宋雙雙，劉峰，劉偉，王曉，Dan Staerk，李圣波，崔莉

1(山東省分析測試中心，山東 濟(jì)南，250014)2(山東農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東泰安，271018)

3(山東亞特生態(tài)技術(shù)有限公司，山東臨沂，276017)

日本木瓜［Chaenomeles japonica(Thunb.)Lindl］是薔薇科(Rosaceae)木瓜屬植物，又名倭海棠，原產(chǎn)于日本，中國江蘇、浙江、臺灣、陜西庭院習(xí)見栽培［1-2］，其果實(shí)為藥材的習(xí)用品［3］，具有化濕和胃，舒筋活絡(luò)的功效［4］。皺皮木瓜又名湯木瓜、宣木瓜等，是薔薇科貼梗海棠［Chaenomeles spiciosa(Sweet)Nakai］的近成熟果實(shí)，主要產(chǎn)于安徽、浙江、湖北、四川等地［5］，功效同日本木瓜［6］。目前對于日本木瓜的研究較少，僅有化學(xué)成分的研究［3］，關(guān)于其果實(shí)內(nèi)的氧化、抗氧化酶類的相關(guān)研究鮮見報(bào)道。皺皮木瓜中抗氧化酶類的相關(guān)報(bào)道主要有SOD的分離純化［7］，氧化酶類有多酚氧化酶(PPO)的性質(zhì)研究［8］等。對于木瓜中的過氧化物酶(POD)，僅見番木瓜中POD的純化及性質(zhì)研究［9］，關(guān)于日本木瓜和皺皮木瓜中POD的酶學(xué)特性的研究均未見報(bào)道。

POD廣泛存在于動(dòng)植物和微生物體內(nèi)，是一種以血紅素為輔基的氧化酶［10］，可催化由過氧化氫參與氧化各種還原劑［11］的反應(yīng)，是果實(shí)成熟和衰老的生理指標(biāo)，參與果實(shí)酶促褐變，對果實(shí)的色澤及成分含量等造成不良影響。目前，對果蔬POD的純化及酶學(xué)性質(zhì)研究較廣泛，但是對于大部分原料，其不同品種間的POD酶學(xué)性質(zhì)的比較研究還較少。本文通過比較日本木瓜和皺皮木瓜中POD的酶學(xué)性質(zhì)，為進(jìn)一步深入研究兩者POD的結(jié)構(gòu)差異，為提高木瓜加工產(chǎn)品的品質(zhì)等提供理論基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

1.1 材料

木瓜果實(shí)由山東亞特生態(tài)技術(shù)有限公司提供，選擇大小均一、完整無機(jī)械傷、無病蟲害的果實(shí)，-20℃貯藏。編號A為YATS 115(皺皮木瓜)，編號B為西府海棠(日本木瓜)。

1.2 試劑

Tris、愈創(chuàng)木酚、聚乙烯吡咯烷酮、Triton X-100、檸檬酸鈉、Na2HPO4、NaH2PO4、MgCl2·6H2O、ZnSO4·7H2O、MnCl2·4H2O、Na2SO3、DTT、曲酸、谷胱甘肽(還原型)、吐溫 -80、SDS、偏重亞硫酸鈉、EDTA-2Na、環(huán)庚三烯酚酮(tropolone)，所用試劑均為分析純。

1.3 儀器

GENESYS 10S UV-VIS紫外可見分光光度計(jì)，Thermo;HH-S2數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市醫(yī)療儀器廠;Thermo Multifuge X1R離心機(jī)，Thermo;人工氣候箱，寧波萊福科技有限公司;BAS124S萬分之一天平，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 POD粗酶液的提取

A、B 各取 10 g，以 1∶1.5(g∶mL)料液比加入Tris-Hcl緩沖液(20 mmol/L，pH 7.5)，加 0.1%(w/v)聚乙烯吡咯烷酮和0.3%(v/v)Triton X-100，低溫下研磨，研磨液4℃于10 000 r/min離心20 min，上清液即為所需粗酶液，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 POD活性的測定

測定溶液體系為3 mL，20 mmol/L Tris-HCl緩沖液pH 7.5，其中2.95 mL底物含有10 mmol/L愈創(chuàng)木酚和10 mmol/L H2O2，0.05 mL酶液。于25℃反應(yīng)20 min，在470 nm處測定吸光度變化值。以每分鐘每毫升反應(yīng)體系OD值改變0.01為1個(gè)酶活力單位(U)［12］。

2.3 POD酶學(xué)性質(zhì)的測定

2.3.1 最適溫度和溫度穩(wěn)定性

將反應(yīng)底物分別置于 4、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55 ℃ 的水浴鍋中保溫 5 min，加入木瓜的粗酶液，測定吸光度。以最適溫度的酶活性為100%，其余溫度下測定的酶活性與之的比值即為相對酶活性［13］。

不同品種木瓜的粗酶液分別保存于10、20、30、40℃ 條件下，待 20、40、60 min取出并測定酶活性［14］。以每個(gè)溫度下的初始酶活性為100%，不同時(shí)間測定的酶活性與之相比即為相對酶活性。

