申剛義，高 妍，張愛芹，劉 佳，白 羽

(1．中央民族大學 中國少數民族傳統(tǒng)醫(yī)學研究院，北京 100081;2．中央民族大學 生命與環(huán)境科學學院，北京 100081;3．中國科學院 化學研究所，北京 100190)

氨基酸作為構筑生命物質的基元分子之一，是最常見的一類手性物質，其對映異構體的手性識別是當前化學、生物以及藥學等眾多領域的研究熱點之一［1－3］。氨基酸的手性識別方法主要有色譜法［4－6］、質譜法［7－8］、X 射線衍射法等［9－10］。這些方法雖然優(yōu)勢明顯，但也存在不足。最為常用的手性色譜法通常需對氨基酸分子衍生化，而衍生基團對手性識別造成的影響難以預測。更為主要的是這些方法只能檢測到手性識別的結果，而無法直觀獲取手性識別的動力學信息。

相對于上述方法，表面等離子體共振(Surface plasmon resonance，SPR)技術作為近年發(fā)展起來的一種表面型傳感方法，具有免標記、實時、快速等優(yōu)點，為動態(tài)研究分子間相互作用提供了良好平臺［11］。國內外眾多學者利用 SPR 技術開展了相關研究［12－16］，如 Fornstedt等［12－13］利用 SPR 技術開展了手性藥物與蛋白相互作用的研究。Chen等［13］構筑了硫酸葡聚糖傳感膜，研究了其對D-和L-半胱氨酸手性作用的差異。金欽漢等［15］研究了D-和L-苯甘氨酸與兩種白蛋白的結合差異性。本課題組基于SPR技術，研究了牛血清白蛋白對色氨酸對映異構體手性識別的動力學行為［16］。

氨基酸在生物體內的吸收路徑主要依靠血液。人血清白蛋白(Human serum albumin，HSA)作為人體血液含量最豐富的血漿蛋白，承擔著結合和運輸氨基酸的作用。氨基酸對映異構體與HSA結合能力的大小，直接影響到其在人體內的生理作用。因此，研究HSA大分子與手性氨基酸小分子之間的相互作用具有重要意義。

本文以HSA作為手性識別主體分子，從19種手性氨基酸中選擇3種有紫外吸收(色氨酸(Try)、苯丙氨酸(Phe)、組氨酸(His))和2種無紫外吸收的(蛋氨酸(Met)、精氨酸(Arg))的氨基酸作為客體分子，利用SPR技術研究了它們相互作用過程中的動力學行為，并對其識別機理進行了簡要探討。試圖將SPR技術發(fā)展為研究氨基酸手性識別作用的通用方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

ProtenOn XPR36生物分子相互作用系統(tǒng)、GLH傳感芯片;氨基偶聯試劑盒:包括N-羥基硫代琥珀酰亞胺(Sulfo－NHS)，N-乙基-N'-(二甲氨基丙基)碳二亞胺(EDC)，1 mol/L鹽酸乙醇胺(pH 8.5)和醋酸緩沖液;芯片再生試劑盒(BioRad公司):包括0.5%SDS，50 mmol/L NaOH，100 mmol/L HCl。HSA(純度＞96%，Sigma公司)。氨基酸對映異構體(色譜純，上?；菖d生化試劑有限公司)。其余試劑均為分析純，購自北京化學試劑公司。運行緩沖液(PBST)由濃度為10 mmol/L的Na3PO4和150 mmol/L的NaCl配制，加入0.005%吐溫20，用HCl調至pH 7.4，使用前經0.22 μm微孔濾膜過濾。pH值由Sartorius PB－10 pH計測定。實驗用水為Milli-Q純水系統(tǒng)(Millipore公司)提供的去離子水。

1.2 實驗方法

1.2.1 HSA在芯片上的固定 HSA固定步驟按照文獻 ［16］進行:①0.05 mol/L的Sulso－NHS和0.2 mol/L的EDC按體積比1∶1混合后，以25 μL/min的流速流過傳感芯片通道，時間200 s;②0.68 mg/mL的HSA醋酸緩沖溶液(pH 4.5)以25 μL/min的流速流過傳感芯片通道，時間200 s;③通入鹽酸乙醇胺進行去活封閉;④通入緩沖液，除去非特異性吸附。第2個通道作為對照只進行活化和封閉而不標記。實驗溫度為25℃。固定后的HSA最終標記量為19 kRU(千響應單位)。

