李立方，蘇銀玲，任學(xué)群

(河南大學(xué) 淮河醫(yī)院，河南 開封 475004)

胰腺癌是較常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，該疾病的早期診斷十分困難，多數(shù)新發(fā)病例已存在周圍器官侵犯和/或遠處轉(zhuǎn)移，手術(shù)切除率不到30%，5年生存率低于5%［1］.胰腺癌的發(fā)病率仍呈逐年上升趨勢，2009年美國在因腫瘤致死疾患中居第4位［2］.姜黃素是從姜科植物姜黃的地下根莖中提取的一種多酚類色素，是一類具有多種生物學(xué)效應(yīng)的天然活性物質(zhì)，其藥理作用廣泛，能夠抗炎、抗氧化、抗誘變、降血脂及抗動脈粥樣硬化.近年來，國內(nèi)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)姜黃素能夠同時參與多重抗腫瘤生長增殖的途徑，影響腫瘤發(fā)生發(fā)展的多個環(huán)節(jié)與步驟，具有直接和間接的抗腫瘤作用［3－6］.本研究以不同濃度姜黃素作用于人胰腺癌細胞SW1990，觀察其對SW1990 細胞生長、增殖、凋亡及對Wnt 信號傳導(dǎo)通路中核心蛋白β－catenin 水平和下游相關(guān)靶基因c－myc、VEGF、cyclinD1 表達的影響.

1 材料與方法

1.1 材料

人胰腺癌SW1990 細胞株(中國科學(xué)院上海生物研究所細胞庫)，姜黃素純度＞98%(國家標(biāo)準物質(zhì)網(wǎng)－北京世紀奧科生物技術(shù)有限公司)，用二甲基亞砜(DMSO)培養(yǎng)基稀釋成5mmol/L，等量分裝，－20℃保存.MTT 試劑盒購自Sigma 公司，Annexin V－FITC 凋亡檢測試劑盒由貝博試劑提供.RPMI1640 培養(yǎng)基，胎牛血清為Biowest 產(chǎn)品.β－catenin 抗體為Cell－Based Cell signaling technology 公司產(chǎn)品.PCR 相關(guān)試劑由天根生化科技(北京)有限公司提供.酶標(biāo)儀(F200)為瑞士Tecan 公司產(chǎn)品，流式細胞儀(Accuri C6)為 美國BD 公司產(chǎn)品，凝膠成像系統(tǒng)及PCR 儀購自美國Bio－rad 公司，WB 等相關(guān)設(shè)備購自上海天能科技有限公司.

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

SW1990 細胞培養(yǎng)于含100 mL/L 胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基，在37 ℃、CO2濃度為50 mL/L 的 二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每48 h 換液傳代1 次.

1.2.2 四甲基偶氮唑藍(MTT)比色試驗

設(shè)對照組和加用姜黃素組(20 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L、80 μmol/L、100 μmol/L 姜黃素)，取對數(shù)生長期細胞，常規(guī)胰酶消化后用含100 mL/L 胎牛血清RPMI1640 培養(yǎng)液制成單細胞懸液，接種于96 孔培養(yǎng)板，每孔100 μL(含約5×103個細胞)，待細胞貼壁后去培養(yǎng)液并加藥，同時取等量的DMSO 作為對照組，每組設(shè)6 個復(fù)孔，另設(shè)6 個調(diào)零孔(不加細胞，只加100 μL 培養(yǎng)液)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h.棄上清，每孔加入含MTT 10 μL 的培養(yǎng)液100 uL，4 h 后終止培養(yǎng)，棄上清液，每孔加入150 μL 的DMSO，置水平搖床上震蕩10 min，以凋零空調(diào)零，在酶標(biāo)儀(Tecan F200)上測492 nm 波長的吸光度(OD)值，計算各組藥物濃度的抑制率及半抑制濃度(IC50)，試驗重復(fù)3 次并取平均值.

1.2.3 流式細胞儀檢測姜黃素誘導(dǎo)SW1990 細胞凋亡

取對數(shù)生長期細胞，常規(guī)胰酶消化后用含100 mL/L 胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)液制成單細胞懸液，計數(shù)后種于六孔板中，每孔約含2* 105個細胞，待細胞貼壁后去培養(yǎng)液并加藥，分別加入2 mL 含有0、20 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L、80 μmol/L、100 μmol/L 姜黃素的培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h 后，用不含EDTA 的胰酶消化離心收集細胞，用冷的PBS 洗滌細胞兩次.然后用400 μL 1X Annexin V 結(jié)合液懸浮細胞，在細胞懸液中加入5 μL Annexin V－FITC 染色液，輕輕混勻后避光孵育15 min，后加入10 μL PI 染色液避光孵育5 min，在1 h 內(nèi)用流式細胞儀(Accuri C6)檢測.

