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        多民族麻醉手術(shù)患者血漿丙泊酚濃度的測定及分析

        2014-12-31 11:04:13李莉李培于嬋娟劉亞華楊勁
        中國醫(yī)藥導(dǎo)報 2014年34期
        關(guān)鍵詞:高效液相色譜法血藥濃度丙泊酚

        李莉++++++李培++++++于嬋娟++++++劉亞華++++++楊勁

        [摘要] 目的 建立高效液相色譜法測定人血漿中丙泊酚藥物濃度的方法,初步探究丙泊酚在不同民族的麻醉手術(shù)患者體內(nèi)的藥物代謝動力學(xué),為丙泊酚的群體藥物代謝動力學(xué)研究奠定基礎(chǔ)。 方法 收集新疆醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院麻醉科于2014年3~7月美國麻醉師協(xié)會(ASA)評級為Ⅰ~Ⅱ級的擇期手術(shù)患者95例,按民族不同分成三組,漢族組54例,維吾爾族組32例,哈薩克族組9例,均靜脈注射丙泊酚2 mg/kg后于0、1.5、2、2.5、3、3.5、4、5、6、8、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、120、150、180 min 隨機(jī)選擇3個時間點,橈動脈取血。對血樣進(jìn)行預(yù)處理后用高效液相-紫外法檢測血藥濃度。 結(jié)果 采用稀疏采樣在不同時間點共獲取了285個濃度數(shù)據(jù)。對數(shù)據(jù)進(jìn)行簡單的藥物代謝動力學(xué)分析,未見民族間有明顯差異。 結(jié)論 本研究建立的方法靈敏、準(zhǔn)確、簡單,可成功應(yīng)用于麻醉手術(shù)患者丙泊酚的血藥濃度監(jiān)測和群體藥動學(xué)研究。探究民族因素對丙泊酚的藥物代謝動力學(xué)的影響,還需進(jìn)一步研究分析。

        [關(guān)鍵詞] 丙泊酚;高效液相色譜法;血藥濃度;民族

        [中圖分類號] R614.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B [文章編號] 1673-7210(2014)12(a)-0084-05

        丙泊酚即2,6-二異丙基苯酚,又名異丙酚、普魯泊福,屬烷基酚類,是一速效短效靜脈麻醉藥,在臨床應(yīng)用廣泛。測定異丙泊酚血藥濃度,對指導(dǎo)臨床合理用藥具有重要的意義。丙泊酚血藥濃度的測定方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[1-11]、氣-質(zhì)聯(lián)用(GC/MS)[12]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)[13]。后兩種方法的靈敏度較高,所需樣品量少,但儀器普及程度不夠,難以在基層推廣應(yīng)用。目前文獻(xiàn)報道的HPLC主要有高效液相-紫外檢測法(HPLC-UV)[4,6-7,9,11]、高效液相-熒光檢測法(HPLC-Flu)[1,3,5,8,10]。為適應(yīng)臨床藥代動力學(xué)研究的需要,本實驗室研究并建立了用反相高效液相梯度洗脫法測定人血漿中丙泊酚濃度的方法。另外,分析各民族患者的藥代動力學(xué)特點,以期為新疆多民族地區(qū)的臨床安全用藥提供依據(jù)。本研究中95例丙泊酚誘導(dǎo)麻醉手術(shù)患者,包括54例漢族、32例維吾爾族、9例哈薩克族人種,稀疏采樣,每例患者3個采血時間點。經(jīng)證明,本方法具有較高的精密度和準(zhǔn)確度,已成功應(yīng)用于幾百份血漿樣品的測定。

        1 儀器與試藥

        1.1儀器

        LC-6AD液相色譜儀(北京超越未來科技發(fā)展有限公司);ER-128A電子分析天平(A&D Deompany,TLD,JAPAN);超聲波清洗儀(500 W,40 kHz,昆山市超聲儀器有限公司);IKA MS3基本型圓周震蕩搖床(廣州儀科實驗室技術(shù)有限公司);TDL-5A菲恰爾離心機(jī)(上海菲恰爾分析儀器有限公司);HGC-12A干浴氮氣吹干儀(天津市恒奧科技發(fā)展有限公司);pH計[梅特勒一托利多儀器(上海)有限公司]。

