劉 飛， 楊春艷， 謝建新

(1.玉溪師范學(xué)院物理系，云南 玉溪 653100;2.玉溪師范學(xué)院化學(xué)系，云南 玉溪 653100)

蠶豆是中國重要的冷季作物，具有蛋白質(zhì)含量高、易消化吸收、用途廣以及深加工增值的特點(diǎn)，是典型的糧、菜、飼兼用型作物，具有較高經(jīng)濟(jì)價值［1-2］。蠶豆的產(chǎn)量和品質(zhì)受生產(chǎn)過程中生物和非生物脅迫因素的影響。生物脅迫因素包括真菌、細(xì)菌、病毒等病原物引起的病害以及農(nóng)業(yè)害蟲造成的蟲害［3］。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，作物病蟲害防治措施不恰當(dāng)與隨意使用農(nóng)藥現(xiàn)象普遍存在，這影響了作物產(chǎn)品質(zhì)量，與國家發(fā)展綠色農(nóng)業(yè)、高效農(nóng)業(yè)、精細(xì)農(nóng)業(yè)的目標(biāo)不相符。其主要原因在于不能正確鑒別病蟲害和判斷病蟲害的危害程度。及時診斷病蟲害，判斷病蟲害的危害程度，采取必要措施，進(jìn)行有效防治，對提高蠶豆的產(chǎn)量和質(zhì)量具有重要意義。

目前對于作物病蟲害的研究，主要包括通過農(nóng)作物育種和田間管理減少病蟲害以及加強(qiáng)病蟲害監(jiān)測兩方面［4］。農(nóng)作物病蟲害監(jiān)測主要通過田間采樣、生物學(xué)檢測和顯微鏡觀察等方法進(jìn)行［5-6］。生物學(xué)檢測包括病原體分離、培養(yǎng)、接種鑒定等一系列過程;顯微鏡觀察需經(jīng)過固定、染色等較為復(fù)雜的過程，且主觀性強(qiáng)，不能給出樣品的化學(xué)信息［5］。用于作物病蟲害鑒定的方法還有生理生化測定技術(shù)、免疫血清檢測技術(shù)、分子生物學(xué)手段等，這些方法同樣需要分離提取，且操作繁瑣，成本較高［6-7］。近紅外光譜、高光譜、多光譜成像技術(shù)已用于農(nóng)作物病蟲害的田間診斷研究［8-9］，但易受天氣、作物覆蓋程度、田間土壤、雜草等影響，不同測量條件與環(huán)境獲得的檢測模型不同，需要提高模型的通用性和穩(wěn)定性［10］。傅里葉變換紅外光譜(FTIR)具有方便、快速、重復(fù)性好、取樣量少等特點(diǎn)，已經(jīng)用于真菌與細(xì)菌菌株［11］、作物品種與產(chǎn)地［12］等方面的鑒別。在蠶豆病蟲害的研究方面，李志永等［13］通過FTIR光譜結(jié)合主成分分析研究鑒別了蠶豆不同病害。主成分分析中通過主成分得分圖進(jìn)行分類鑒別，在病蟲害種類較多、樣品數(shù)量較大的情況下難于操作，需要在FTIR光譜的基礎(chǔ)上結(jié)合其他方法繼續(xù)研究。判別分析是多元統(tǒng)計分析中判斷個體所屬類型的應(yīng)用性很強(qiáng)的統(tǒng)計方法［14］。FTIR光譜結(jié)合判別分析用于農(nóng)產(chǎn)品分類鑒別已有報道［15-16］，但用于植物病蟲害診斷鑒別的研究未見報道。本研究用蠶豆病蟲害葉片樣品的FTIR光譜及其一階導(dǎo)數(shù)光譜和二階導(dǎo)數(shù)光譜，結(jié)合判別分析對蠶豆病蟲害種類和病原物類別進(jìn)行診斷研究，同時比較挑選變量建立判別函數(shù)時不同方法的診斷效果，期望為蠶豆病蟲害的診斷提供新的簡便快捷方法。