1.2.4 免疫印跡法(Western blot)檢測核心蛋白β－catenin 的表達

取對數(shù)生長期的人胰腺癌細胞SW1990，以5×105個/mL 的密度接種于培養(yǎng)瓶中培養(yǎng).分別以加入0 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L、80 μmol/L、100 μmol/L 姜黃素的培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h 后按胞漿蛋白提取試劑盒說明方法裂解細胞膜，收集胞漿蛋白.然后各組取等質(zhì)量胞漿蛋白上樣，采用5%的濃縮膠，8%分離膠進行SDS－PAGE 電泳，轉(zhuǎn)膜，洗膜5 次，每次3 min，加入封閉液并封閉1 h.加入新鮮配制的1∶1000 稀釋兔抗β－catenin 及β－actin 單克隆抗體，4 ℃孵育過夜.洗滌液洗膜3 min×3 次，加入相應(yīng)二抗1∶1500 稀釋(辣根過氧化物酶標(biāo)記馬抗兔IgG 抗體)，37 ℃平緩搖動1 h.用ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒中的A、B 液等量混勻灑在膜上，放入X 光片盒中進暗室曝光.用Image J 圖像分析軟件進行分析.

1.2.5 半定量RT－PCR 檢測不同濃度姜黃素對胰腺癌SW1990 細胞中c－myc、VEGF、cyclinD1 mRNA 的影響

提取總RNA，并合成cDNA 第一條鏈，總反應(yīng)體系25 μL.各條引物序列如下c－myc:5'－CCAGGACTGTATGTGGAGCG－3'，5'－CCTGAGGACCAGTGGGCTGT－3';VEGF:5'－GCAGAATCATCACGAAGTGGT－3'，5'－CATTTGTTGTGCTGTAGGAAGC－3;cyclinD1:5'－ATCTACACCGACAACTCCATCC－3'，5'－GCATTTTGGAGAGGAAGTGTTC－3';β－actin:5'－AGAGCTACGAGCTGCCTGCTG－3'，5'－AGTACTTGCGCTCAGGAGGA－3'.

上述引物均由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成.將PCR 產(chǎn)物用2%濃度的瓊脂糖進行凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)上觀察電泳帶及其位置，攝影，Image J 軟件將圖像轉(zhuǎn)換成灰度值.對各條帶灰度值與β－actin 條帶灰度值的比值進行分析.

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS13.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理，所有計量資料均用均數(shù)±標(biāo)準差(珋±s)表示，組間比較采用單因素方差分析(One－way ANOVA)，相關(guān)性檢驗采用Pearson 相關(guān)分析，P≤0.05 差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 MTT 法檢測姜黃素對SW1990 細胞增殖的影響

按下列公式計算生長抑制率:生長抑制率(IR%)=(1－加藥組平均A 值/對照組A 值)×100%，經(jīng)不同濃度的姜黃素處理48 h 后，SW1990 細胞生長受到不同程度的抑制，隨藥物濃度的增大，抑制率逐漸增高，呈現(xiàn)劑量依賴性關(guān)系(r=0.96，P＜0.05).各濃度組細胞增殖抑制率與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，各濃度組間比較亦有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，圖1).經(jīng)計算得出IC50=56.74 μmol/L.

2.2 流式細胞儀測姜黃素對SW1990 細胞凋亡的影響

圖1 不同濃度姜黃素作用于胰腺癌細胞SW1990 48h 后的生長抑制率曲線

SW1990 細胞在培養(yǎng)瓶中貼壁生長，呈多角形，在姜黃素作用下，它們生長速度減慢，形態(tài)發(fā)生改變，部分細胞變圓，脫壁.用0、20 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L、80 μmol/L、100 μmol/L 姜黃素 處理作用48 h 后，其凋亡率分別為8.1%、11.7%、16.3%、28.1%、37.5%、56.8%，呈現(xiàn)濃度依賴性(r=0.96，P＜0.05).各濃度組細胞凋亡率與空白對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，各濃度組間比較亦有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，圖2).

圖2 不同濃度姜黃素對胰腺癌SW1990 細胞凋亡率的影響

2.3 免疫印跡法(Western blot)檢測姜黃素對SW1990 細胞核心蛋白β－catenin 的表達水平的影響

經(jīng)0、20 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L、80 μmol/L、100 μmol/L 姜黃素作用48 h 后的實驗組細胞，胞漿β－catenin 蛋白含量低于空白對照組(見圖3).在SW1990 細胞中，除20 μmol/L 濃度組外，其他濃度組與空白對照組比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05).藥物濃度越大，胞漿β－catenin 蛋白含量越少，呈劑量依賴性(r=－0.96，P＜0.05).

