摘要：目的 研究外源性S100a8和S100a9與結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系。方法 Real-time PCR檢測巨噬細胞RAW264.7及結(jié)腸癌細胞CT26.WT中S100a8和S100a9的基因表達水平；ELISA檢測RAW264.7及CT26.WT細胞分泌至胞外的S100a8和S100a9的蛋白含量。劃痕實驗和Transwell實驗檢測外源性S100a8和S100a9蛋白對結(jié)腸癌細胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響。結(jié)果 S100a8和S100a9在巨噬細胞中的表達明顯高于結(jié)腸癌細胞（P=0.0126；P=0.03）；外源性S100a8和S100a9均能促進結(jié)腸癌細胞發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移（P=0.0128；P=0.0011）。結(jié)論 結(jié)腸癌腫瘤微環(huán)境中S100a8和S100a9主要在巨噬細胞中高表達和分泌，并發(fā)揮促結(jié)腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用，有可能成為治療結(jié)腸癌進展的新靶點。

關(guān)鍵詞：結(jié)直腸腫瘤；S100a8和S100a9；侵襲轉(zhuǎn)移

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是消化道最常見的惡性腫瘤之一，其全球發(fā)病率呈逐年上升趨勢。我國結(jié)直腸癌發(fā)病率已躍居惡性腫瘤發(fā)病率的第3位，其病死率高達45.5%[1]，而腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移被認(rèn)為是腫瘤致死的重要因素。研究表明S100a8和S100a9在乳腺癌、結(jié)直腸癌等多種腫瘤中高表達，且外源性的S100a8和S100a9與轉(zhuǎn)移前生態(tài)位的形成密切相關(guān)，促進腫瘤細胞的在轉(zhuǎn)移部位的定植[2-5]。本實驗著重闡述S100a8和S100a9在腫瘤微環(huán)境中的來源，并檢測外源性S100a8和S100a9對結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的影響。

1 資料與方法

1.1主要細胞和試劑 小鼠結(jié)腸癌細胞CT26.WT和小鼠巨噬細胞RAW264.7均購自ATCC。主要試劑：引物和RNA抽提試劑盒Trizol（Invitrogen）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas）；熒光染料 SYBR Green Master Mix （Takara）；S100a8和S100a9 ELISA檢測試劑盒（USCNK Life Science）；小鼠S100a8和S100a9重組蛋白（Abnova）； Transwell 小室（Corning）；基質(zhì)膠（BD Biosciences）；MTT（Sigma）。

1.2方法 Primer5軟件進行引物設(shè)計，小鼠S100a8上游引物5'-GACAATGCCGTCTGAACTGG；GCTACTCCTTGTGGCTGTCTT-3'；小鼠S100a9上游引物5'-ACCACCATCATCGACACCTTC；AAAGGTTGCCAACTGTGCTTC-3'；RNA抽提、逆轉(zhuǎn)錄、實時熒光定量PCR、Transwell實驗、劃痕實驗均嚴(yán)格按照說明書進行。以上實驗至少重復(fù)3次。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用GraphPad Prism 5 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料分析采用t檢驗，P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 S100a8和S100a9在巨噬細胞中的表達明顯高于結(jié)腸癌細胞 Real-time PCR結(jié)果顯示，巨噬細胞RAW264.7中S100a8和S100a9的基因表達水平明顯高于結(jié)腸癌細胞CT26.WT，P值分別為0.0126和0.03（圖1），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。ELISA方法同樣表明，巨噬細胞RAW264.7分泌至胞外的S100a8和S100a9蛋白含量明顯高于結(jié)腸癌細胞CT26.WT，P值分別為0.0128和0.0011（圖2），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 Real-time PCR檢測巨噬細胞RAW264.7和小鼠結(jié)腸癌細胞CT26.WT中S100a8和S100a9的表達

圖2 ELISA檢測巨噬細胞RAW264.7和小鼠結(jié)腸癌細胞CT26.WT分泌的S100a8和S100a9

2.2外源性S100a8和S100a9促進結(jié)腸癌細胞侵襲和轉(zhuǎn)移 4ug/ml的S100a8和S100a9蛋白分別刺激小鼠結(jié)腸癌細胞CT26.WT，進行劃痕實驗觀測腫瘤細胞遷移能力。如圖3所示，外源性S100a8和S100a9蛋白均能促進結(jié)腸癌細胞的遷移，誘導(dǎo)傷口愈合。以同等濃度的S100a8和S100a9蛋白分別刺激CT26.WT，transwell實驗檢測腫瘤細胞的侵襲能力，如圖4所示，外源性S100a8和S100a9蛋白均能增強結(jié)腸癌細胞的侵襲能力。

圖3 劃痕實驗檢測外源性S100a8和S100a9蛋白對CT26.WT遷移能力的影響

圖4 Transwell實驗檢測外源性S100a8和S100a9蛋白對CT26.WT侵襲能力的影響

3 討論

結(jié)直腸癌是常見的惡性腫瘤，世界范圍內(nèi)，每年約有120萬新發(fā)病例，約有60萬人死于結(jié)直腸癌[6]。我國結(jié)直腸癌年增加率為4.2%，高于全球平均遞增速度。結(jié)直腸癌的發(fā)生及發(fā)展是一個復(fù)雜的演變過程，其發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移是致死的重要原因。研究表明，腫瘤微環(huán)境中CXCL1、CCL2等多種細胞因子和趨化因子與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[7-8]。

S100a8和S100a9均屬于S100蛋白家族成員，為低分子量鈣結(jié)合蛋白，二者常以Ca2+ 依賴的方式形成S100a8/a9異源二聚體（又叫鈣衛(wèi)蛋白）發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[9]。S100a8/a9主要在粒細胞、巨噬細胞和骨髓來源抑制細胞（MDSC）中表達，LPS、 TNF -a 、IL1β、 IL-10 、IL-22等炎癥因子刺激下S100a8和S100a9表達和分泌增強，且通常與TLR4和RAGE受體結(jié)合后激活多種信號通路發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[10-11]。本研究發(fā)現(xiàn)，S100a8和S100a9主要在巨噬細胞中表達和分泌，在結(jié)腸癌細胞中的表達和分泌相對較少。

研究表明，S100a8/9參與多種腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移，且內(nèi)源性和外源性S100a8/a9對腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移扮演的角色各不相同，此特性可能依賴于胞外S100a8/a9濃度的變化。研究基本認(rèn)為在20-250ug/ml濃度范圍內(nèi)促進腫瘤細胞凋亡，小于20ug/ml的濃度促進腫瘤細胞增殖[12-14]。本研究證實，低濃度（4ug/ml）的S100a8和S100a9蛋白均能促進結(jié)腸癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。

總之，上述結(jié)果表明，結(jié)腸癌腫瘤微環(huán)境中巨噬細胞高表達和分泌S100a8和S100a9從而促進結(jié)直腸癌細胞發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移，此研究結(jié)果為結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移機制的進一步研究提供了新思路，為結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的診斷及靶向治療提供了重要的方向。

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編輯/哈濤