1 材料與方法

1.1 材料

測試樣品采自云南省陸良縣、宜良縣、富民縣、通?？h、新平縣和玉溪市等地，包括結(jié)莢期正常蠶豆葉片和結(jié)莢期11種蠶豆病蟲害葉片，共110個樣品;11種蠶豆病蟲害的病原物涉及真菌、細(xì)菌、病毒和蟲害等4種(表1)。樣品在自然條件下晾干待測。

表1 試驗樣品名稱及病原物類別Table 1 Name and category of pathogen of each sample

1.2 儀器與試劑

紅外光譜儀為PE公司生產(chǎn)的Frontier型傅里葉變換紅外光譜儀。采用 DTGS檢測器，光譜分辨率為4 cm-1，測量范圍為4 000～400 cm-1，掃描次數(shù)為16次。試驗試劑溴化鉀，純度99.9%。

1.3 試驗方法和數(shù)據(jù)處理

取各樣品葉片的病斑部分放入瑪瑙研缽研磨成均勻細(xì)粉，再按1︰60的比例加入溴化鉀粉末攪磨均勻，然后壓片測試。每個葉片樣品壓制1個掃描片，測試紅外光譜，所有光譜都扣除背景，并在光譜軟件Omnic8.0中進(jìn)行自動基線校正、九點(diǎn)平滑和歸一化等預(yù)處理。各樣品紅外光譜的一階導(dǎo)數(shù)光譜和二階導(dǎo)數(shù)光譜在Omnic8.0中計算。

判別分析使用SPSS V20.0軟件。以已知病蟲害類別樣品紅外光譜數(shù)據(jù)為判別指標(biāo)，采用逐步判別法，選擇判別指標(biāo)挑選方法，依據(jù)Fisher線性判別準(zhǔn)則建立病蟲害類別的判別函數(shù)，進(jìn)行樣品病蟲害的預(yù)測診斷。在SPSS V20.0的判別分析模塊中，判別指標(biāo)挑選方法共設(shè)置有5種，即 Wilks’Lambda、Unexplained variance、Mahalanobis distance、Smallest F ratio和 Rao’s V。本研究中，事先將樣品分為訓(xùn)練樣本和測試樣本，從病蟲害樣品中各抽取5個組成訓(xùn)練樣本，共60個樣品。測試樣本由各種病蟲害樣品中余下的組成，共50個樣品。

2 結(jié)果與分析

2.1 蠶豆病蟲害葉片的紅外光譜特征

圖1為蠶豆正常葉片和病蟲害葉片樣品的紅外光譜圖。根據(jù)文獻(xiàn)［12］、［13］將光譜中主要的光譜峰歸納如下:光譜在波數(shù)3 400 cm-1附近的強(qiáng)寬峰為O-H和N-H的伸縮振動吸收;2 958 cm-1和2 876 cm-1附近的弱吸收峰是甲基的C-H反對稱和對稱伸縮振動;2 930 cm-1和2 853 cm-1附近的弱吸收峰是亞甲基的C-H反對稱和對稱伸縮振動;1 740 cm-1附近的弱吸收峰是脂類C=O的伸縮振動;1 644 cm-1附近的強(qiáng)吸收峰是酰胺Ⅰ帶C=O的伸縮振動;1 550 cm-1附近中等強(qiáng)度的吸收峰是酰胺Ⅱ帶N-H和C-N的吸收峰;1 440～1 330 cm-1主要為蛋白質(zhì)、纖維素、木質(zhì)素等受氧、氮原子影響的甲基和亞甲基對稱彎曲振動以及甲基的C-H剪式振動;1 280 cm-1附近出現(xiàn)的吸收峰是酰胺Ⅲ帶C-N的伸縮振動和N-H彎曲振動以及木質(zhì)素中C-O伸縮振動的疊加;位于1 148 cm-1、1 102 cm-1和1 053 cm-1附近的階梯峰，主要?dú)w屬為纖維素、木質(zhì)素等多糖類物質(zhì)C-O和CO-C 的伸縮振動;922 cm-1、670 cm-1、622 cm-1等弱峰為糖環(huán)或長鏈亞甲基中C-C的伸縮振動;836 cm-1附近的弱吸收峰為木質(zhì)素中 C-H平面彎曲振動。上述光譜特征表明蠶豆葉片中主要含蛋白質(zhì)類物質(zhì)、纖維素和木質(zhì)素等多糖類物質(zhì)。