1.2.2 氨基酸樣品配制 實驗所用氨基酸對映異構體溶液由運行緩沖液PBST配制。分析物最高濃度經2倍倍比稀釋，得5個濃度梯度。另設置一個只有PBST的溶液作為空白對照。以Phe為例，L-，D-Phe兩種對映異構體的最高濃度為40 mmol/L，可得6種濃度梯度:40，20，10，5，2.5，0 mmol/L。

1.2.3 相互作用 待傳感膜制備后，同種氨基酸構型的6種濃度系列同時以30 μL/min流速流過HSA固定通道并與HSA作用，實時采集響應信號，結合時間為150 s，解離100 s。上述實驗在25℃進行。

1.2.4 數據處理 利用ProtenOn Manager 2.1.2軟件進行數據分析處理，計算各種動力學、熱力學參數。

2 結果與討論

2.1 HSA對5種氨基酸對映異構體手性識別的動力學研究

圖1為L-Try，D-Try分別與HSA相互作用的動態(tài)過程。從圖中可直觀看到，Try濃度越高，其響應值或結合量越大;且曲線斜率越大，表明初始反應速度越快。進一步比較可發(fā)現，兩種異構體在與HSA作用過程中存在明顯的動力學差異。在結合起始階段，L-Try與HSA達到結合平衡所需時間約6 s(圖1A)，D-Try與HSA達到平衡的時間約10 s(圖1B)，L-Try與HSA的結合速度快于D-Try。結合平衡階段，L-Try與HSA的結合量明顯小于D-Try。以10 mmol/L為例，L-Try和 D-Try的響應值分別為155 RU和178 RU。解離階段，L-Try與BSA解離曲線的斜率大于D-Try，表明其速度略快于D-Try。上述動力學差異隨著樣品濃度的增加而更加明顯。

鑒于該實驗中除了Try對映異構體的空間構型差異之外，其它條件完全一致，因此可以說明HSA與兩種對映異構體相互作用的過程中產生了手性識別。

圖1 Try對映異構體與HSA的動態(tài)相互作用Fig.1 Kinetic analysis of interactions between HSA and Try enantiomer Try concentration(a→f):10，5，2.5，1.25，0.625，0 mmol/L;25 ℃

對比發(fā)現，結合快慢并不能反映結合量的大小。該實驗結果與前期研究的BSA與Try手性識別的動態(tài)過程基本相似［16］，唯一差別在于，HSA與Try作用達到平衡時的結合量小于BSA。這表明HSA和BSA對Try具有類似的手性識別機制:即HSA與L-Try為特異性作用，而與D-Try為非特異性作用。在低濃度下，Try與HSA之間主要以非特異性吸附為主，L-Try與HSA作用的動力學行為與D-Try相比差別不大。而隨著濃度的增加，手性識別的特異性吸附逐漸明顯，導致L-Try，D-Try與HSA作用的動力學差異增大。

圖2為L-Phe，D-Phe分別與HSA相互作用的動態(tài)過程。從圖中可以看出，與D-Phe相比，L-Phe與HSA的結合快，解離慢。類似于Try，在結合平衡階段，L-Phe與HSA的結合量也明顯小于D-Phe。這可能是由于Phe和Try同屬中性氨基酸，并且均含有疏水的芳香環(huán)，因此它們與HSA的相互作用顯示一定的相似性。

圖2 Phe對映異構體與HSA的動態(tài)相互作用Fig.2 Kinetic analysis of interactions between HSA and Phe enantiomer Phe concentration(a→f):40，20，10，5，2.5，0 mmol/L;25 ℃

圖3為L-Met，D-Met分別與HSA相互作用的動態(tài)過程。Met的結構與前兩種氨基酸相比有明顯差別。與前兩種氨基酸不同，L-Met與HSA的結合與解離的速度均大于D-Met。而兩者達到平衡時的結合量基本相等。

圖3 Met對映異構體與HSA的動態(tài)相互作用Fig.3 Kinetic analysis of interactions between HSA and Met enantiomer Met concentration(a→f):100，50，25，12.5，6.25，0 mmol/L;25 ℃

研究同時發(fā)現，L-Arg，D-Arg分別與HSA相互作用的動態(tài)過程不同于前幾種氨基酸，不僅L-Arg與HSA的結合速度及解離速度均明顯小于D-Arg，而且在結合平衡階段與HSA的結合量也明顯小于DArg。而對于His，其對映異構體與HSA相互作用的動態(tài)過程與Met基本類似。差別在于結合平衡階段，L-His與HSA的結合量大于D-His。

2.2 動力學參數計算

根據Langmuir等溫吸附模型，假設芯片表面雙分子反應遵循假一級反應動力學公式［16］:

式中，A為分析物;B為結合在芯片上的蛋白;AB為芯片表面的結合物;ka是吸附過程的動力學常數，即結合速率常數;kd是脫附過程的動力學常數，即解離速率常數。

其中R為結合物在時間t的響應信號;dR/dt為結合物響應信號的變化速率;C為分析物濃度;Rmax為結合物的最大響應信號(共振單位)。

根據公式，以不同濃度的樣品進行實驗，可計算出HSA對氨基酸相互作用的各種動力學參數和熱力學參數，結果如表1所示。

表1 HSA和不同氨基酸對映異構體結合的動力學數據與親和力常數Table 1 Different parameters of interactions between amino acid and HSA at 25℃

由表1可知，對于結合速率常數(ka)，除Arg外，其余氨基酸的L-型均大于D-型。而對于解離速率常數kd，Try，Met，His是L-型大于D-型，Phe和Arg則是D-型大于L-型。雖然5種氨基酸的這兩個速率常數無統(tǒng)一規(guī)律，但在解離平衡常數KD或結合平衡常數KA上卻有著明確的一致性。且HSA和L-型氨基酸的KA與D-型的KA之比均大于1，即HSA與所有氨基酸的L-型的親和力均大于D-型。這表明HSA對氨基酸對映異構體存在著手性識別作用，基于手性識別的差異性結合最終導致L-型氨基酸更易與HSA作用。還應指出的是，雖然部分D-型氨基酸與HSA的結合量大于L-型，但并不影響親和力，這可能和氨基酸分子本身質量，以及是否為特異性結合等有關［4］。

3 結論

本文利用SPR技術，實時研究了HSA與5種常見氨基酸對映異構體相互作用的動態(tài)過程。與其它方法相比，SPR方法不僅可以實時模擬生命體內分子相互作用的整個動力學過程，而且還可獲得真實可靠的動力學參數和熱力學信息。HSA對氨基酸對映異構體的差異性識別結果可為闡釋生命體主要選擇L-型氨基酸提供一定的依據。

［1］Berthod A．Anal.Chem．，2006，78(7):2093 －2099．

［2］Imai H，Munakata H，Uemori Y，Sakura N．Inorg.Chem．，2004，43(4):1211－1213．

［3］Mei X，Wolf C．J.Am.Chem.Soc．，2004，126(45):14736 －14737．

［4］Li S，Zhang F B，Zhang G L．Chin.J.Anal.Chem．(李爽，張鳳寶，張國亮．分析化學)，2006，34(3):385－388．

［5］Guo L，Lin S J，Yang Y F，Qi L，Wang M X，Chen Y．J.Chromatogr.A，2003，998(1/2):221 －228．

［6］Mu X，Qi L，Qiao J，Yang X，Ma H．Anal.Chim.Acta，2014，846(1):68－74．

［7］Zhang S Z，Wu B D，Liu Q，Guo J F，Xie J W．Chin.J.Anal.Chem．(張淑珍，吳弼東，劉勤，郭繼芬，謝劍煒．分析化學)，2005，33(1):123－128．

［8］Schalley C A．Mass Spectrom.Rev．，2001，20(5):253 －309．

［9］Zilinsksa A，Stoncius S，Butkus E．Chirality，2005，17:S70 －S73．

［10］Riela S，D’Anna F，Meo P L，Gruttadauria M，Giacalone R，Noto R．Tetrahedron，2006，62(18):4323－4330．

［11］Yao T，Li T F，Qin Y C，Wang J，Zhao Z，Gu X，She Y X．J.Instrum.Anal．(姚婷，李騰飛，秦玉昌，王靜，趙禎，谷旭，佘永新．分析測試學報)，2015，4(2):237－244．

［12］Arnell R，Ferraz N，Fornstedt T．Anal.Chem．，2006，78(5):1682 －1689．

［13］Chen Y，Huang H，Yu X，Qi L．Carbohydr.Res．，2005，340(12):2024 －2029．

［14］Chen H，Cheng H，Lee J，Kim J，Hyun M，Koh K．Talanta，2008，76(1):49－53．

［15］Zou X Y，Zhou J G，Feng G D，Zhang L，Li M，Jin Q H．Chem.J.Chin.Univ．(鄒向宇，周建光，馮國棟，張磊，李明，金欽漢．高等學?；瘜W學報)，2006，27(9):1631－1634．

［16］Shen G Y，Gao Y，Dai D S，Cui J，Liu Y M，Pei L P．Chem.J.Chin.Univ．(申剛義，高妍，戴東升，崔箭，劉裕明，裴凌鵬．高等學校化學學報)，2011，32(8):1709－1713．