羅小虎 王 韌 王 莉 李永富 沈利楊 王 勇 陳正行

(江南大學食品學院食品科學與技術國家重點實驗室糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室，無錫 214122)

高效液相色譜快速測定玉米中黃曲霉毒素的研究

羅小虎 王 韌 王 莉 李永富 沈利楊 王 勇 陳正行

(江南大學食品學院食品科學與技術國家重點實驗室糧食發(fā)酵工藝與技術國家工程實驗室，無錫 214122)

黃曲霉毒素(AFT)主要是由真菌產(chǎn)生的具有嚴重毒性的化學結構類似的次級代謝產(chǎn)物，玉米極易受其污染。通過考察不同激發(fā)波長(λEx)和發(fā)射波長(λEm)、不同流動相組成，免疫親和柱(IAC)凈化與未經(jīng)凈化的樣品對AFT檢測結果的影響。結果表明，λEx為360 nm，λEm為440 nm，流動相組成為水-甲醇(65∶35)，玉米中AFT檢測分離效果最好；且未經(jīng)IAC凈化的樣品，雖有一些雜質(zhì)干擾檢測結果，但方法的線性范圍(0.04～26 ng)和檢出限(0.1 μg/kg)仍良好，方法加標回收率在81.7%～94.3%，標準偏差在3.6%～6.2%，日內(nèi)、日間精密度分別為4.5%～5.1%和4.8%～5.5%。該方法具有快速、準確、重現(xiàn)性好、穩(wěn)定性高、成本低的優(yōu)點，適合大批次污染AFT的玉米檢測。

高效液相色譜 黃曲霉毒素 玉米 免疫親和柱 檢測

黃曲霉毒素(Aflatoxin, AFT)主要是由黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生的一類具有嚴重毒性的次級代謝產(chǎn)物[1]。在已知的二十余種AFT中，最常見且毒性最強的有黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2(AFB1、AFB2、AFG1、AFG2)。由于熱帶和亞熱帶地區(qū)的溫度和濕度適宜各類產(chǎn)AFT的真菌生長，因此，上述地區(qū)的玉米、花生、小麥和其他農(nóng)產(chǎn)品極易受AFT污染[2-4]。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)估計，世界糧食作物每年被真菌毒素污染達25%，造成了極大的經(jīng)濟損失，這其中又以AFT危害最大[5]。

玉米是我國重要的食品原料之一，在一些地區(qū)，由于收獲、加工和儲藏不當，玉米相對其他原料，如花生、小麥和稻米等，更易被AFT污染[3, 6]。雖然不斷改進玉米干燥、儲藏和加工等措施，但目前大多數(shù)的加工條件下AFT仍很難被破壞[7-9]。由于AFT污染嚴重，且AFT污染后很難去除，因此，為了避免AFT污染超標的玉米被人和動物食用，良好的AFT檢測方法就變得至關重要。目前，AFT的檢測方法主要有薄層色譜(TLC)法[10]、酶聯(lián)免疫(ELISA)法[11-12]、液相色譜(HPLC)法[13-15]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)法[16-17]。上述方法中，HPLC法是目前應用最廣的檢測AFT方法，該方法具有準確度高、重現(xiàn)性好等優(yōu)點，但也存在樣品前處理復雜、操作繁瑣、檢測成本較高、不利于大批次樣品檢測等缺點，因此，該方法仍有待進一步改進。

由于玉米樣品基質(zhì)復雜，樣品中雜質(zhì)易干擾AFT的檢測，因此，通常樣品在檢測前，需經(jīng)免疫親和柱(IAC)[18]或固相萃取柱(SPE)[19]凈化，這樣造成檢測步驟增加、分析速度減慢、費時費力、且凈化柱成本較高，最終導致檢測成本增加。本研究通過考察不同激發(fā)波長(λEx)和發(fā)射波長(λEm)、不同流動相的組成對AFT的分離和檢測效果，比較玉米樣品經(jīng)IAC凈化與未經(jīng)凈化的樣品分離和檢測效果，以建立一種分析速度快、分離檢測效果好、準確度高、成本低的AFT定量分析方法，滿足大批次檢測AFT的需求。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原料與試劑

AFT污染與未污染的玉米：湖南岳陽市售；甲醇、乙腈(色譜純)：美國Fisher公司；AFB1、AFB2、AFG1、AFG2混標(純度≥99%)：美國Supelco公司；AflaClean IAC：德國Lctech公司。

1.1.2 儀器與設備

1260系列Agilent高效液相色譜儀(帶熒光檢測器)、ZOBRAX SB C18色譜柱：美國Agilent科技有限公司；DCY-12G型氮吹儀：青島?？苾x器股份有限公司；Simplicity UV型超純水儀：美國Millipore公司；BSA124S-CW分析天平：賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；SHZ-B型水浴恒溫振蕩器：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠。