圖1 蠶豆正常葉片和病蟲害葉片樣品的紅外光譜圖Fig.1 FTⅠR spectra for healthy leaves and diseases and pestsinfected broad bean leaves

2.2 不同范圍的紅外光譜對蠶豆病蟲害種類的判別分析

分別選擇1 800～950 cm-1、1 800～1 200 cm-1、1 800～ 1 500 cm-1、1 500～ 1 200 cm-1和1 200～950 cm-15個不同范圍的測試樣品紅外光譜數(shù)據(jù)作為判別指標(biāo)，按照逐步判別法，選用Wilks’Lambda方法挑選變量，依據(jù)Fisher線性判別準(zhǔn)則建立病蟲害類別的判別函數(shù)，對樣品進(jìn)行判別診斷。5個不同范圍的紅外光譜數(shù)據(jù)對蠶豆病蟲害種類的判別分析結(jié)果見表2。由表2可知，1 800～1 200 cm-1光譜范圍的數(shù)據(jù)所建立的判別函數(shù)對測試樣品的診斷效果相對較好，訓(xùn)練樣本回判的正確率為98.3%，測試樣本預(yù)測的正確率為82.0%，總體判別正確率為90.9%。

表2 不同范圍的紅外光譜對蠶豆病蟲害種類的判別分析結(jié)果Table 2 Discriminant analysis of the category of diseases and pests of broad bean based on different range spectrum

2.3 不同級別的紅外光譜對蠶豆病蟲害種類的判別分析

分別以各樣品在1 800～1 200 cm-1的紅外光譜、一階導(dǎo)數(shù)紅外光譜和二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜數(shù)據(jù)作為判別指標(biāo)，按照逐步判別法，選用Wilks’Lambda方法挑選變量，依據(jù)Fisher線性判別準(zhǔn)則建立病蟲害類別的判別函數(shù)對樣品進(jìn)行判別診斷。3種級別的紅外光譜對蠶豆病蟲害種類的判別分析結(jié)果見表3。在表3中，一階導(dǎo)數(shù)紅外光譜數(shù)據(jù)所建立的判別函數(shù)對訓(xùn)練樣本回判的正確率和對測試樣本預(yù)測的正確率以及總體判別正確率都最高，紅外光譜的次之，且判別正確率與一階導(dǎo)數(shù)紅外光譜的較接近，表明紅外光譜數(shù)據(jù)和一階導(dǎo)數(shù)光譜數(shù)據(jù)都適合作為蠶豆病蟲害診斷的判別指標(biāo)。導(dǎo)數(shù)光譜能放大光譜特征，同時也會降低光譜的信噪比。不同病蟲害的蠶豆葉片中主要物質(zhì)成分差異不大，光譜信息中反映不同病蟲害的信息相對較弱，導(dǎo)數(shù)光譜放大光譜特征的同時，也會降低甚至掩蓋不同病蟲害的光譜信息。因此，二階導(dǎo)數(shù)光譜數(shù)據(jù)作為判別指標(biāo)所建立的判別函數(shù)，診斷效果較差。相對而言，3種級別的光譜數(shù)據(jù)中，一階導(dǎo)數(shù)光譜數(shù)據(jù)更適合于用作判別指標(biāo)診斷蠶豆病蟲害。

