摘要：齦紫齦單胞菌（Porphyromonas gingivalis，Pg）為黑色桿狀G+耐氧厭氧菌（aerotolerant anaerobes），可定殖、感染于口腔組織，并通過牙齦蛋白酶降解胞外基質及細胞骨架蛋白，實現(xiàn)對宿主細胞的入侵和胞內自我復制。研究發(fā)現(xiàn)，Pg定殖、感染后可促進宿主細胞活性氧簇（reactive oxygen species， ROS）釋放、介導炎癥細胞因子分泌，并在感染部位通過多通路調節(jié)宿主細胞凋亡，引發(fā)牙周疾病。實驗證實，Pg可調節(jié)牙周組織的中成纖維細胞，上皮細胞，淋巴細胞的凋亡活動。Pg誘導的細胞凋亡調節(jié)是多因素共同作用的結果，本文主要從P2X7嘌呤受體及AKT/IP3信號對Pg調控牙齦上皮細胞（human gingival epithelial cells、HGEC）凋亡的作用研究進展做一簡要綜述。

關鍵詞：齦紫齦單胞菌；牙齦上皮細胞；P2X7受體；AKT/IP3信號；凋亡

牙周炎是由菌斑微生物引發(fā)，病原微生物與宿主反應相互作用所致的一類導致牙周支持組織破壞，患牙咀嚼功能喪失的感染性疾病。細胞凋亡出現(xiàn)在慢性細菌感染所致的牙齦炎癥位點[1，2]，免疫組化研究揭示，牙周組織炎癥發(fā)生的早期即可觀察到牙周組織細胞的凋亡，表明牙周組織細胞凋亡與牙周炎的發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系。最近的研究證實Pg可通過牙齦上皮細胞表面的P2X7嘌呤受體介導其活性氧簇ROS釋放增加[3，4]。其產生的核苷二磷酸激酶（NDK）則抑制嘌呤受體P2X7介導的ATP升高引發(fā)的HGECs凋亡[5]。賴氨酸/精氨酸復合通過胞內AKT/PI3Ks信號則對線粒體依賴凋亡相關細胞因子Bad、caspase-9產生活化抑制，從而抑制凋亡誘導引發(fā)的HGECs凋亡[8]。現(xiàn)將有關Pg介導的凋亡調節(jié)機制研究進展簡述如下。

1 ATP依賴嘌呤受體P2X7門控型離子通道參與Pg介導的牙齦上皮細胞（human gingival epithelial cells HGEC）凋亡調控

1.1 Pg核苷二磷酸激酶（NDK） 抑制嘌呤受體P2X7介導的HGEC凋亡作用 PG感染牙周組織時，ATP作為危險信號胞外濃度升高并介導HGEC凋亡發(fā)生[3]。目前的研究認為Pg外釋的核苷二磷酸激酶（NDK），可最大程度清除胞外ATP，從而抑制嘌呤受體P2X7介導的HGEC凋亡作用[4，5]。5mM ATP預處理GECs 1h后，鈣磷脂結合蛋白Ⅴ/碘化丙啶染色，流式細胞凋亡檢測顯示與未處理對照組相比凋亡水平顯著增加（P=0.02 student t-Text）。在使用P2X7選擇性抗體預處理的HGEC，其由ATP介導的凋亡受到顯著抑制。NDK基因敲除的變種Pg不再具有ATP介導凋亡效應的抑制作用，重組的Pg源性NDK則可顯著抑制NDK基因敲除的變種Pg感染或未感染HGEC中ATP介導的早期P2X7質膜穿孔效應。Pg抑制ATP介導的HGEC凋亡效應依賴于細胞膜表面的P2X7嘌呤受體。

1.2 Pg介導的HGEC 釋放 ROS依賴于P2X7受體途徑 炎癥環(huán)境中的ROS釋放是重要的宿主細胞防御反應之一，牙周組織中的ROS主要由中性多形核粒細胞（PMN） 及巨噬細胞產生并釋放[6]。ROS可同時介導宿主細胞及Pg病原體凋亡， Pg厭氧菌對抗環(huán)境中的氧化應激不僅使可其在微氧的牙周袋中生存，同時使其躲避了固有免疫防御細胞通過呼吸氧爆發(fā)產生的清除作用[6]。目前的研究顯示，上皮細胞在胞外ATP升高時也會產生并釋放ROS。Eroy G Henry等用 3mM ATP刺激永生化人牙齦上皮細胞系KB后產生快速反應，5min大量產生、30min后穩(wěn)定釋放ROS至少3h。使用P2X7選擇性抗體預處理該細胞后，在相同條件ATP刺激下永生化人牙齦上皮細胞產生凋亡刺激信號ROS的作用被顯著抑制。同樣使用P2X7 siRNA干預，永生化人牙齦上皮細胞對ATP刺激ROS產生受到明顯抑制。以上證據(jù)表明，感染發(fā)生時作為胞外危險信號模式分子的胞外核苷酸ATP升高，打開并通過門控型P2X7離子通道介導KB細胞產生并釋放ROS。ATP主要通過P2X7受體途徑介導此凋亡效應[5]。