1.2 試驗方法

1.2.1 AFT標準溶液的配制

將AFB1、AFB2、AFG1、AFG2混標液(濃度分別為1.007、0.286、1.071、0.330 μg/mL)60 ℃氮氣吹干，甲醇重新溶解并定容，儲備液-20 ℃儲藏。臨用前，取適量AFT標準儲備液，60 ℃氮氣吹干，流動相逐步稀釋配成以AFB1濃度為0.01、0.025、0.05、0.125、0.25、0.5、1.25、2.5 μg/mL的AFT標準工作液。

1.2.2 AFT檢測λEx和λEm的選擇

適當濃度的AFT混標經(jīng)高效液相色譜-熒光檢測器(HPLC-FLD)檢測，選擇不同的λEx(360、365 nm)和λEm(440、450、460 nm)，考察不同λEx和λEm下AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的峰面積，選擇檢測AFT具有最大靈敏度的λEx和λEm。

1.2.3 樣品提取與凈化

玉米粉碎，過0.85 mm孔徑篩，取20 g玉米粉入150 mL錐形瓶，加50 mL甲醇-水(80∶20)，150 r/min震蕩45 min，抽濾；方法1)：取4 mL濾液入10 mL離心管；方法2)：取7 mL濾液入50 mL離心管，加43 mL PBS緩沖溶液(pH 7.2)，稀釋液入IAC，10 mL蒸餾水沖洗IAC，再用1 mL甲醇洗脫IAC 2次，每次5 min。方法1)與方法2)中樣品溶液均在60 ℃下氮氣吹至近干，200 μL正己烷和100 μL三氟乙酸溶解剩余殘渣，立即蓋緊小瓶并渦旋混合15 s，40 ℃衍生化30 min后，60 ℃下氮氣吹至近干，1 mL水-乙腈(85∶15)重新溶解殘渣，渦旋混合15 s，過0.22 μm有機濾膜，濾液收集至1 mL進樣瓶中，4 ℃下保存直至HPLC分析。

1.2.4 玉米樣品中AFT的HPLC檢測方法

色譜柱：Agilent ZORBAX SB C18(150 mm×4.6 mm, 5 μm)；柱溫：35 ℃；λEx=360 nm，λEm=440 nm；流動相∶水-甲醇(65∶35)；流速：1 mL/min；進樣量：10 μL。

2 結果與討論

2.1 λEx和λEm對AFT檢測結果的影響

HPLC-FLD檢測AFT時，不同的λEx和λEm，會造成AFT的檢測靈敏度不同；另外，不同樣品，由于基質(zhì)差異，λEx和λEm也會對檢測結果造成影響。本研究分別選擇了不同λEx(360、365 nm)和不同λEm(440、450、460 nm)，分析不同波長下AFT的峰面積，確定最佳λEx和λEm。

由圖1看出，當λEx=360 nm，λEm=440 nm時，AFB1峰面積最大，靈敏度最高。λEx=365 nm，λEm=440 nm時，AFB1峰面積較λEx=360 nm和λEm=440 nm時低，且AFB2、AFG1、AFG2峰面積與λEx=360 nm和λEm=440 nm時峰面積接近；比較其他λEx和λEm，雖然有些λEx和λEm下，AFB2、AFG1、AFG2較大峰面積，但AFB1峰面積都較小，考慮到AFB1在玉米中污染最嚴重，且AFB1毒性最強，因此，首先選擇AFB1檢測靈敏度最好的條件，故選擇λEx=360 nm，λEm=440 nm作為檢測AFT的λEx和λEm。

圖1 不同λEx和λEm對AFT檢測結果的影響

2.2 流動相對AFT檢測結果的影響

流動相是影響樣品中待測目標物與雜質(zhì)分離的重要因素，本研究通過對已有研究文獻的總結，選取了7組能有效將目標物與雜質(zhì)分離開來的流動相，然后分析不同流動相條件下AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的峰面積，使選擇的流動相在將待測目標物與雜質(zhì)良好分離的同時，待測目標物具有較高的檢測靈敏度，另外，本研究也從節(jié)約試劑、減少儀器運作時間的角度考慮，選擇出更適合的流動相。

從圖2可以看出，流動相組成為65∶35∶0(水-甲醇-乙腈)時，AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的峰面積都要高于或等于其他流動相條件下的峰面積；另外，經(jīng)單因素方差分析(ANOVA)，流動相組成為65∶35∶0(水-甲醇-乙腈)時，AFT總的峰面積顯著高于其他流動相條件下的峰面積(P<0.05)。同時，AFT污染的玉米樣品的HPLC色譜圖表明(圖3)，該流動相組成能將待測目標物與雜質(zhì)良好分離，且該流動相具有檢測時間短、所需流動相成本低、溶劑毒性小等優(yōu)點。因此，選取的流動相為水-甲醇(65∶35)。

圖2 流動相對AFT檢測結果的影響

2.3 凈化方式對AFT檢測結果的影響

已有研究文獻表明，AFT污染的玉米樣品經(jīng)IAC凈化后，能將大多數(shù)干擾雜質(zhì)進行洗脫分離，但使用IAC也存在操作繁瑣，分析速度慢，檢測成本高，洗脫分離干擾雜質(zhì)的同時，容易造成目標物流失等缺點[18, 20]。因此，研究比較了AFT污染的玉米經(jīng)IAC凈化與未經(jīng)凈化的檢測結果，結果顯示在圖3中。