表3 不同級別的紅外光譜對蠶豆病蟲害種類的判別分析結(jié)果Table 3 Discriminant analysis of the category of broad bean diseases and pests based on different level spectrum

2.4 不同判別指標(biāo)挑選方法對病蟲害診斷效果的比較

以1 800～1 200 cm-1的一階導(dǎo)數(shù)光譜數(shù)據(jù)作為判別指標(biāo)，采用逐步判別法，用不同方法挑選變量，按照Fisher線性判別準(zhǔn)則分別建立判別函數(shù)，對樣品進(jìn)行診斷比較。同時采用五折交叉驗證法檢驗不同方法所建立的判別函數(shù)的穩(wěn)定性［17］。由表4可知，5種方法所建立的判別函數(shù)在5種訓(xùn)練樣本情況下對訓(xùn)練樣本的回判正確率都是100%，但對測試樣本的預(yù)測正確率差異明顯。選擇Unexplained variance方法時，預(yù)測正確率最高，為84.8%;選擇Wilks’lambda方法時，預(yù)測正確率次高，為80.0%;選擇Mahalanobis distance方法時，預(yù)測正確率最低，為73.2%。同種方法在五折交叉驗證的不同訓(xùn)練樣本情況下，對測試樣本的預(yù)測正確率差異，反映了這種方法所建立的判別函數(shù)的穩(wěn)定性。選擇Wilks’lambda方法時，5種訓(xùn)練樣本情況下對測試樣本的預(yù)測正確率差異相對最小，說明 Wilks’lambda方法所建立的判別函數(shù)相對最穩(wěn)定。綜合不同方法在5種訓(xùn)練樣本情況下對測試樣本預(yù)測的平均正確率、最高正確率和最低正確率考慮，在用基于一階導(dǎo)數(shù)紅外光譜數(shù)據(jù)的判別分析方法對蠶豆病蟲害進(jìn)行診斷時，選用Unexplained variance逐步判 別法最合適，其次為Wilks’lambda逐步判別法。

表4 挑選判別指標(biāo)不同方法對蠶豆病蟲害種類的判別分析結(jié)果Table 4 Discriminant analysis of the category of broad bean diseases and pests based on ways to choose discriminant indexes

2.5 一階導(dǎo)數(shù)光譜結(jié)合判別分析對蠶豆病蟲害病原物類別的診斷

以樣品在1 800～1 200 cm-1的一階導(dǎo)數(shù)紅外光譜數(shù)據(jù)作為判別指標(biāo)，每種病蟲害選擇5個樣品作為訓(xùn)練樣本，其余樣品作為測試樣本，采用逐步判別法，判別指標(biāo)挑選方法分別選擇Unexplained variance和 Wilks’lambda，按照Fisher線性判別準(zhǔn)則建立病蟲害病原物類別判別函數(shù)，對樣品病蟲害病原物類別進(jìn)行診斷，結(jié)果見表5。采用Unexplained variance方法時，訓(xùn)練樣本回判正確率為100%，測試樣本預(yù)測正確率為70.0%，總正確率為86.4%;采用Wilks’lambda方法時，訓(xùn)練樣本回判正確率為98.3%，測試樣本預(yù)測正確率為84.0%，總正確率為91.8%。說明通過樣品的一階導(dǎo)數(shù)紅外光譜數(shù)據(jù)結(jié)合判別分析方法能鑒別蠶豆病蟲害的病原物類別，Wilks’lambda逐步判別法診斷效果相對較好。

表5 一階導(dǎo)數(shù)紅外光譜對蠶豆病蟲害病原物類別的判別分析結(jié)果Table 5 Discriminant analysis of the category the of pathogen of broad bean diseases and pests based on first derivative spectrum

