戴一，宋祖榮，夏蓮鳳，朱建

(安徽新華學(xué)院藥學(xué)院，安徽 合肥，230088)

女貞子(Fructus ligustri Lucidi)是木犀科女貞屬植物女貞(Ligustrum lucidum Ait)的干燥成熟果實(shí)，資源豐富，在中國(guó)長(zhǎng)江流域及南方各地、河南、陜西、甘肅等地均有分布。女貞子主要含有萜類(lèi)［1-2］、黃酮［3］及多糖等成分。其中所含黃酮成分主要為芹菜素、木樨草素、芹菜素及其苷等，這些黃酮成分具有保護(hù)心血管、抗氧化、抗衰老、降血脂、抗腫瘤等作用［4-5］。女貞子為藥食兩用植物果實(shí)，具有滋補(bǔ)肝腎，烏須明目之功效［6］。民間用其泡酒，具體制法為取冬季成熟果實(shí)，洗凈，蒸煮曬干后取200 g，放入500 mL低度白酒中，加蓋密封，每天振搖1次，1周后開(kāi)始服用，每日1～2次，每次1小盅。因補(bǔ)益肝腎，抗衰祛斑多與氧化相關(guān)，而植物中黃酮成分常具有較強(qiáng)的抗氧化活性，且文獻(xiàn)未見(jiàn)有關(guān)女貞子酒抗氧化活性研究及抗氧化作用的相關(guān)黃酮含量的測(cè)定，同時(shí)也未見(jiàn)白酒酒精度對(duì)女貞子抗氧化物質(zhì)浸出率的研究報(bào)道，因此研究白酒酒精度對(duì)女貞子酒抗氧化活性的影響及相關(guān)黃酮成分含量測(cè)定對(duì)于科學(xué)飲用女貞子酒具有重要參考價(jià)值，也為女貞子的綜合利用提供參考。本實(shí)驗(yàn)將10%、20%、30%和40%四種不同酒精度的女貞子酒，濃縮干燥得提取物，采用DPPH法、水楊酸法和鄰苯三酚自氧化法研究水提取物對(duì)DPPH·、羥自由基(·OH)和超氧陰離子自由基(O2-·)的清除作用，并測(cè)定不同酒精度女貞子酒中抗氧化成分的浸出率，同時(shí)采用HPLC測(cè)定2種重要黃酮成分木犀草素和芹菜素的浸出率，為女貞子的進(jìn)一步研究與開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器

安捷倫1260高效液相色譜儀，安捷倫1260 MWD檢測(cè)器，安捷倫1260二元泵，美國(guó)安捷倫科技公司;UV-4802S型紫外可見(jiàn)分光光度儀，尤尼柯(上海)儀器有限公司;AB135-S電子分析天平，梅特勒-托利多國(guó)際股份有限公司;FA2004型電子天平，上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司;移液器，德國(guó)Eppendorf股份公司。

1.2 試藥女貞子藥材

女貞子，購(gòu)自于亳州藥材市場(chǎng)(由本校中藥鑒定教研室慶兆老師鑒定為女貞(Ligustrum lucidum Ait)的干燥成熟果實(shí));DPPH(批號(hào):132805)，(天津西瑪科技有限公司;芹菜素對(duì)照品，天津一方科技有限公司;木犀草素對(duì)照品，天津一方科技有限公司;甲醇為色譜純，乙醇、三氟乙酸、Al(NO3)3、NaNO2、水楊酸、FeSO4、雙氧水、NaOH、無(wú)水乙醇等試劑均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 女貞子酒抗氧化活性實(shí)驗(yàn)

采用DPPH法、水楊酸法和鄰苯三酚自氧化法來(lái)進(jìn)行抗氧化實(shí)驗(yàn)，并以樣品的濃度與其對(duì)應(yīng)的自由基清除率采用origin8.0作圖，從中讀取EC50［7-8］。

