王學(xué)清+石少輕+吳占軍+李魁英+倪俊卿+裴翠娟+張峰+王昆+馬書林

摘要：為研究二氫吡啶抗奶牛熱應(yīng)激的作用機理，以20頭中國荷斯坦牛為材料，分別飼喂含0、100、150、200 mg/kg的二氫吡啶日糧，利用實時定量（qRT-PCR）技術(shù)對其外周血淋巴細胞HSP70基因mRNA的相對表達量進行檢測。結(jié)果表明，日糧中添加二氫吡啶在高溫熱應(yīng)激期可以顯著提高中國荷斯坦牛HSP70的表達量，其中日糧中添加200 mg/kg組表達量最高，顯著高于對照組和100 /mg/kg添加組（P<0.01）。

關(guān)鍵詞：HSP70基因； 二氫吡啶；實時定量RT-PCR

中圖分類號：S816.79 文獻標識碼：A 文章編號：1007-273X（2014）10-0021-03

二氫吡啶（Diludin，2，6-二甲基-3，5-二乙基-1，4-二氫吡啶）是一種具有天然抗氧化劑維生素E的部分作用的新型多功能添加劑，具有抗氧化、提高血清SOD的活性、改變血清中激素水平等作用[1-5]。另外，孫燕燕等[6]通過二氫吡啶對小鼠熱應(yīng)激的影響研究表明，二氫吡啶在緩解小鼠熱應(yīng)激引起的生理損傷方面有一定的作用。張峰等[7]通過在奶牛日糧中添加二氫吡啶研究表明，二氫吡啶可以緩解夏季奶牛熱應(yīng)激對生產(chǎn)性能等指標造成的影響。

奶牛熱應(yīng)激是指奶牛受到超過自身體溫調(diào)節(jié)能力的過高溫度刺激時，引起機體產(chǎn)生的非特異性應(yīng)答反應(yīng)，是導(dǎo)致奶牛夏季產(chǎn)奶性能、繁殖性能、免疫能力下降、造成奶牛死亡的主要原因之一[8-10]。熱應(yīng)激與一類具有重要生理功能和高度保守的多肽類蛋白質(zhì)熱應(yīng)激蛋白（Heat shock protein，HSP）有關(guān)，該類蛋白最初在熱處理果蠅中首次發(fā)現(xiàn)[11]。研究表明[7]HSPs在熱耐受形成過程中維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定具有重要作用[12]；Gabrief等[13]在對肉雞的熱應(yīng)激中發(fā)現(xiàn)HSP70 mRNA表達量在35 ℃3 h達到最高值；有研究者在給處于熱應(yīng)激的大鼠口服中藥制劑后發(fā)現(xiàn)添加中藥制劑后可以調(diào)節(jié)應(yīng)激大鼠后胃黏膜組織中的HSP70的表達[14]。

因此，利用實時定量PCR技術(shù)研究不同溫度條件下飼料中添加不同劑量二氫吡啶對奶牛血液中HSP70基因表達的影響，以初步探討二氫吡啶抗熱應(yīng)激的作用機理。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選擇處于相同胎次，相同泌乳階段的健康奶牛20頭，隨機分為4組，每組5頭。

采樣時間：根據(jù)日平均氣溫指數(shù)（THI）為85（高溫期）、71.3（臨界高溫期）和58.2（適溫期）時分別頸靜脈采集全血10 mL于EDTA抗凝采血管中，置于冰盒中帶回實驗室。

THI計算公式：THI=（1.8×Ta+32）-（0.55-0.55×RH）×（1.8×Ta-26） ，其中Ta為環(huán)境溫度，RH為相對濕度[15]。

1.2 飼喂方法

預(yù)飼期：10～15 d，正飼期：3個月。

飼喂：奶牛采取舍飼半拴系飼養(yǎng)，全混合日糧進行飼喂，將二氫吡啶與0.4 kg 精料補充料混勻后分3 次單獨添加進行飼喂，每天喂料結(jié)束后散放到運動場自由運動，飲水槽保證足夠清潔的飲水。試驗期內(nèi)固定專人負責奶牛飼喂、奶牛管理、采樣并記錄THI數(shù)據(jù)。