3 討論

利用FTIR光譜技術(shù)測試了結(jié)莢期蠶豆正常葉片和11種蠶豆病蟲害葉片共110個樣品的紅外光譜，通過光譜軟件Omnic8.0計算了各樣品的一階導(dǎo)數(shù)紅外光譜和二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜。以紅外光譜數(shù)據(jù)為判別指標(biāo)，按照逐步判別法，依據(jù)Fisher線性判別準(zhǔn)則對蠶豆病蟲害種類進(jìn)行診斷研究，比較了5個不同光譜范圍、3種級別光譜、5種判別指標(biāo)挑選方法所建立的判別函數(shù)的鑒別診斷效果，同時按照5折交叉驗證法檢驗了5種判別指標(biāo)挑選方法的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，基于蠶豆病蟲害葉片的一階導(dǎo)數(shù)紅外光譜數(shù)據(jù)結(jié)合逐步判別分析法能較好診斷樣品的病蟲害種類和病原物類別，以1 800～1 200 cm-1的光譜數(shù)據(jù)為判別指標(biāo)，采用Unexplained variance逐步判別法對病蟲害種類診斷時，正確率相對最高，為93.1%;采用Wilks’lambda逐步判別法對病原物類別診斷時，正確率為91.8%。FTIR光譜技術(shù)具有方便快捷的特點(diǎn)，與判別分析方法相結(jié)合，可為蠶豆病蟲害診斷提供一種簡便易行的方法。

逐步判別法是一種有監(jiān)督的模糊識別統(tǒng)計方法，需要根據(jù)已經(jīng)掌握的事物分類情況，對每個類別的若干樣本的特征指標(biāo)，按照某種挑選指標(biāo)的方法將樣本的變量信息逐一進(jìn)行檢驗，篩選出對樣本分類影響較大的指標(biāo)建立判別函數(shù)，進(jìn)行分類鑒別。因此，使用逐步判別法來對事物進(jìn)行分類鑒別時，必須事先掌握一批按事物特征分類的樣本。蠶豆病蟲害葉片的FTIR光譜是葉片物質(zhì)組分信息的綜合反映，包含著品種、產(chǎn)地、栽培方式、病蟲害等信息。這些信息隱藏在樣品光譜中，相互交織，通過對大量樣品光譜的統(tǒng)計分析，可以挖掘出相關(guān)特征信息用以相關(guān)的識別。基于病蟲害危害葉片F(xiàn)TIR光譜進(jìn)行病蟲害類別判別分析時，為了能建立好的判別模型，準(zhǔn)確區(qū)分病蟲害類別，采集樣本量必須大，且同種病蟲害樣品覆蓋的品種和產(chǎn)地要多，用以建立判別函數(shù)的訓(xùn)練樣本應(yīng)盡量包含各品種和各產(chǎn)地的樣品。在SPSS V20.0判別分析模塊的判別輸出結(jié)果中，對待判樣品的分類判別輸出了2個結(jié)果，即最大可能判別結(jié)果和次大可能判別結(jié)果。本試驗的判別分析結(jié)果，都是按最大可能判別結(jié)果計算的。但我們注意到最大可能判別結(jié)果和次大可能判別結(jié)果相結(jié)合，能幫助提高待判樣品判別結(jié)果的相對準(zhǔn)確性，縮小待判樣品分類所屬范圍。例如在本研究中以1 800～950 cm-1光譜數(shù)據(jù)作為判別指標(biāo)，按照Wilks’lambda逐步判別法，依據(jù)Fisher線性判別準(zhǔn)則建立病蟲害種類的判別函數(shù)對樣品進(jìn)行診斷鑒別時，對測試樣本預(yù)測的最大可能判別結(jié)果中判別錯誤的有11個，預(yù)測正確率為78.0%，而在最大可能判別結(jié)果和次大可能判別結(jié)果中都判別錯誤的減少到3個，預(yù)測的相對正確率增加到96.0%。

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