2.1.1 女貞子酒浸膏的制備

稱(chēng)取女貞子粉末40 g，用200 mL不同酒精度的白酒進(jìn)行浸提，每天振搖3 min，浸提1周后抽濾，濾液蒸干后40℃真空干燥48 h，稱(chēng)重計(jì)算得膏率后備用。精密稱(chēng)取女貞子酒提取物浸膏配制成高中低7個(gè)濃度溶液。

2.1.2 DPPH·的清除實(shí)驗(yàn)

精確稱(chēng)取5 mg DPPH，用甲醇溶解并定容于100 mL量瓶中，配制成0.05 mg/mL的DPPH溶液，于0～4℃避光保存，備用，將樣品原液精確地配制成系列濃度的溶液。分別取樣品溶液5 μL，加水至3.5 mL，加DPPH溶液2.5 mL均勻混合，于黑暗中放置30 min，在517 nm處測(cè)定其吸光度值A(chǔ)i;同時(shí)測(cè)定3.5 mL水加2.5 mL DPPH溶液的吸光度A0;樣品溶液5 μL，加水至3.5 mL，加2.5 mL甲醇的吸光度 Aj;以2.5 mL甲醇加3.5 mL水做空白對(duì)照進(jìn)行測(cè)定。

2.1.3 ·OH的清除實(shí)驗(yàn)

在試管中加入不同濃度的樣品溶液0.1 mL，6 mmol/L水楊酸-乙醇 0.5 mL，6 mmol/L FeSO4溶液0.5 mL，最后加入0.5 mL 0.1%H2O2，總體積5 mL，以雙蒸水補(bǔ)足體積。其中對(duì)照管不加樣液，樣底管不加H2O2，搖勻后啟動(dòng)反應(yīng)，37℃ 水浴反應(yīng)30 min，以蒸餾水作參比，在510 nm下測(cè)定各樣品溶液的吸光度。計(jì)算·OH的清除率。

A樣品為加入女貞子酒提物溶液后的羥自由基體系的吸光度值;A對(duì)照為不加女貞子酒提物溶液的羥自由基體系的吸光度值;A樣底為羥自由基體系中不加H2O2而加女貞子酒提物溶液的吸光度值。

2.1.4 O2-·的清除實(shí)驗(yàn)

取0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.2)4.5 mL于試管中，分別加入1 mL不同濃度的樣品溶液，于25℃水浴中預(yù)熱20 min，再加5 mmol/L鄰苯三酚溶液(或10 mmol/L HCl溶液)0.4 mL，搖勻后25℃水浴中準(zhǔn)確反應(yīng)5 min，后迅速加入1 mL 8 mol/L HCl終止反應(yīng)，在波長(zhǎng)420 nm處測(cè)吸光度Ai或Aj;同時(shí)測(cè)定不加樣品溶液的反應(yīng)體系獲得Ao;測(cè)定以4.5 mL 0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.2)、1.4 mL水及1 mL 8 mol/L HCl混合液為空白對(duì)照，計(jì)算清除率。

2.2 女貞子酒中總黃酮測(cè)定

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密稱(chēng)取在120℃干燥至恒重的蘆丁對(duì)照品10.1 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得(1 mL含蘆丁0.404 mg)。精密量取對(duì)照品溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL，分別置25 mL 量瓶中，各加水至6 mL，加5%NaNO2溶液1 mL，使混勻，放置6 min，加10%Al(NO3)3溶液1mL，搖勻，放置6 min，加NaOH試液10 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min，以甲醇溶液為空白對(duì)照在500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度。以質(zhì)量濃度(C)對(duì)吸光度值(A)作回歸統(tǒng)計(jì)分析［9］。

2.2.2 供試品溶液制備

精密稱(chēng)取女貞子粉末5.00 g，4份，分別加10%、20%、30%和40%乙醇定容到25 mL容量品中，每天振搖3 min，浸提7天，微孔濾膜過(guò)濾，濾液用于總黃酮測(cè)定及HPLC分析。