2 Pg通過AKT介導原代培養(yǎng)HGECs的線粒體凋亡抑制，調節(jié)HGECs中的促凋亡蛋白Bad分布及磷酸化

AKT也被稱為蛋白激酶B（PKB），是磷脂酰肌醇3-激酶（PI3Ks）蛋白家族下游主要的效應物。PI3K信號的活化參與細胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉運等多種細胞功能的調節(jié)。活化的AKT信號磷可酸化Bcl-2家族成員Bad，使其與14-3-3結合從而阻止Bad與Bcl-XL結合起動線粒體凋亡。此外，AKT還可抑制關鍵的線粒體凋亡通路關鍵信號caspase-9的活性而阻止其下游凋亡級聯(lián)反應的激活[7]，從而調節(jié)宿主細胞凋亡進程。其與Pg介導的HGECs凋亡關系研究如下。

2.1 AKT/PI3Ks信號介導Pg引發(fā)的 HGECs凋亡調節(jié) L.Yao等[7]以十字胞堿STS 2 M/4 M為陽性對照組，對Pg ATCC 33277感染原代培養(yǎng)HGECs 2、6、12及24h，并分別于刺激前3h加入AKT siRNA 及AKT拮抗劑干預，檢測細胞凋亡率及促凋亡基因Bad表達水平、活化水平及細胞內分布情況同時檢測線粒體依賴凋亡途徑的重要啟動因子caspase-9的活化水平，結果顯示Pg ATCC 33277在BCR為100：1時對原代培養(yǎng)的HGECs凋亡水平沒有影響與空白對照組相當。并抑制STS 2 M/4 M下對HGECs的凋亡介導作用。AKT敲除后的HGECs在相同Pg刺激條件下的凋亡率上升至正常凋亡率的3倍，在Pg與STS共同刺激下的凋亡率為正常凋亡率的4倍，并顯示出統(tǒng)計學差異。AKT siRNA對HGECs不具有凋亡介導作用。以AKT及PI3Ks抗結劑LY294002 20 M預處理AKT敲除后的HGECs， 在Pg與STS共同刺激下的凋亡率不發(fā)生進一步的增加說明，AKT/PI3Ks信號是Pg調節(jié)HGECs凋亡的關鍵因子之一。

2.2 AKT信號介導Pg感染HGECs中促凋亡基因Bad的轉錄抑制 Pg感染原代培養(yǎng)HGECs 24h后Bad mRNA水平下降60%，Pg感染AKT敲除后的HGECs 24h后Bad mRNA水平升高20%。單純敲除AKT后的HGECs Bad mRNA水平沒有變化說明AKT信號介導了Pg感染的HGECs 中促凋亡基因Bad的轉錄抑制。

2.3 AKT信號介導Pg感染HGECs 中Bad胞質分布調節(jié) 免疫熒光顯微鏡觀察Pg感染或非感染原代HGECs，Bad大量分布于胞質內，凋亡誘導劑STS刺激下的HGECs中Bad強染色出現(xiàn)在核周圍，該區(qū)域是典型的線粒體胞內聚集區(qū)，而AKT敲除后的HGECs在Pg或STS及Pg和STS共同作用下均表現(xiàn)出Bad強染色分布于細核周區(qū)域。

2.4 Pg對HGECs中 caspase-9活化抑制存在AKT之外的信號轉導通路參與Pg對HGECs的凋亡抑制機制 Caspase-9作為線粒體凋亡通路中的關鍵信號分子在Pg對HGECs的凋亡抑制過程中的變化契合在此過程中線粒體依賴凋亡通路的其他相關活化抑制研究結果。L.yao的實驗證實，Pg感染HGECs后的最初30min～1h內，活化的caspase-9與未作處理的HGECs對照組相比，出現(xiàn)輕微升高，但在2 、6、12、24h后急劇下降至對照組caspase-9活化水平的50%，加入STS 4 M后Pg感染HGECs早期的30min～2h可觀察到caspase-9活化水平顯著增加，然而6h后，活化caspase-9水平大幅下降至對照組水平以下。AKT敲除后HGECs與未敲除HGEC的scaspase-9活化水平在Pg及STS刺激下無差別。但AKT特意性抗結劑JAK-1（Pyridone 6），曾在以往的實驗中證實能夠阻截Pg對STS引發(fā)的HGECs caspase-3活化升高的抑制，對Pg感染的AKT缺如HGECs 中scaspase-9活化抑制沒有影響。由此證明，Pg可對HGECs中 caspase-9活化產生具有抑制作用，但線粒體凋亡途徑的關鍵信號分子caspase-9活化抑制存在AKT之外的信號轉導通路參與Pg對HGECs的凋亡抑制機制。