圖3 姜黃素對SW1990 細胞內(nèi)β－catenin 蛋白表達水平的影響.(con 為對照組)

2.4 半定量RT－PCR 檢測姜黃素對Wnt/β－catenin 信號通路下游靶基因mRNA 表達水平的影響

經(jīng)0、20 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L、80 μmol/L、100 μmol/L 姜黃素作用后的SW1990 細胞，c－myc、VEGF、cyclinD1 mRNA 表達量較空白對照組均減少，且呈劑量依賴性(r=－0.99，－0.92，－0.93，P＜0.05).在SW1990 細胞中，c－myc mRNA 的表達在濃度為20 μmol/L 時與空白對照組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，其余濃度組與空白對照組比較、其余濃度組之間比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);VEGF mRNA 的表達，20 μmol/L 組與空白對照組、40 μmol/L 組進行比較無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，其余濃度組與空白對照組、其余濃度組之間比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05).cyclinD1 mRNA 的表達，各濃度組與空白對照組、其余濃度組之間比較均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，圖4).

3 討論

圖4 姜黃素對Wnt 靶基因mRNA 表達水平的影響.(M 為DNA Marker，con 為對照組)

Wnt/β－catenin 信號通路是常見且研究得較為透徹的Wnt 通路，又稱為經(jīng)典通路［7］.正常情況下當(dāng)該信號通路未被激活時，胞質(zhì)的β－catenin 與APC、軸蛋白(axin)、GSK－3β 結(jié)合經(jīng)酪蛋白激酶(CK)1α 和GSK－3β 磷酸化，并經(jīng)泛素化降解，以維持胞質(zhì)低水平的游離β－catenin.Wnt 信號通路異常激活時，Wnt 與細胞膜受體卷曲蛋白(Fz)、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LRP)5/6 結(jié)合形成受體復(fù)合體，通過Fz 將信號轉(zhuǎn)導(dǎo)至胞質(zhì)散亂蛋白(Dsh)，后者通過抑制GSK－3β 以阻止β－catenin 的磷酸化降解，致胞質(zhì)β－catenin 聚集并轉(zhuǎn)運至細胞核，并形成轉(zhuǎn)錄活性復(fù)合體，啟動下游靶基因如原癌基因c－myc、cyclinD1、VEGF 等的轉(zhuǎn)錄，致細胞過度增殖，由此參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展［8－10］.

姜黃素(curcumin，Cur)來源于食品，具有價廉，毒性低，抗癌譜廣、不良反應(yīng)小等優(yōu)點，最近被腫瘤學(xué)家們認為是一種潛在的第3 代抗癌化療藥物［11，12］.姜黃素抗癌作用的機制是多方面的，其中誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡可見于多種腫瘤的研究中，但其誘導(dǎo)機制仍不是很清楚，關(guān)于姜黃素對經(jīng)典Wnt 信號通路活性的調(diào)控作用的報道甚少.我們的研究結(jié)果說明，姜黃素能有效抑制人胰腺癌細胞株SW1990 的增殖，細胞增殖活力隨姜黃素藥物濃度增大而不斷下降，其抑制作用程度呈劑量依賴性.既往實驗發(fā)現(xiàn)，姜黃素能夠通過激活過氧化物酶增殖體激活受體γ(PPARγ)和增強BTG2 mRNA 的表達而下調(diào)CyclinD1(CyclinD1 在多種腫瘤細胞中過量表達，能夠介導(dǎo)細胞從G1 期向S 期過渡［13］)從而抑制腫瘤細胞生長［14，15］.除影響腫瘤細胞周期外，姜黃素還可能通過降低腫瘤細胞的抗凋亡蛋白(如c－myc、bcl－2、bcl－xl 等)水平和提高凋亡蛋白(Fas)水平從而誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡［16，17］.除此之外，姜黃素能夠抑制腫瘤細胞EGFR 的表達、促進Caspase－3 的活化等抑制腫瘤細胞的存活與生長，誘導(dǎo)其凋亡［18，19］.本研究中，PCR 實驗結(jié)果表明姜黃素可以下調(diào)人胰腺癌細胞SW1990 中c－myc、VEGF、cyclinD1 mRNA 的表達.但Wnt 途徑肯定不是姜黃素抑制效應(yīng)的主要或者唯一途徑，還需一系列的實驗來進一步的研究.

總之，惡性腫瘤是嚴重危害人類健康的疾病之一，其發(fā)生、發(fā)展是一個多因素作用、多基因參與和多階段經(jīng)歷才最終形成的極其復(fù)雜的生物學(xué)過程，但目前尚無非常理想的抗腫瘤藥物.雖然原有藥物不斷改進發(fā)展，新藥不斷開發(fā)問世，但其療效、安全性等仍未能達到令人滿意的效果［20，21］.尋找新的抗腫瘤分子靶位、提高腫瘤治療的臨床療效等方面越來越受到關(guān)注，信號通路在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，故繼續(xù)進一步探究其各組分及相互作用機制，開發(fā)該通路特定靶點有效拮抗劑，無疑將對抗腫瘤藥物的發(fā)展產(chǎn)生巨大的影響，有望開拓腫瘤治療的一個新局面.

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