2.2.3 總黃酮測(cè)定

取供試品溶液0.1 mL置25 mL容量瓶中，加蒸餾水至6 mL，加5%NaNO2溶液1 mL，使混勻，放置6 min，加 10%Al(NO3)3溶液 1 mL，搖勻，放置 6 min，加濃度為4.0%的NaOH試液10 mL，蒸餾水定容至25 mL，搖勻，放置15 min，在500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度。根據(jù)回歸方程計(jì)算女貞子酒中總黃酮浸出率。總黃酮浸出率即女貞子酒中每1 g藥材總黃酮浸出的量(mg)。

2.3 木犀草素、芹菜素HPLC含量測(cè)定

2.3.1 HPLC分析條件

色譜柱:Agilent HC-Cl8柱(250 mm×4.6 mm，5 μm);流動(dòng)相:甲醇 -0.2%三氟乙酸(53∶47，v/v);流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)350 nm;柱溫25℃;進(jìn)樣量 20 μL［10］。

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱(chēng)取木犀草素和芹菜素各5.00 mg分別置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容，并從中取1 mL定容至10 mL，制成木犀草素和芹菜素濃度均為0.05 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.3.3 方法學(xué)考察

2.3.3.1 線性關(guān)系考察

精密吸取木犀草素和芹菜素混合對(duì)照品溶液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL 加甲醇定容至 10 mL，搖勻。精密吸取混合對(duì)照品溶液20 μL按2.3.1中的色譜條件進(jìn)行分析，測(cè)定色譜峰峰面積，分別以色譜峰面積(A)對(duì)質(zhì)量濃度(C)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3.3.2 精密度實(shí)驗(yàn)

取同一質(zhì)量濃度的木犀草素和芹菜素混合對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣20 μL，計(jì)算峰面積的RSD。

2.3.4.3 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

精密稱(chēng)取同一女貞子粉末樣品5.0 g，6份，按2.2.2項(xiàng)下方法操作，制備供試品溶液，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定各樣品的峰面積，計(jì)算木犀草素和芹菜素浸出率的RSD值。

2.3.3.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一供試品溶液，分別于 0、2、4、8、12 h 按2.3.1項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣分析，計(jì)算木犀草素和芹菜素浸出率的RSD。

2.3.3.5 回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱(chēng)取9份已測(cè)定木犀草素和芹菜素含量的藥材5.0 g，按所含兩黃酮量的80%、100%和120%比分別加入對(duì)照品，每個(gè)加樣比做3次實(shí)驗(yàn)，取制成供試品溶液稀釋1倍后進(jìn)行分析，計(jì)算木犀草素、芹菜素的平均回收率。

2.3.4 樣品測(cè)定

取女貞子酒供試品溶液，按2.3.1項(xiàng)下色譜條件下分析，測(cè)定峰面積，計(jì)算女貞子酒中木犀草素及芹菜素浸出率。浸出率即女貞子酒中每1 g藥材木犀草素或芹菜素浸出的量(μg)。

3 結(jié)果與分析

3.1 女貞子酒浸膏得率研究

通過(guò)平行3次實(shí)驗(yàn)，研究不同酒精度白酒對(duì)女貞子提取率的影響，得不同酒精度下女貞子浸膏得率，結(jié)果見(jiàn)表1?？梢?jiàn)隨著酒精度的增加，浸膏得率呈逐漸升高趨勢(shì)，40%乙醇浸泡得膏率最高，為20.35%。

表1 女貞子酒提取得膏率Table 1 Yield of the total extract from Nvzhenzi wine

3.2 女貞子酒抗氧化活性實(shí)驗(yàn)

3.2.1 DPPH·的清除實(shí)驗(yàn)

通過(guò)對(duì)7個(gè)不同濃度的女貞子酒提取物溶液進(jìn)行DPPH·的清除實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)隨著酒精度的增加，女貞子酒提取物清除率逐漸升高，尤其在前3個(gè)濃度點(diǎn)，清除率隨濃度變化急劇增大，清除率約達(dá)到70%后，隨濃度的增加而較為緩慢，其EC50值的大小順序?yàn)?0%酒精度女貞子酒(EC50為12.75 mg/mL)＜30%酒精度女貞子酒(EC50為14.60 mg/mL)﹤20%酒精度女貞子酒(EC50為14.71 mg/mL)﹤10%酒精度女貞子酒(EC50為15.96 mg/mL)?？梢?jiàn)40%酒精度女貞子酒DPPH·的清除活性最強(qiáng)，見(jiàn)圖1。