        1.2藥品與試劑

        丙泊酚標(biāo)準(zhǔn)品(中國食品藥品檢定研究院提供,批號:100806-200801,ID:4H01-51DP,純度99.8%);卡馬西平片(上海中西三維藥業(yè)有限公司);乙腈(色譜純,Sigma公司);甲醇(色譜純,Sigma公司);實驗用水為屈臣氏蒸餾水;磷酸二氫鉀(分析純,天津市福晨化學(xué)試劑廠);氫氧化四甲基胺(TMAH,10%,分析純,天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所);異丙醇(分析純,天津市富宇精細(xì)化工有限公司);環(huán)己烷(分析純,天津市富宇精細(xì)化工有限公司);正丁醇(分析純,天津市富宇精細(xì)化工有限公司);三氟乙酸(分析純,天津市福晨化學(xué)試劑廠)。血樣來自于新疆醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院。

        2 方法與結(jié)果

        2.1色譜條件

        色譜柱:Hanbon Science & Technology C18(4.6 mm×250 mm,5 μm);流動相:流動相為乙腈/甲醇混合液-水,其中乙腈-甲醇按80∶20(V/V)的比例配制,作為有機(jī)相,水相加1%的三氟乙酸調(diào)pH值到4,進(jìn)行二元梯度洗脫,0~7 min(50∶50,V/V),7~9 min(50∶50~70∶30,V/V),9~22 min(70∶30,V/V);流速:1.0 mL/min;檢測波長:272 nm;進(jìn)樣量:20 μL;柱溫:40℃。

        2.2溶液配制

        2.2.1 丙泊酚標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制 用移液槍精密量取丙泊酚標(biāo)準(zhǔn)品25 μL于50 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,即得到500.00 μg/mL丙泊酚標(biāo)準(zhǔn)儲備液。密閉后,于4℃冰箱保存。

        2.2.2 丙泊酚系列標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 用移液管精密量取500.00 μg/mL的丙泊酚標(biāo)準(zhǔn)儲備液12.5 mL于50 mL容量瓶中,用甲醇定容至刻度,得到濃度為250.00 μg/mL的丙泊酚甲醇溶液。依次逐級稀釋,最后得到500.00、250.00、125.00、62.50、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

        2.2.3內(nèi)標(biāo)液的配制 取卡馬西平片劑20片,精密稱定,研細(xì)。精密稱取細(xì)粉25 mg置100 mL容量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,濾過,棄去初濾液,精密量取續(xù)濾液5 mL置于25 mL容量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻即得。

        2.2.4磷酸鹽緩沖液的配制 稱量磷酸二氫鉀1.36 g溶于100 mL蒸餾水中,配制成0.1 mol/L溶液。

        2.2.5 TMAH的配制 用移液管精密量取10%(W/W)TMHA溶液4.7 mL于25 mL容量瓶中,用異丙醇稀釋至刻度。

        2.3樣品處理方法

        得到的空白全血或含藥全血于3000 r/min低速離心10 min,取上層液即血漿于EP管中。取空白血漿或含藥血漿1.00 mL于10 mL連蓋離心管中,分別準(zhǔn)確加入50 μL內(nèi)標(biāo)物、1 mL 0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液,5 mL環(huán)己烷∶正丁醇(95∶5)的混合有機(jī)溶液。渦旋振蕩2 min,于4000 r/min低速離心5 min,取上層有機(jī)相約4.5 mL移至另一離心管中,精密加入TMAH稀釋液50 μL,渦旋振蕩2 min,40℃氮氣流吹干。精密加入100 μL乙腈溶解殘余物,渦旋振蕩5 min。復(fù)溶后,吸取混合液過0.22 μm的濾膜后,精密吸取20 μL,進(jìn)樣分析。