各試驗組二氫吡啶添加量：對照組、試驗組1、試驗組2、試驗組3分別為0mg、100mg、150mg、200 mg/kg。

1.3 主要試劑與儀器

血液總RNA快速提取試劑盒；2×SYBR premix EXTaq TM；實時定量PCR儀。

1.4 血液總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

血液總RNA提?。翰捎蒙虾Ｉぱ嚎俁NA快速提取試劑盒進行總RNA提取，提取后進行純度檢測。每個試驗個體RNA單獨反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為10 μL，其中總RNA 6.5uL、PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5 μL、5×PrimeScript Buffer 2 μL、Random primers（引物）0.5μL、Oligo dT Primer（引物）0.5 μL。

1.5 實時定量引物設(shè)計

為避免基因組DNA污染干擾，根據(jù)跨內(nèi)含子原則進行引物設(shè)計。設(shè)計合成HSP70引物序列為：上游5′- GGAAACCACCCGTTAGTGC - 3′；下游5′- CTGCCAATCCAACAACCTCTT- 3′。內(nèi)參基因為β-Actin，引物序列為：上游5′- GTCACCAACTGGGAC GACA -3′；下游5'-AGGCGTACAGGTGACAGCA -3'，引物由上海生工合成。

1.6 實時定量分析

采用SYBR Green I熒光染料法進行實時定量RT-PCR擴增的檢測。PCR反應(yīng)體系為20 μL，其中2×SYBR premix EX TaqTM 10 μL、上下游引物各0.4 μL（10 μmol/L）、cDNA 2 μL、ddH2O 7.2 μL。在實時定量PCR儀中同時進行HSP70和β-Actin的PCR反應(yīng)，擴增條件為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性10 s；61 ℃退火15s；72 ℃延伸10 s；45個循環(huán)后；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)過程中以高純水替代cDNA作為陰性對照。

HSP70 mRNA相對表達量采用2-ΔCT進行計算[16]，ΔCT= CTHSP70- CTβ-Actin。

1.7 PCR擴增產(chǎn)物特異性檢驗

通過分析熔解曲線和取5 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳（100 v，15 min）確定擴增產(chǎn)物片段大小，進而確定PCR產(chǎn)物是否為目標片段。

1.8 統(tǒng)計分析

利用Prism 5軟件進行單因子方差分析比較不同溫度時期，同一處理組；相同溫度時期，不同處理組組間的HSP70的相對表達豐度。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR產(chǎn)物特異性

擴增曲線表明擴增效果良好，且R2≥0.98。經(jīng)熔解曲線分析，HSP70（圖1）和β-Actin（圖2）分別在89 ℃和88.5 ℃出現(xiàn)單一產(chǎn)物峰，均與引物設(shè)計后預(yù)期產(chǎn)物Tm值相同。

擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，HSP70 和β-Actin組均出現(xiàn)與目的片段大小吻合的片段，陰性對照無擴增條帶。表明PCR產(chǎn)物分別為HSP70和β-Actin目的基因產(chǎn)物（圖3）。

圖1 HSP70的擴增效率曲線

圖2 β-Actin的擴增效率曲線

2.2 不同溫度時期定量分析

對照組、試驗組HSP70表達量均隨溫度的升高而增加，其中試驗組3在高溫期表達量最高，4個分組在適溫期HSP70的基因表達水平遠低于高溫期，說明HSP70基因在奶牛熱應(yīng)激過程中參與了其分子水平的調(diào)控（圖4）。

2.3 不同處理組間定量結(jié)果分析

適溫期、臨界高溫期HSP70基因表達水平在各組間差異不顯著。高溫期HSP70基因表達水平，試驗組1、對照組與試驗組3差異極顯著（P<0.01），試驗組2與對照組差異顯著（P<0.05），其他各組間差異不顯著（圖4），說明在日糧中添加200 mg/kg二氫吡啶可以顯著提高奶牛HSP70的表達量，從而緩解奶牛熱應(yīng)激反應(yīng)。