圖1 不同濃度女貞子酒提取物對(duì)DPPH·清除作用Fig.1 Scavenging activity of different concentrations of Nvzhenzi wine extract on DPPH·free radical

3.2.2 ·OH的清除實(shí)驗(yàn)

通過(guò)對(duì)7個(gè)不同濃度的女貞子酒提取溶液進(jìn)行·OH的清除實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)不同酒精度女貞子酒提取物在50～200 mg/mL范圍內(nèi)清除率逐步增加，30%酒精提取物的清除率與濃度成較好的線性關(guān)系，清除率較高的為40%及30%酒精提取物，其EC50值的大小順序?yàn)?0%酒精度女貞子酒(EC50為62.86 mg/mL)﹤30%酒精度女貞子酒(EC50為96.81 mg/mL)﹤20%酒精度女貞子酒(EC50為114.04 mg/mL)﹤10%酒精度女貞子酒(EC50為122.41 mg/mL)?？梢?jiàn)40%酒精度女貞子酒·OH的清除活性最強(qiáng)，見(jiàn)圖2。

3.2.3 O2-·的清除實(shí)驗(yàn)

通過(guò)對(duì)7個(gè)不同濃度的女貞子酒提取溶液進(jìn)行O2-·的清除實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)不同酒精度女貞子酒提取物均隨著濃度的增加，清除率也是逐漸升高，尤其在前5個(gè)濃度點(diǎn)，清除率隨濃度變化急劇增大，其EC50值的大小順序?yàn)?0%酒精度女貞子酒(EC50為15.93 mg/mL)﹤20%酒精度女貞子酒(EC50為20.75 mg/mL)﹤30%酒精度女貞子酒(EC50為21.76mg/mL)﹤10%酒精度女貞子酒(EC50為28.04 mg/mL)。可見(jiàn)40%酒精度女貞子酒O2-·的清除活性最強(qiáng)，見(jiàn)圖3。

圖2 不同濃度女貞子酒提取物對(duì)·OH清除作用的影響Fig.2 Scavenging activity of different concentrations of Nvzhenzi wine extract on·OH free radical

圖3 不同濃度女貞子酒提取物對(duì)O2-·清除作用Fig.3 Scavenging activity of different concentrations of Nvzhenzi wine extract on O2-·free radical

3.3 女貞子酒中總黃酮測(cè)定

3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

對(duì)6個(gè)不同濃度點(diǎn)的蘆丁對(duì)照品進(jìn)行鋁鹽法顯色后500 nm測(cè)定吸光度。以質(zhì)量濃度(C)對(duì)吸光度值(A)作回歸統(tǒng)計(jì)分析?；貧w方程為:Y=13.771X-0.050 4(R2=0.999 4)，表明蘆丁在0.016 2～0.097 0 mg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.2.2 總黃酮測(cè)定

對(duì)4個(gè)梯度酒精度女貞子酒進(jìn)行總黃酮測(cè)定。根據(jù)回歸方程計(jì)算女貞子酒中總黃酮浸出率結(jié)果見(jiàn)表2，可見(jiàn)隨著酒精度的提高，女貞子酒中的總黃酮浸出率亦呈增高趨勢(shì)，黃酮成分多具有較多的酚羥基，具有抗氧化活性，與前述抗氧化活性的順序吻合。

3.3 女貞子酒中木犀草素和芹菜素浸出量測(cè)定

3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

對(duì)5個(gè)不同濃度點(diǎn)的木犀草素和芹菜素混合對(duì)照品溶液進(jìn)樣分析后，以濃度(C)對(duì)峰面積(A)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得木犀草素和芹菜素回歸方程分別為A=74.919C-29.98，R2=0.999 8;A=80.208C-36.41，R2=0.999 6，二者分別在3.35 ～16.75 μg/mL和2.45～12.25 μg/mL質(zhì)量濃度范圍呈良好的線性關(guān)系。色譜圖見(jiàn)圖4。

