次重復(fù)間沒有明顯差異。

3 討論

鴨病毒性肝炎是由鴨肝炎病毒(DHV)引起的雛鴨的一種具有高度傳播性、高度致死性傳染病。DHV分為I型、II型和III型，三個(gè)型之間無交叉保護(hù)作用。I型DHV呈現(xiàn)世界性分布，并常和其他病毒、細(xì)菌混合感染，對養(yǎng)鴨業(yè)危害嚴(yán)重，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［20-21］。本研究建立的DHV I檢測方法對基層和臨床快速診斷和疾病處置具有一定的指導(dǎo)意義。

LAMP技術(shù)是一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)。與其他檢測方法相比，該方法具有特異性強(qiáng)，靈敏度高，擴(kuò)增高效、快速，步驟簡單等諸多優(yōu)點(diǎn)。該技術(shù)主要利用了Bst DNA聚合酶在特異性引物的存在下于61～66℃具有解旋功能和瀑布式擴(kuò)增功能，在等溫的情況下即可實(shí)現(xiàn)核酸的變性與擴(kuò)增。LAMP的關(guān)鍵點(diǎn)是引物設(shè)計(jì)和評估，需要設(shè)計(jì)出針對基因保守片段的6條引物且識別8個(gè)特異性的位點(diǎn)。常規(guī)的LAMP只需要 F3、B3和 FIP(F1c+F2)、BIP(B1c+B2)即可實(shí)現(xiàn)目的基因的擴(kuò)增［22-24］。但是為了提高反應(yīng)效率，加快檢測速度，本研究在F1c+F2之間增加了LF引物，在B1c+B2之間增加了LB引物，大大提高了LAMP的反應(yīng)速度，在30～45 min即可實(shí)現(xiàn)目的基因的擴(kuò)增檢測。

本研究分別利用肉眼顏色觀察和瓊脂糖凝膠電泳的檢測方法對DHV I RT-LAMP反應(yīng)引物、體系進(jìn)行檢測和分析，得到了高效、特異性擴(kuò)增DHV I的RT-LAMP引物，最佳的反應(yīng)體系配比和最短有效反應(yīng)時(shí)間，建立了可視化的檢測DHV I的RT-LAMP方法，只有鴨I型肝炎陽性樣本能進(jìn)行核酸的特異性擴(kuò)增，其他常見家禽病原均不發(fā)生非特異性反應(yīng);DHV I核酸在該體系中63℃孵育45 min，即可判斷結(jié)果，比目前的PCR方法更為便捷，且檢出限量達(dá)到10 fg，顯示出極高的靈敏性。

本試驗(yàn)將肉眼沉淀觀察法、染料輔助觀察法相結(jié)合，并分別與瓊脂糖凝膠電泳法對比:其中肉眼沉淀觀察法在反應(yīng)產(chǎn)物較少時(shí)存在假陰性的可能，而SYBR Green I染料輔助觀察法與瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果高度一致，說明SYBR Green I染料輔助觀察法可作為一種檢測方法，這樣不僅省去了傳統(tǒng)的瓊脂糖凝膠電泳的過程，節(jié)省了時(shí)間和費(fèi)用，同時(shí)也保護(hù)了環(huán)境和操作人員，更加方便基層和現(xiàn)場快速檢測。

本試驗(yàn)建立的DHV I RT-LAMP檢測方法簡便、快速、靈敏、特異，具有較高的實(shí)用性，適合在基層獸醫(yī)站和養(yǎng)殖場推廣使用，為DHV I的綜合防治和早期診斷提供了便利。

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