        2.4專屬性試驗

        在本實驗條件下,空白血漿、標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)液、空白血漿加入標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)液、麻醉手術(shù)患者血漿樣品,經(jīng)HPLC測定,得到色譜圖(圖1)。由圖1可知,血漿中內(nèi)源性物質(zhì)不干擾丙泊酚及內(nèi)標(biāo)的測定,本方法具有較高的專屬性。內(nèi)標(biāo)物和標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時間分別為6.2 min和20.8 min。

        2.5標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

        在10 mL的連蓋離心管中分別加入950 μL空白血漿,再加入丙泊酚系列濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μL,使血藥濃度相當(dāng)于25.00、12.50、6.25、3.13、1.56、0.78、0.39、0.20、0.098 μg/mL。按“2.3”項下方法操作,以丙泊酚峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值X為橫坐標(biāo),丙泊酚的血藥濃度C為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,求得回歸方程為C=1.5975X-0.0294(r = 0.9998)。提示丙泊酚的血藥濃度在0.098~25 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積有良好的線性關(guān)系。丙泊酚的定量下限為0.098 μg/mL(S/N=3)。

        2.6精密度及回收率試驗

        在950 μL空白血漿中分別加入低、中、高3種濃度的丙泊酚標(biāo)準(zhǔn)溶液50 μL,使其濃度分別為0.20、1.56、12.50 μg/mL,每種濃度6份,按“2.3”項下方法操作,將丙泊酚峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比X代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算丙泊酚血藥濃度,以測得值與加入值之比計算方法回收率。以1 d內(nèi)測得的丙泊酚血藥濃度計算日內(nèi)精密度,以連續(xù)測定3 d,每天1次測得的丙泊酚濃度計算日間精密度。結(jié)果見表1。

        2.7 血藥濃度測定方法的應(yīng)用

        收集新疆醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院麻醉科于2014年3月~2014年7月美國麻醉師協(xié)會(ASA)評級為Ⅰ~Ⅱ級的擇期手術(shù)患者95例,按民族不同分成三組,漢族組54例,男21例,女33例;年齡21~73歲,平均(50.4±2.3)歲;體重48~85 kg,平均(63.5±8.0)kg。維吾爾族組32例,男6例,女26例;年齡36~61歲,平均(49.6±10.3)歲;體重53~81 kg,平均(65.8±12.5)kg。哈薩克族9例,男3例,女6例;年齡28~64歲,平均(48.6±9.8)歲;體重50~89 kg,平均(65.9±10.7)kg。所有患者術(shù)前肝、腎功能均基本正常。所有患者均于術(shù)前30 min靜脈注射哌替啶50 mg、氟哌利多2.5 mg、咪達(dá)唑侖2 mg、東莨菪堿0.3 mg。入手術(shù)室后開放下肢靜脈,靜脈注入芬太尼3~4 μg/kg、維庫溴銨0.1 mg/kg、丙泊酚2 mg/kg(于30 s內(nèi)推入)。分別于給藥后0、1.5、2、2.5、3、3.5、4、5、6、8、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、120、 150、180 min隨機(jī)選擇3個時間點,用肝素鈉于橈動脈取血3 mL,3000 r/min,離心10 min,取上層血漿于EP管中。取血漿1000 μL供HPLC分析,測定所得濃度作圖,結(jié)果見圖2。

        3 討論

        3.1 內(nèi)標(biāo)的選擇

        文獻(xiàn)報道多采用麝香草酚藍(lán)[2-5,9-10]為內(nèi)標(biāo)物,偶見2,4-二叔丁基苯酚[1]、卡馬西平[6]、乙基罌粟堿[11]做內(nèi)標(biāo)。本實驗最初選取麝香草酚藍(lán)作為內(nèi)標(biāo),但是調(diào)整流動相比例、更換流動相等色譜條件不能實現(xiàn)同時將內(nèi)標(biāo)物、丙泊酚、血漿中的內(nèi)源性基質(zhì)分離的目的。經(jīng)過嘗試,最終選取卡馬西平作為內(nèi)標(biāo)。