2.3.2 最適pH值和pH值穩(wěn)定性

測定不同品種木瓜的粗酶液在不同pH值(3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9)的緩沖液中的酶活性［15］。以最適條件下的酶活性為100%，其余pH值條件下測定的酶活性與之的比值即為相對酶活性。

將木瓜的粗酶液分別在不同pH值的緩沖液(3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9)中 4 ℃ 保存6 h，測定酶活性。以最適條件下的酶活性為100%。

2.3.3 金屬離子的影響

分別配制終濃度為含有1、5、10 mmol/L金屬離子的底物溶液，加入POD酶液，測定酶活力，以不含金屬離子時(shí)的酶活力為100%，分析不同的金屬離子對POD酶活性的影響。

2.3.4 POD米氏常數(shù)的測定

在25℃的條件下，分別改變底物愈創(chuàng)木酚和H2O2的濃度，考察底物濃度對木瓜POD催化速度的影響，采用雙倒數(shù)作圖法(Lineweaver-Burk 法)［16］，分別求出木瓜POD對于愈創(chuàng)木酚和H2O2的米氏常數(shù)Km值。

2.3.5 抑制劑和表面活性劑的影響

將各種抑制劑及表面活性劑與底物混合成終濃度分別為1、5、10 mmol/L的溶液，加入酶液，測定吸光度變化。以不含抑制劑及表面活性劑時(shí)的酶活性為100%。

2.4 數(shù)據(jù)分析

采用DPS軟件和Excel 2003對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 POD最適溫度

POD活性受溫度的影響很大，在最適溫度范圍內(nèi)，POD活性可以達(dá)到最大。由圖1可以看出，溫度對品種A、B的影響呈現(xiàn)完全不同的趨勢。當(dāng)反應(yīng)溫度低于30℃時(shí)，B的酶活性隨著溫度的升高而增大;超過30℃時(shí)，隨著溫度的升高酶活性下降直至失活。當(dāng)反應(yīng)溫度超過20℃，品種A的酶活性隨著溫度的升高而下降。

圖1 不同品種木瓜POD的最適溫度Fig.1 The optimum temperature of Chaenomeles peroxidase

3.2 POD的溫度穩(wěn)定性

POD在一定的溫度范圍內(nèi)可以長時(shí)間地保持活性。由圖2可知，日本木瓜和皺皮木瓜在30℃以內(nèi)都能較好地保持活性。不同來源的POD耐熱性不同，水果和蔬菜中的 POD是一種較耐熱的酶類［17-18］。Ekrem和HU在各自的文章中提到甘瓠和萵苣莖中的POD的熱耐受性都很好，能在60℃保持一定的活性［14，19］，劉金磊和趙巖分別對苦瓜和洋蔥的POD進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)兩者的POD也都對溫度具有較高的穩(wěn)定性及耐受性［20，21］，但本文中的 2 種木瓜的POD對溫度的耐受性比較弱，與目前報(bào)道的大多數(shù)POD的熱穩(wěn)定性不同，其中，日本木瓜對熱的耐受性強(qiáng)于皺皮木瓜，日本木瓜B在50℃條件下保存20 min會(huì)失活，這與菜花中POD的熱穩(wěn)定性相似［17］。

圖2 不同品種木瓜POD的溫度穩(wěn)定性Fig.2 Temperature stability of Chaenomeles peroxidase

3.3 最適pH值

從圖3中可以看出，2個(gè)品種的POD活性均隨著pH值的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，兩者都具有兩個(gè)最適pH值，其中，日本木瓜B的兩個(gè)最適pH值差別不是很明顯，在pH值為5～6時(shí)，都具有較高的活性。

圖3 不同品種木瓜POD的最適pH值Fig.3 The optimum pH of Chaenomeles peroxidase

3.4 pH值穩(wěn)定性

由圖4可以看出，皺皮木瓜和日本木瓜中POD的pH值穩(wěn)定性差別很大，其隨pH值變化的趨勢也不同。A的POD在pH值5.5～8.5時(shí)穩(wěn)定性較好，一直能保持80%以上的活性，在酸性條件下保存相對不穩(wěn)定。而日本木瓜B的POD在酸性條件下比較穩(wěn)定，在4～5.5活性迅速從85%以上降低至50%。

圖4 不同品種木瓜POD的pH值穩(wěn)定性Fig.4 pH stability of Chaenomeles peroxidase

3.5 金屬離子的影響

金屬離子可以在一定程度上影響POD的活性，表1所示的金屬離子中，只有Ca2+可促進(jìn)POD活性，其余的金屬離子都對POD的活性起不同程度的抑制作用。其中，Ca2+對皺皮木瓜A中POD的活性的促進(jìn)作用顯著高于B，而Yihong Hu在對萵苣莖中POD的酶學(xué)性質(zhì)研究中提到Ca2+對POD起抑制作用，可以抑制60%左右的酶活性［14］，可見不同來源的POD可能結(jié)構(gòu)存在較大差異，導(dǎo)致金屬離子對其有完全相反的作用。Zn2+在低濃度時(shí)對A和B的抑制作用相同，在10mmol/L時(shí)，對 A、B的作用相反，Mn2+的抑制作用比較明顯，10 mmol/L Mn2+抑制 A、B幾乎50%的POD酶活，Mn2+對A中POD的抑制能力隨著濃度的增大而增強(qiáng)，但對B中POD的抑制能力與濃度并不存在線性相關(guān)性。其他3種金屬離子對A和B的抑制效果沒有顯著差異。