3 小結(jié)與討論

對于血液樣品來說，存在起始材料數(shù)量、提取RNA效率、反轉(zhuǎn)錄效率、目的基因擴增效率不一致的情況，因此本研究選用實時熒光定量RT-PCR分析的相對定量方法，通過設(shè)定內(nèi)參基因β-Actin校正差異，從而獲得HSP70基因表達的相對變化。

熱應(yīng)激蛋白按其分子量大小分為HSP110、HSP100、HSP90、HSP70、HSP60、小分子HSPS及泛素，其中最重要的是HSP70[17]。研究發(fā)現(xiàn)HSP70與環(huán)境溫濕度變化密切相關(guān)，在奶牛熱耐受中起著主要作用[18，19]，大量研究表明，HSP70是機體接觸高溫或其他刺激時表達最強的一種熱應(yīng)激蛋白[20，21]。本試驗表明，中國荷斯坦牛由適溫期逐漸轉(zhuǎn)向高溫期的過程中，血液淋巴細胞均可表達HSP70，并且隨著熱應(yīng)激程度的提高HSP70的表達量增加，這與Mosser DD等的研究結(jié)果一致[22，23]。同時本研究發(fā)現(xiàn)，在奶牛日糧中添加二氫吡啶，可以提高HSP70 mRNA水平的表達量，其中添加200 mg/kg日糧組提升效果最明顯，這可能與二氫吡啶的抗氧化功能有關(guān)，可以與胞色素P-450結(jié)合形成復(fù)合體，從而抑制NADPH-細胞色素C還原酶的活性，隔斷微粒體電子輸送NADPH酶的活性，抑制脂類化合物的過氧化，清除自由基，對生物膜起到抗氧化和保護作用，同時提高生物膜中6-磷酸葡萄糖酶的活性，穩(wěn)定生物細胞組織，促進動物新陳代謝[24，25]，從而提高HSP70的表達量，提高中國荷斯坦牛的抗熱應(yīng)激能力。

本研究初步證明二氫吡啶對HSP70具有表達調(diào)控作用，為我們進一步開展二氫吡啶抗奶牛熱應(yīng)激機理奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1] 鄒曉庭，許梓榮，馬玉龍，等.二氫對產(chǎn)蛋雞的作用效果及機理研究[J].浙江農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1998 ，24 （3） ： 297 - 302.

[2] ZHENG XZ， LI Kl，HUANG Y. Effects of diludin and Vitamin E on production of cows[J]. ACTA Zoonutrimenta Sinica. 1998，10（1）：60-63.

[3] 李玉榮，武現(xiàn)軍，霍書英，等.二氫吡啶對尼羅羅非魚生產(chǎn)性能及機體抗氧化性能的影響.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2003，26（3）：11-15.

[4] 武現(xiàn)軍，李成會，龐新位，等.二氫吡啶對雛雞免疫功能的影響[J].中國獸醫(yī)學(xué)報，2000，20（4）：387-389.

[5] 李成會，朱蓮英，龐新位.二氫吡啶對生長階段豬生長性能的影響研究[J].中國畜牧獸醫(yī)，2007，34（4）：22-24.

[6] 孫燕燕，許潔冰，李 晴.二氫吡啶對熱應(yīng)激小鼠的影響[J].畜牧與飼料科學(xué)，2006（1）：25-27.

[7] 張 峰，王 昆，王學(xué)清，等.二氫吡啶對熱應(yīng)激奶牛產(chǎn)奶量以及奶牛體溫、呼吸頻率的影響[J].華北農(nóng)學(xué)報，2010，25，（增刊）：270-273.

[8] PREEZ J H， HATTTINGH P J， GICESE CKE WH.Eisenberg BE. Heat stress in dairy cattle and other livestock under southern African conditions. III. Monthly tempera-ture-humidity index mean values and their significance in the performance of dairy cattle[J}. Onderstepoort J Vet， 1990，57（4）： 243-248.

[9] JORDANER.Effects of Heat Stress on Reproduction[J].JDairy Sci.2003，86（S）：E104–E114.

[10] VALTORTA S E， GALLARDO M R. Evaporative cooling for Hol-stein dairy cows under grazing conditions[J]. Int J Biomete-orol， 2004， 48（4）： 213-217.