        3.2流動相的選擇

        文獻(xiàn)報道的流動相組成有乙腈-水(69∶31,pH=4.0)[1]、乙腈-0.01 mol/L磷酸二氫鉀水溶液(70∶30,磷酸調(diào)pH值到4)[2]、乙腈-水(65∶35)[3]、甲醇-水(75∶25)[7]、乙腈-水(70∶30,其中水相加1%的三氟乙酸調(diào)pH值到4)[9]、甲醇-水(80∶20)[10]等。經(jīng)過嘗試,最終確定流動相為乙腈/甲醇混合液-水,其中乙腈-甲醇按80∶20(V/V)的比例配制,作為有機(jī)相,水相加1%的三氟乙酸調(diào)pH值到4。此外,文獻(xiàn)報道的均為等度洗脫,然而在本實驗室條件下等度洗脫時,有機(jī)相比例較高(超過50%)時,血漿中的內(nèi)源性基質(zhì)和內(nèi)標(biāo)集中在前5 min出峰,不能將內(nèi)標(biāo)物與血漿中的內(nèi)源性基質(zhì)分開;降低有機(jī)相比例能實現(xiàn)將同時將內(nèi)標(biāo)物、丙泊酚、血漿中的內(nèi)源性基質(zhì)分離的目的,然而此時丙泊酚出峰時間太長(超過30 min)。因此最終決定采用進(jìn)行二元梯度洗脫,0~7 min(50∶50,V/V),7~9 min(50∶50~70∶30,V/V),9~22 min(30∶30,V/V),在低濃度條件下也可獲得較好的洗脫效果,內(nèi)標(biāo)和藥物出峰時間合理,色譜峰形理想。這是文獻(xiàn)中首次出現(xiàn)梯度洗脫法測定血漿中的丙泊酚濃度。本方法簡便、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好,靈敏度也可以滿足丙泊酚臨床血藥濃度監(jiān)測的需要,為群體藥動學(xué)的研究奠定基礎(chǔ)。

        3.3 檢測方法的選擇

        丙泊酚血藥濃度的測定方法已有廣泛的文獻(xiàn)報道。雖然HPLC-MS/MS有較高的靈敏度、較好的特異性,但是儀器普及程度不夠,難以在基層醫(yī)院推廣。HPLC-UV方法具有較高的普及性,但是由于紫外檢測器的特性,往往難以將雜質(zhì)峰和丙泊酚色譜峰進(jìn)行有效分離。在選用價格相對低廉的國產(chǎn)色譜柱的前提下,筆者開發(fā)的丙泊酚血濃檢測方法能夠?qū)㈦s質(zhì)峰和待測樣品峰做到基線分離,對于基層醫(yī)院應(yīng)用具有較大的借鑒意義。

        3.4藥動學(xué)分析

        據(jù)文獻(xiàn)報道,種族是影響丙泊酚藥物代謝的重要因素[14-15],但迄今為止,維吾爾族、哈薩克族人種的丙泊酚的藥動學(xué)研究還沒有完整的資料。本研究納入了95例丙泊酚誘導(dǎo)麻醉手術(shù)患者,包括54例漢族、32例維吾爾族、9例哈薩克族人種,采用稀疏采樣在不同時間點共獲取了285個濃度數(shù)據(jù)。將各個民族的數(shù)據(jù)按時間點匯總,繪制藥時曲線數(shù)據(jù),簡單比較藥時曲線的趨勢和曲線下面積。進(jìn)一步的群體藥代動力學(xué)數(shù)據(jù)分析將在后續(xù)的論文中報道。

        [參考文獻(xiàn)]

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        (收稿日期:2014-09-05 本文編輯:衛(wèi) 軻)

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        (收稿日期:2014-09-05 本文編輯:衛(wèi) 軻)

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