表2 女貞子酒中總黃酮浸出率Table 2 The extraction rates of total flavonoids in Nvzhenzi wine

圖4 木犀草素和芹菜素混合對(duì)照品HPLC色譜圖Fig.4 HPLC chromatograms of standard

3.3.2 精密度實(shí)驗(yàn)、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

同一質(zhì)量濃度的木犀草素和芹菜素混合對(duì)照品溶液進(jìn)樣6次分析后，木犀草素和芹菜素峰面積RSD分別為1.03%和1.41%，表明精密度良好，見(jiàn)表3。對(duì)6份制備的女貞子酒供試液測(cè)定后，木犀草素和芹菜素浸出率的RSD值分別為1.41% 和1.47%，表明具有較好重現(xiàn)性，見(jiàn)表4。對(duì)于0、2、4、6、8、10 h 后進(jìn)樣分析的同一供試液，木犀草素和芹菜素峰面積的RSD分別為0.94%和0.99%，表明供試品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定，見(jiàn)表5。

表3 精密度實(shí)驗(yàn)Table 3 Precision experiments

表4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)Table 4 Pepeatability experiments

3.3.3 回收率實(shí)驗(yàn)

9份藥材經(jīng)加樣制備供試液進(jìn)行HPLC分析，其結(jié)果見(jiàn)表6、表7。木犀草素和芹菜素的回收率分別在97.88% ～98.33%和97.88% ～99.40%之間，RSD值均小于1.5%。

表5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)Table 5 Stability experiments

表6 木犀草素回收率實(shí)驗(yàn)Table 6 Method recevery of luteolin

3.3.4 女貞子酒中木犀草素和芹菜素浸出量測(cè)定

對(duì)3份女貞子酒提取物進(jìn)行HPLC分析，供試液色譜圖為圖5，由圖可見(jiàn)隨著女貞子酒精度的降低，木犀草素和芹菜素浸出量明顯下降，當(dāng)酒精度為10%時(shí)2種成分幾乎無(wú)峰出現(xiàn)，可見(jiàn)酒精度的高低影響著女貞子酒中黃酮成分含量。

表7 芹菜素回收率實(shí)驗(yàn)Table 7 Method recevery of apigenin

圖5 女貞子酒提取物HPLC色譜圖Fig.5 HPLC chromatograms of Nvzhenzi wine extract

具體結(jié)果見(jiàn)表7，隨著酒精度的升高女貞子酒中木犀草素和芹菜素的進(jìn)出量明顯升高，表明女貞子酒中含有較豐富的木犀草素和芹菜素，并可能與其相應(yīng)的抗氧活性升高有關(guān)。

表7 女貞子酒中木犀草素和芹菜素的浸出率Table 7 The extraction rates of luteolin and apigenin in Nvzhenzi wine

4 結(jié)論

氧化損傷與多種疾病如衰老、癌癥及心血管疾病等相關(guān)［11］，女貞子酒具有較高的保健價(jià)值，通過(guò)DPPH法、水楊酸法和鄰苯三酚自氧化法研究發(fā)現(xiàn)女貞子酒提取物對(duì)DPPH·、·OH和O2-·有明顯的清除作用，且隨著女貞子酒精度的增高，其提取物對(duì)3種自由基的清除作用明顯增強(qiáng)，同時(shí)女貞子酒中總黃酮及木犀草素和槲皮素的浸出率也表現(xiàn)出和相同的趨勢(shì)即隨著酒精度的升高而升高，說(shuō)明女貞子酒的抗氧化活性可能與其所含黃酮成分密切相關(guān)。40%酒精度女貞子酒提取物表現(xiàn)出最強(qiáng)的自由基清除活性，對(duì)DPPH·、·OH和O2-·的EC50值分別為12.75、62.86和15.93 mg/mL，此時(shí)女貞子酒中總黃酮、木犀草素和芹菜素的浸出率分別為21.96 mg/g、40.07 μg/g和28.99 μg/g，可見(jiàn)女貞子酒的浸泡，應(yīng)選擇較高的酒精度，也為其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)提供了依據(jù)。

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