圖3c中顯示，與未經(jīng)凈化的樣品(圖3b)相比，經(jīng)IAC凈化的樣品(圖3c)很少有雜質(zhì)干擾AFT的檢測，然而，經(jīng)過凈化的樣品，未檢測到AFG1，這可能是由于IAC凈化過程中，AFG1與雜質(zhì)一起被洗脫；未經(jīng)凈化的樣品(圖3b)，雖有雜峰，且對檢測結果有一些干擾，但從表2和表3中的加標回收率及精密度試驗結果看，未過凈化柱的樣品加標回收率在81.7%～94.3%之間，日內(nèi)、日間精密度試驗中相對標準偏差(RSD)小于6.0%，因此，該提取檢測AFT的方法對實際樣品的測定影響很小。因此，本研究方法的樣品提取溶液不經(jīng)IAC凈化，直接HPLC-FLD測定樣品中的AFT含量。另外，從圖3b看出，該批玉米樣品中，未檢出AFG2。

注：a)AFB1、AFB2、AFG1、AFG2混標;b)未經(jīng)IAC凈化的AFT污染的玉米樣品；c)IAC凈化AFT污染的玉米樣品。

圖3 色譜圖

2.4 方法的線性范圍與檢出限

根據(jù)1.2.4中色譜條件，分別測定AFB1、AFB2、AFG1、AFG2的混標溶液，以HPLC-FLD測得的峰面積(mAU)為縱坐標(Y)，以進樣質(zhì)量(ng)為橫坐標(X)繪制標準曲線，根據(jù)3倍信噪比(S/N)的峰響應值，得出此方法的檢出限，結果如表1所示。

表1 AFT的線性范圍與檢出限

2.5 樣品加標回收率試驗和精密度

對未污染AFT的玉米進行不同水平的加標回收試驗，對加標量為10、20、40 μg/kg的樣品分別做3個平行，根據(jù)1.2.3中樣品未經(jīng)凈化方法制備樣品，按1.2.4條件檢測玉米中AFT含量，最后得到方法回收率，結果見表2；對加標量為20 μg/kg的樣品每天提取檢測3次，重復提取檢測3 d，方法精密度結果見表3。表2顯示，該方法在不同加標量下，加標回收率在81.7%～94.3%，標準偏差(SD)在3.6%～6.2%。表3顯示，方法日內(nèi)精密度在4.5%～5.1%，日間精密度在4.8%～5.5%。方法具有良好的回收率和日內(nèi)、日間精密度。

表2 樣品加標回收率試驗結果

表3 精密度試驗結果

3 結論

本研究考察了λEx和λEm，流動相組成對AFT檢測結果的影響，結果當λEx和λEm分別為360 nm和440 nm，流動相組成為水-甲醇(65∶35)時，AFT及污染AFT的玉米樣品經(jīng)HPLC-FLD分離檢測效果最好。該方法在測定AFT時，具有良好的線性范圍及檢出限，經(jīng)日內(nèi)、日間精密度及方法回收率考察，重現(xiàn)性和穩(wěn)定性良好。該方法操作簡便、快速準確，適合檢測大批量污染AFT的玉米樣品。

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Rapid Detection of Aflatoxins in Corns by High Performance Liquid Chromatography

Luo Xiaohu Wang Ren Wang Li Li Yongfu Shen Liyang Wang Yong Chen Zhengxing
(School of Food Science and Technology State Key Laboratory of Food Science and Technology National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122)

Aflatoxin (AFT), as seriously toxic and similarly structured secondary metabolites of fungi, has been proved to be prone to contaminating corns. The effects of excitation (λEx) and emission (λEm) wavelengths, mobile phase composition and immunoaffinity column(IAC) purification on AFT detection have been studied. AFT was separated and detected optimally at λEx=360 nm and λEm=440 nm with a mixture of water and methanol (65∶35) as mobile phase. Although the sample,unpurified by IAC,retained some interfering impurities, the method was still of desirable linear range (0.04～26 ng) and detection limit (0.1 μg/kg). The spike recovery, standard deviation, and within-and intra-day precisions of the method are 81.7%～94.3%, 3.6%～6.2%, 4.5%～5.1% and 4.8%～5.5% respectively. The method is suitable for the detection of mass AFT-contaminated corns with the advantages of being rapid, accurate, highly reproducible,stable and low cost.

HPLC, aflatoxins, corn, immunoaffinity column, determination

TS207

A

1003-0174(2014)06-0099-05

國家自然科學基金(31371874, 31171780035, 3110 1383, 31201381)，公益性行業(yè)科研專項(201203037, 201313005, 200903043-02)，國家科技支撐計劃(2012BAD34 B02)

2013-07-04

羅小虎，男，1983年出生，博士，糧食安全

陳正行，男，1960年出生，教授，博士生導師，糧食精深加工