綜上所述，Pg介導的凋亡抑制具有以下生化特征，ATP刺激發(fā)生時，P2X7受體構象改變開放陽離子通道[9-11]，允許K+外流，并通過募集半孔道蛋白pannexin-1形成更大型的孔型通道激活NLRP3相關炎癥蛋白分泌[12-14]，并通過NADPH氧化酶及線粒體途徑而介導ROS產生釋放，Pg源性NDK清除胞外ATP，阻截了P2X7 介導的下游級聯(lián)活化，從而抑制了宿主細胞的凋亡調節(jié)細胞凋亡[10，15-17]。凋亡刺激發(fā)生時，Pg調節(jié)線粒體膜轉運，限制細胞色素C釋放（Yilmaz 2004），抑制促凋亡蛋白Bad轉位至線粒體膜，與同源抗擊凋亡蛋白Bcl-2，Bcl-xl結合，活化具有質膜穿孔效應的Bax二聚體形成線粒體外膜孔道，釋放細胞色素C，進而進一步啟動下游的線粒體依賴的凋亡信號級聯(lián)活化，導致細胞凋亡抑制作用發(fā)生。AKT信號活化可使HGECs中Bad表達水平下降，并使其磷酸化失去線粒體轉位功能，從而介導Pg抵抗宿主細胞凋亡進程[7]。

牙齦上皮細胞作為口腔固有免疫防御的重要壁壘是最早被Pg定殖的宿主細胞之一（Schroeder and Listgarten，1997；Weinberg et al.，1998；Nisapakultorn et al.， 2001； Lamont and Yilmaz， 2002）。然而，PG對細胞凋亡的影響存在兩種相反的結論，凋亡抑制和介導凋亡都曾被報道。不同的pg菌株，不同的宿主防御，局部因素，例如感染劑量，暴露時間，都可導致?lián)p傷的跨度變化。這些pg對宿主細胞影響研究的不同結果差異與其說是相互沖突不如說是事實補充，在Pg 相對于細胞數(shù)量較少而暴露時間較短時，細菌胞內侵襲[18、19]調節(jié)宿主細胞生存延長[20-22]，引發(fā)慢性牙周炎癥。而另一方面，pg相對細胞數(shù)量較多，暴露時間長時，細菌的傷害可表現(xiàn)為介導宿主細胞凋亡[23]機制研究也證明，上述HGECs表面P2X7嘌呤受體既介導上皮細胞對Pg刺激產生的ROS釋放，胞外ATP引發(fā)的凋亡效應，同時是Pg介導宿主細胞釋放NLRP3相關炎癥介質的關鍵因子[15-17]。Pg精氨酸、賴氨酸牙齦蛋白酶通過水解細胞骨架蛋白、降解胞外基質，破壞細胞間連接，引發(fā)胞內凋亡信號分子活化抑制從而調控宿主細胞凋亡，作為pg引發(fā)宿主細胞凋亡的必要條件，在感染位點既引發(fā)宿主細胞凋亡，也誘導組織炎癥反應[24，25]。

因此，盡管包括精氨酸、賴氨酸牙齦蛋白酶復合物[24，25]，NDK，信號分子Akt/ IP3、P2X7、Caspase3/9，、Bad等細菌毒力因子、細胞膜表面受體、胞內信號/效應蛋白參與被病原體介導牙齦上細胞凋亡逐步被證實，更多的分子機制也將被闡釋和明確。然而對Pg引發(fā)牙周疾病的機制研究僅從單純的炎癥介導，或是從凋亡/壞死的調查上出發(fā)不足以揭示Pg此類可在宿主細胞定殖、入侵的機會致病菌引發(fā)組織疾病的真實過程，因而，牙周感染性疾病中，病原體、宿主免疫、凋亡介導之間的相互關聯(lián)變化在疾病初始、變遷中的生化特征應作為未來對牙周疾病發(fā)病機理的重要部分而被加以研究。

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