表1 不同金屬離子對POD活性的影響Table 1 Influence of metalions on Chaenomeles peroxidase activity

續(xù)表1

3.6 米氏常數(shù)的測定

分別以1/［S］為橫坐標(biāo)，1/V為縱坐標(biāo)，采用雙倒數(shù)作圖法，得線性方程，如圖6所示，2種木瓜中POD催化愈創(chuàng)木酚和H2O2的酶促褐變反應(yīng)均符合米氏方程，進(jìn)而求得2種木瓜的POD的Km值。Km值的大小可近似地表示酶與底物的親和力，Km值越大表示酶與底物的親和力越小，反之，則表示親和力越大［16］?？梢?，皺皮木瓜A中的POD與愈創(chuàng)木酚的結(jié)合能力強(qiáng)于日本木瓜。

圖5

3.7 抑制劑和表面活性劑的影響

抑制劑和表面活性劑具有還原性，可以抑制POD催化氧化愈創(chuàng)木酚。不同的化合物或不同濃度的同種化合物對不同品種木瓜POD活性的影響差別很大。如表2所示，1 mmol/L的抗壞血酸、檸檬酸、谷胱甘肽(還原型)、Na2S2O5及高濃度的EDTA-2Na對品種B的POD活性都起促進(jìn)作用，實(shí)驗(yàn)中的所有化合物均對A的POD活性有抑制作用，且抑制能力隨著濃度的增大而增強(qiáng)，其中，檸檬酸、吐溫-80對A的抑制作用顯著強(qiáng)于B。

圖6 POD酶促反應(yīng)雙倒數(shù)作圖Fig.6 Lineweaver-Burk plot of Chaenomeles peroxidase

SDS對2種木瓜中POD活性的抑制作用最強(qiáng)，在低濃度(1 mmol/L)時(shí)即可完全抑制POD活性，多項(xiàng)有關(guān)酶活動(dòng)力學(xué)的研究［22-23］均表明SDS對辣根、葡萄等多種來源的POD活性有很強(qiáng)的促進(jìn)失活作用，本研究在木瓜中也得到同樣的結(jié)果，SDS是一種變性劑，能夠破壞蛋白質(zhì)分子中的疏水鍵和氫鍵，進(jìn)而改變酶的空間構(gòu)象，導(dǎo)致酶活性降低［12］，可見表面活性劑SDS是過氧化物酶類重要的鈍化劑。由表2可以看出，大部分抑制劑和表面活性劑對品種B的POD的抑制能力都弱于品種A，可見抑制劑和表面活性劑對日本木瓜的抑制能力低于皺皮木瓜。

表2 抑制劑和表面活性劑對POD活性的影響Table 2 Influence of inhibition dose and surfactant on peroxidase activity

續(xù)表2

4 結(jié)論與討論

皺皮木瓜和日本木瓜的POD的最適溫度分別為15℃、30℃，二者都在30℃以內(nèi)能較好地保持活性。兩種POD都有兩個(gè)最適pH值，日本木瓜的兩個(gè)最適pH值差別不明顯;皺皮木瓜的POD的pH值穩(wěn)定性范圍為5.5～8.5，日本木瓜的POD在酸性條件下比較穩(wěn)定。金屬離子對B兩種木瓜的影響基本相同，Ca2+對兩種POD活性都有促進(jìn)作用，對兩種POD抑制能力最強(qiáng)的化合物是SDS，其次為抗壞血酸。

日本木瓜和皺皮木瓜的POD都含有兩個(gè)最適pH值，可能與POD酶的空間構(gòu)象有關(guān)，或者可能存在兩種同工酶，具體原因有待于日后深入研究。本研究中兩種木瓜的POD對溫度的耐受性都比較弱，僅在30℃以內(nèi)能較好的保持活性，因此，這兩個(gè)品種的木瓜的POD要在低溫下保存，這兩種木瓜POD的熱穩(wěn)定性比目前報(bào)道的大多數(shù)果蔬中POD差，可能是因?yàn)樵蟻碓丛斐傻?，目前使用等電聚焦技術(shù)研究已證明不同POD同功酶的耐熱性存在差異［17］，含有不同的同工酶也可能是一個(gè)原因，有待進(jìn)一步研究驗(yàn)證。Ca2+對兩個(gè)POD活性都起促進(jìn)作用，在加工生產(chǎn)中應(yīng)避免木瓜產(chǎn)品與Ca2+接觸。抑制劑和表面活性劑對兩個(gè)品種的POD的作用規(guī)律基本相同，還原性強(qiáng)的化合物對POD都有很強(qiáng)的抑制作用，其他表面活性劑對POD的活性也有很強(qiáng)的抑制作用，可以應(yīng)用于加工生產(chǎn)過程中。

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